肺炎支原體肺炎患兒外周血miR-29c、miR-146a與炎癥因子的相關性研究

孫玉軍，馬敬斌，馬海鳳

(聊城市第二人民醫院兒科，山東 聊城 252600)

肺炎支原體肺炎(mycoplasma pneumoniae pneumonia，MPP)是兒童肺炎常見類型，在兒童社區獲得性肺炎中占比約10%～30%。MPP可進一步發展為重癥MPP，出現肺膿腫、肺不張等肺內并發癥，或累及神經、心血管、消化等肺外系統，危及患兒健康與生命[1]。然而，MPP前期癥狀缺乏特異性，臨床常規病情評估體系可能存在一定的滯后性，從而影響患兒的及時治療[2]。因此，探尋MPP的早期客觀指標以輔助臨床評估，對及時干預治療、改善預后至關重要。近年來，微小RNA(microRNA，miRNA)逐漸被證實參與許多生物學過程[3]。相關研究表明微小RNA-29c(microRNA-29c，miR-29c)、微小RNA-146a(microRNA-146a，miR-146a)與哮喘、病毒性肺炎等兒童呼吸系統疾病的發生發展有關[4-5]；動物實驗研究也表明miR-146a可調節炎癥因子參與MPP發展[6]。鑒于炎癥反應是目前公認的MPP重要發病機制，既往研究也證實炎癥因子與MPP兒童密切相關但受到多因素影響[7]，故本研究結合miR-29c、miR-146a與炎癥因子相關性的分析，探討二者與MPP的關系，旨在為臨床防治提供依據。

1資料與方法

1.1研究對象

本研究為前瞻性研究，選取2018年5月至2020年10月于本院診治的96例MPP患兒為MPP組對象，納入標準：①MPP診斷符合《諸福棠實用兒科學(第8版)》中標準[8]；②患兒年齡3～12歲；③MPP急性期入院；④患兒家屬知情同意。排除標準：①入院7d內出現其他細菌或病毒感染；②伴其他呼吸系統疾病(哮喘、肺結核等)；③免疫、血液系統疾病及皮膚病、全身過敏性疾病患兒；④近3個月有免疫抑制劑、糖皮質激素、抗凝藥物應用史；⑤心、肝、腎、肺等器質性疾病及結締組織病患兒。另選取同期住院且明確診斷為細菌性肺炎的69例患兒為細菌性肺炎組；同期于本院體檢健康的87例兒童作為健康對照組(年齡3～12歲，排除近6個月有感染疾病史者及血液、免疫相關疾病兒童)。本研究符合《赫爾辛基宣言》要求，獲得院醫學倫理委員會批準，研究對象的家屬均知情同意。

1.2研究方法

1.2.1外周血miR-29c、miR-146a水平檢測

急性期MPP、細菌性肺炎患兒入院后12h內采集靜脈血3mL(采血前均未使用抗生素、免疫抑制劑、糖皮質激素治療)，健康兒童于體檢當天采血3mL，EDTA-K2抗凝，淋巴細胞分離液分離后加入TRIZOL-80℃存留備測。采用實時定量聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)法測定外周血miR-29c、miR-146a相對表達量水平：①提取總RNA，測定RNA含量，反轉錄合成miR-29c cDNA、miR-146a cDNA，試劑供自日本TAKARA公司。②采用7500 FAST型實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司)對miR-146a、miR-29c、U6(內參)實施擴增。反應體系：SYBR Green Mix=10μL，上游引物=0.5μL，下游引物=0.5μL，cDNA=1μL，Distillation-Distillation H2O=8μL，總體積=20μL。擴增引物序列：miR-29c上游引物序列為GGGTAGCACCATTTGAAA，下游序列為GGGCAATTGCACTGGATAC；miR-146a上游引物序列為CTGGACTGCAAGGAGGGGTC，下游序列為GCAGACTGAAAAAGTTCTT；U6上游引物序列為ATTGGAACGATACAGAGAAGATT，下游序列為GGA ACGCTTCACGAATTTG。擴增反應條件：95℃預變性1min，95℃變性30s，64℃退火30s，72℃延伸15s，共40個循環。各反應重復3次，以U6為內參，通過2-△△Ct計算外周血miR-29c、miR-146a相對表達量。

