lncRNA THRIL和miR-300在新生兒敗血癥患者中的臨床意義

矯 巖，石 巖，韓文超，劉文東，王曉琴

(青島市市立醫院兒科，山東 青島 266000)

新生兒敗血癥是危重感染疾病之一，病原菌或條件致病菌感染后入血，并在血液中增殖，引起新生兒全身感染[1]。新生兒機體免疫球蛋白合成能力不足，免疫功能發育尚不完全，病原菌入血后呈爆發性進展，且新生兒敗血癥前期癥狀隱匿，可能會造成臨床醫生誤判而延誤治療，造成新生兒出現多器官衰竭甚至死亡[2]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)和微小RNA(microRNA，miRNA)在轉錄及轉錄后水平調控基因的表達，影響機體生理病理進程[3-4]，其在包括膿毒癥及敗血癥在內的各炎癥性疾病中多有報道，如長鏈非編碼RNA-腫瘤壞死因子相關異種核蛋白L(long non-coding RNA-tumor necrosis factor-related and heterogeneous nuclear ribonucleoprotein L-related immunoregulatory，lncRNA THRIL)對膿毒癥并發呼吸窘迫患者預后具有一定預測價值[5]。miR-21聯合降鈣素原(procalcitonin，PCT)對膿毒癥診斷和病情動態變化都具有良好的預測價值[6]。但是目前lncRNA和miRNA在新生兒敗血癥的作用如何還鮮有報道。基于此，本研究探討lncRNA THRIL和miR-300在新生兒敗血癥患者的表達情況及與炎性因子的相關性，并探索兩者預測新生兒敗血癥預后的價值。

1資料與方法

1.1一般資料

將2016年6月至2021年9月青島市市立醫院收治的132例新生兒敗血癥患兒作為試驗組。納入標準：①符合《新生兒敗血癥診斷及治療專家共識》中新生兒敗血癥的診斷標準[7]：白細胞計數(white blood cells，WBC)、PCT、C反應蛋白(C-reactive protein，CRP)、血小板計數中兩項結果呈陽性；②經血培養顯示細菌感染；③日齡≤28d；④入院前未使用抗生素治療。排除標準：①合并遺傳代謝性疾病患兒；②合并免疫缺陷性疾病或嚴重血液系統傳染病患兒；③入院前使用抗生素或抗菌藥物治療患兒；④嚴重先天畸形，凝血功能異常者；⑤合并嚴重肝腎功能不全或先天心臟病患兒。另選擇同期住院的77例非敗血癥一般感染新生兒為對照組，兩組受試者監護人均簽署知情同意書，并通過醫院倫理委員會批準同意。

試驗組患兒男60例，女72例；日齡1～28d，平均日齡(16.26±3.28)d；平均體重(3.89±1.29)kg。對照組患兒男41例，女36例；日齡1～28d，平均日齡(17.01±4.29)d；平均體重(3.92±1.32)kg。兩組患兒性別組成、年齡、體重差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 lncRNA THRIL和miR-300表達檢測

采用實時熒光定量PCR(real-time PCR，RT-PCR)檢測lncRNA THRIL和miR-300表達。兩組受試者入院時采集靜脈血5mL，3 000rpm離心15min(離心半徑10 cm)后抽取血清，采用TRIzol試劑盒(Sigma-Aldrich，美國)抽提血清總RNA，瓊脂糖凝膠或分光光度計檢測其濃度及純度，對純度合格的RNA進行反轉錄；取1μg RNA反轉錄為cDNA(miRNA First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒，primescript RT reagent kit with gDNA Eraser試劑盒，Takara)和lnRcute lncRNA cDNA 鏈合成試劑盒(天根生物有限公司，中國)反轉錄為cDNA；使用SYBR miRNA RT-PCR Kit(Takara，日本)和lnRcute lncRNA熒光定量檢測試劑盒；RT-PCR反應體系：SYBR Green Mix 5.0μL，PCR F Primer 0.2μL，PCR R Primer 0.2μL，cDNA模板2μL，ddH2O 2.6 μL。RT-PCR擴增引物見表1，引物由上海生工設計合成，擴增程序：95℃預變性15 min，(95℃ 30s，60℃ 35s)×35個循環；反應完畢后，實驗數據采用ABI700軟件分析，以GAPDH，U6為內參按照2-△△Ct進行相對定量分析。

表1 RT-PCR擴增引物序列

1.3血清學指標檢測

采用酶聯免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測炎性因子白細胞介素6(interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)，嚴格按照試劑盒說明操作(ELISA試劑盒購自Abcam公司)；采用免疫色譜法檢測PCT，由HR201檢測儀分析；采用全自動生化分析儀(Olympus公司)對新生兒血清進行CRP和WBC檢測。

1.4預后及分組

根據患兒是否好轉分為預后良好組(n=91)和預后不良組(n=41)，預后良好組患兒敗血癥明顯好轉，WBC、PCT等血清學指標恢復正常且無后遺癥；預后不良組患兒包括死亡、腦積水、支氣管肺發育不良等嚴重后遺癥。

1.5統計學方法

2結果

2.1不同組受試者lncRNA THRIL和miR-300表達差異

對兩組數據進行正態性檢驗，兩組數據均成正態分布(P>0.05)；試驗組lncRNA THRIL表達量高于對照組，差異有統計學意義(2.32±0.53 vs 1.34±0.41，t=-8.283，P<0.001)；試驗組miR-300表達量高于對照組，差異有統計學意義(1.89±0.39 vs 1.28±0.30，t=-7.596，P<0.001)，見圖1。