1.2.2炎癥因子水平檢測

采集研究對象入院后12h內(急性期MPP、細菌性肺炎兒童為入院治療前，健康對照組兒童采血時間為體檢當日)靜脈血3mL，采血1次，離心10 min(3 000 r/min)取上清液，通過酶聯免疫吸附試驗測定血清白介素-17(interleukin-17，IL-17)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素-1β(interleukin-1beta，IL-1β)水平，試劑供自武漢博士德生物工程有限公司，所有操作嚴格按步驟遵循試劑盒說明完成。

1.2.3 MPP病情判定

依據《諸福棠實用兒科學(第8版)》中標準[8]，確診MPP患兒如出現以下“①、②、③”中任2條和(或)“④、⑤”中任1條則判定為重癥MPP：①接受規范大環內酯類藥治療>7d仍無效，或發熱持續>10d；②心動過速或氣促明顯(1～5歲和>5歲患兒心率分別為≥140次/min、≥120次/min；呼吸頻率分別為≥40次/min、≥30次/min)，可伴發紺、鼻扇、血壓降低(收縮壓≤75 mmHg)等；③胸部影像提示大片狀致密影，占據≥1個肺葉/肺段，可累及單葉/多葉病變；④存在肺膿腫、肺不張等肺內合并癥；⑤發生嚴重的低氧血癥(氧分壓<60 mmHg)，或出現心力衰竭、微循環紊亂、中樞神經系統感染等肺外并發癥。根據是否發生重癥MPP將96例MPP患兒分為重癥組(n=45)和輕癥組(n=51)。

1.3觀察指標

觀察各組兒童外周血miR-29c、miR-146a水平及IL-17、TNF-α、IL-1β水平；分析miR-29c、miR-146a與炎癥因子相關性；比較MPP不同病情組患兒的miR-29c、miR-146a水平。

1.4統計學分析

2結果

2.1三組兒童基線資料的比較

三組兒童性別、年齡、年齡組、體質指數等基線資料間的差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性，見表1。

表1 三組兒童基線資料的比較

2.2三組兒童外周血miR-29c、miR-146a及炎癥因子水平比較

三組兒童外周血miR-29c、miR-146a水平的差異均有統計學意義(F值分別是117.929、87.687，P<0.05)，MPP組<細菌性肺炎組<健康對照組。三組兒童炎癥因子IL-17、TNF-α、IL-1β水平的差異均有統計學意義(F值分別是129.282、107.023、386.649，P<0.05)，MPP組>細菌性肺炎組>健康對照組，見表2。

表2 三組兒童外周血miR-29c、miR-146a及炎癥因子水平比較

2.3 MPP患兒外周血miR-29c、miR-146a與炎癥因子的相關性

Pearson相關分析顯示，MPP患兒外周血miR-29c、miR-146a與炎癥因子IL-17、TNF-α、IL-1β均呈負相關(rmiR-29c分別是-0.512、-0.550、-0.494，rmiR-146a分別是-0.329、-0.282、-0.340，P<0.05)，見表3及圖1。

表3 MPP患兒外周血miR-29c、miR-146a與炎癥因子的相關性

圖1 MPP患兒外周血miR-29c、miR-146a與炎癥因子的相關性

2.4 MPP不同病情組外周血miR-29c、miR-146a水平比較

MPP重癥組患兒miR-29c和miR-146a水平均低于輕癥組患兒，差異有統計學意義(t值分別是3.477、3.453，P<0.05)，見表4。

表4 MPP不同病情組外周血miR-29c、miR-146a水平比較

3討論

3.1MPP與炎癥因子的關系

本研究發現，MPP組患兒的IL-17、TNF-α、IL-1β水平均明顯高于細菌性肺炎組和健康對照組兒童。IL-17分泌自Th17促炎細胞，可經中性粒細胞招募性刺激多類炎癥介質釋放，在MPP中水平增高。既往研究也表明急性期MPP的IL-17水平相比正常者升高，且在合并肺外并發癥組中升高顯著[9]。MPP可刺激巨噬細胞釋放TNF-α，過量TNF-α可誘發免疫損害、內皮細胞損傷，繼而參與肺外系統受損，因此TNF-α與MPP病情有關。既往臨床研究及動物實驗均表明TNF-α有助于MPP評估[10-11]。IL-1β是主要分泌自巨噬細胞的促炎因子，可影響免疫應答、細胞增殖、感染過程等。蔡辰等人研究表明重癥MPP組血清IL-1β相比非重癥MPP組高[12]，說明IL-1β可反映MPP病情。

3.2研究MPP客觀標志物的必要性及意義

MPP發生過程可激活免疫細胞，促使大量炎癥因子釋放，參與MPP發展。但炎癥因子受到多因素調節和影響，對MPP兒童病情的反映可能存在滯后性，加之MPP病因機制復雜，目前臨床對客觀指標的探尋尚不全面。蔡辰等[12]研究也指出，細胞因子水平對重癥MPP缺乏診斷效能，在臨床應用中難以預測重癥MPP。因此，探尋更多潛在標志物輔助臨床MPP的客觀評估，從而為MPP的防治提供導向，具有重要研究意義。

3.3 MPP患兒miR-29c表達及與炎癥因子的相關性

miR-29c在機體免疫應答、感染疾病中有重要意義。Zhang等人研究發現與對照組相比，哮喘加重患兒的miR-29c水平明顯降低[13]；另有資料顯示miR-29c在呼吸系統疾病的病理生理過程中參與作用[14]。然而miR-29c與MPP的相關研究尚少。本研究顯示MPP患兒外周血miR-29c水平低于細菌性肺炎組和健康對照組，且MPP重癥組低于輕癥組，說明miR-29c在MPP患兒中呈相對低水平，且與MPP病情有關。這可能與miR-29c調控T細胞分化，調節抗感染免疫反應等有關[15]。既往研究表明，MPP感染患兒免疫功能紊亂，Th1細胞受抑制，Th1/Th2喪失平衡[16]；此外，Li等人[17]的研究顯示與對照組相比，MPP患兒的miR-29c水平明顯降低，而可溶性B7-H3、IL-17水平明顯升高；B7-H3是miR-29c的直接靶標，miR-29c沉默會上調B7-H3的表達，因此miR-29c可能是防治MPP的新靶標。這可能是miR-29c水平可反映MPP患兒病情的重要原因。本研究相關性分析顯示miR-29c與IL-17負相關，與上述發現較為一致。

3.4 MPP患兒miR-146a表達及與炎癥因子的相關性

miR-146a是核因子-κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)通道依賴型的具有抗炎特性的miRNA。既往研究表明miR-146a與呼吸窘迫綜合征、急性肺炎等呼吸系統疾病具有關聯性[18-19]。本研究顯示MPP患兒的miR-146a水平低于細菌性肺炎組和健康對照組，且MPP重癥組低于輕癥組，說明MPP患兒miR-146a呈相對低水平，且與MPP病情有關。究其原因，miR-146a可抑制Toll樣受體4調節的誘導型一氧化氮合酶，提高M2基因表達，減少巨噬細胞促炎因子的釋放[20]；而低miR-146a水平預示機體抵抗能力和抗炎作用減弱，宿主反應失調，炎癥及免疫損害增加，進而參與病情進展。Li等人[21]研究表明難治性MPP中miR146a5p的表達降低，可誘導ATP結合盒亞家族G成員1和白介素1受體相關激酶1的蛋白質表達，與MPP發展有關。另一方面，研究顯示miR-146a可負性調控IL-1β等介導的白介素-6、環氧化酶-2的負性影響及炎癥反應[22]。這可能是miR-146a與MPP相關聯的機制之一，同時提示miR-146a與IL-1β等炎癥因子存在關聯性。國內報道顯示miR-146a與TNF-α、IL-1β呈負相關[23]；本研究也發現miR-146a與IL-17、TNF-α、IL-1β均呈負相關，間接提示了miR-146a監測的可行性及價值。國外一項研究也表明社區獲得性肺炎入院時高水平的miR-146a與較低的30天死亡率相關，可作為預后生物標志物[24]，但具體方案有待進一步實驗明確。

綜上所述，MPP兒童外周血miR-29c、miR-146a呈相對低水平，且與IL-17、TNF-α、IL-1β呈負相關關系；miR-29c、miR-146a可能參與MPP發病過程，其水平隨病情加重而降低。但本研究屬于單中心研究，樣本量不大，后續尚待大樣本量研究進一步予以驗證。