圖1 不同組受試者lncRNA THRIL和miR-300表達差異

2.2兩組受試者血清學指標差異

與對照組相比，試驗組患兒血清WBC、PCT、CRP、IL-6、TNF-α水平升高，差異有統計學意義(t/Z值分別為-4.926、-28.327、-14.658、-15.451、-11.958，P<0.05)，見表2。

表2 兩組受試者血清學指標差異

2.3 lncRNA THRIL、miR-300聯合PCT對新生兒敗血癥的早期診斷價值

采用ROC曲線評估lncRNA THRIL、miR-300、PCT對敗血癥患兒的診斷價值，結果顯示三指標聯合診斷的AUC最高，為0.975，敏感度、特異性分別為0.871、0.974，見表3、圖2。

表3 lncRNA THRIL、miR-300、PCT診斷敗血癥患兒的ROC曲線分析

圖2 lncRNA THRIL、miR-300、PCT診斷敗血癥的ROC曲線

2.4 lncRNA THRIL、miR-300與敗血癥血清學指標的相關性

采用Spearman相關性分析檢驗lncRNA THRIL和miR-300與敗血癥血清學指標的相關性，結果顯示lncRNA THRIL、miR-300與PCT、CRP、IL-6、TNF-α均呈正相關關系(r值介于0.269～0.441之間，P<0.05)，見表4。

表4 lncRNA THRIL和miR-300與敗血癥血清學指標的相關性

2.5 lncRNA THRIL、miR-300對敗血癥患兒的預后評估

繪制ROC曲線評估lncRNA THRIL和miR-300對敗血癥患兒預后的預測價值，結果顯示兩指標聯合預測AUC最高，為0.867，敏感度和特異性分別為0.780、0.824，見圖3、表5。

圖3 lncRNA THRIL、miR-300評估敗血癥患兒預后的ROC曲線

表5 lncRNA THRIL、miR-300評估敗血癥患兒預后的ROC曲線分析

3討論

3.1新生兒敗血癥嚴重影響新生兒的生命健康

敗血癥是由于感染的病原菌入血并在血液中增殖，隨著血液循環造成的全身感染。新生兒機體免疫功能低下，抗感染能力差，故新生兒敗血癥是新生兒科最為棘手的危重癥之一[8]。新生兒敗血癥早期無全身特異性臨床表現，與一般感染無異，但其病情進展迅速，嚴重影響新生兒的生命健康。所以篩選多個生化標志物，進行多指標聯合早期診斷對新生兒敗血癥的治療及預后尤為重要。

培養是新生兒敗血癥診斷的“金標準”，但所耗時間較長，且培養率低。PCT作為血清降鈣素的前體，其血清水平與系統性炎癥反應密切，常被用來作為細菌真菌感染、肺炎及敗血癥的早期診斷[9]。本研究發現與一般感染的新生兒相比，敗血癥患兒PCT水平顯著升高，其作為新生兒敗血癥早期診斷的ROC曲線下面積為0.858，敏感度和特異性分別為0.735、0.882，該結果與以往報道一致[10]。

3.2 lncRNA THRIL、miR-300對新生兒敗血癥的早期診斷具有一定效能

lncRNA和miRNA是機體兩大類非編碼RNA，miRNA可以與靶基因的3′UTR結合，降低靶基因表達；lncRNA可以作為miRNA的“分子海綿”，與miRNA形成ceRNA網絡而調控下游基因的表達，進而影響腫瘤的發生發展、炎癥反應進展等各類生命活動[11-12]。lncRNA THRIL和miR-300在炎癥疾病中發揮重要作用，Li等[13]通過動物實驗發現miR-300能通過激活AMPK/mTOR信號通路在膿毒癥中調節炎癥反應，他們發現miR-300靶向結合NAMPT基因來增強細胞自噬并抑制細胞凋亡，增強內皮細胞周期而影響膿毒癥進展，以上結果表明miR-300能夠影響炎癥反應發生并影響膿毒癥進展。本研究發現miR-300在敗血癥患兒血清中高表達，其診斷敗血癥的曲線下面積為0.809；進一步探究其與炎性因子TNF-α、IL-6、CRP和PCT的相關性，發現miR-300與炎性因子水平呈明顯的正相關；且本研究發現miR-300對膿毒癥預后評估的AUC為0.770，該結果表明miR-300在新生兒敗血癥的早期診斷中有一定作用，且能通過影響炎性因子水平影響膿毒癥進展，對膿毒癥預后有一定預測價值。

THRIL可以通過調控TNF-α水平而影響炎癥反應，Chen等[14]發現THRIL可以通過調節miR-424/ROCK2軸加重膿毒癥小鼠的急性肺損傷。另有研究表明THRIL在膿毒癥患者中表達上調，其可作為miR-19a的“分子海綿”進而上調人支氣管上皮細胞中的TNF-α水平[15]。與膿毒癥相似，本研究發現新生兒敗血癥患兒中THRIL表達上調，且與TNF-α呈顯著正相關，對新生兒敗血癥的早期診斷AUC為0.838，預后預測的AUC為0.802；THRIL、miR-300和PCT對敗血癥早期診斷聯合分析，其AUC為0.975，該結果表明將各生化指標聯合分析后，診斷效能大大提高，在后期臨床中也可使用多指標聯合分析診斷新生兒敗血癥。THRIL和miR-300對敗血癥預后評估聯合分析，AUC為0.867，預測效能也明顯提高。

綜上，miR-300和lncRNA THRIL在新生兒敗血癥患兒血清中表達顯著提高，對新生兒敗血癥的早期診斷具有一定效能，可聯合常用的PCT、CRP等生化指標用于新生兒敗血癥的早期診斷。兩者皆與炎性因子有顯著相關性，可能通過調控炎性因子水平從而影響敗血癥進展，所以對敗血癥的預后有一定預測價值。在后期研究中我們還需進一步探究兩者對炎性因子的調控機制。