TB-DNA檢測聯合結核菌培養在肺結核診斷中的價值

黃銀娜，張小鳳，許旭輝，謝夏曼

（普寧市慢性病防治中心，廣東 普寧 515300）

肺結核是由結核分枝桿菌（MBT）感染引起的慢性呼吸道傳染病，發生于肺組織、氣管、支氣管和胸膜等部位［1］。據2019年WHO全球結核病報告［2］顯示，2018年在全球范圍內約有1 000萬人罹患結核病，中國新發結核病患者約86.6萬例，發病率64／10萬，死亡數3.94萬例。近年來，基于結核分枝桿菌復合群核酸檢測（TB-DNA檢測）的分子診斷技術得到較快發展，其中實時熒光定量PCR技術以其高靈敏度、高特異性、操作簡單而廣泛應用［3］。本研究探討TB-DNA檢測聯合羅氏固體培養在活動性肺結核診斷中的價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2020年1月至2020年12月我院收治的活動性肺結核患者471例為肺結核組，其中男349例，女122例，年齡11～90歲，均符合肺結核診斷標準［4］；另選取同期就診的非肺結核患者287例為非肺結核組，其中男216例，女71例，年齡11～93歲。兩組均行TB-DNA檢測及TB培養。

1.2 儀器和試劑結核分枝桿菌復合群核酸檢測試劑購自廈門致善生物科技股份有限公司，核酸提取采用廈門致善Lab-Aid 824S核酸提取儀，核酸擴增儀采用上海宏石SLAN-96S全自動醫用PCR分析系統；分離培養采用改良羅氏培養基。

1.3 實驗方法①標本采集：取三份痰標本：即時痰（就診后深呼吸后咳出的痰液）、夜間痰（送痰前一夜，患者晚間咳出的痰液）、次日晨痰（患者晨起立即用清水漱口后，咳出的第二口、第三口痰液），取樣后放置于無菌容器中，盡早送檢；TB-DNA檢測：取痰涂片陽性最高的標本進行檢測，若三份痰標本結果一致，則取質量最好（干酪痰、褐色血痰或含少量新鮮血液的血痰、粘液痰）標本進行檢測；TB培養：取陽性最高的兩份標本進行檢測，若三份痰標本結果一致，則取質量最好的兩份進行培養。②樣本檢測：進行TB-DNA檢測和TB培養、鑒定，嚴格按照試劑盒標準流程操作。③結果判斷：TBDNA檢測：通過待測樣品所得的擴增曲線C t值來判斷樣品中是否含有結核分枝桿菌。FAM通道為目的基因檢測通道，HEX通道為內控檢測通道。C t值≤25即為陽性，C t值＞25或無擴增信號即為陰性。檢測樣品在HEX通道C t值＜26。TB培養和鑒定：TB培養分別于接種后第3天、第7天各觀察一次，以后每周觀察一次，記錄菌落生長及污染情況，生長物經抗酸染色證實后報告分枝桿菌生長，滿8周后未見菌落生長者報告陰性。TB鑒定：37℃孵育4周時觀察結果，結核分枝桿菌PNB（-），否則為非結核分枝桿菌。

1.4 評價標準比較兩種檢測方法單獨及聯合診斷的靈敏度、特異度、陰性預測值和陽性預測值。

1.5 統計學分析采用SPSS 22.0統計軟件處理數據，計數資料以n（%）表示，行卡方檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 TB-DNA檢測結果在肺結核組471例中，檢出陽性278例（59.02%），陰性193例（40.98%）；非肺結核組287例中，檢測全部為陰性。見表1。

2.2 TB培養結果在肺結核組471例中，檢出陽性201例（42.68%），陰性270例（57.32%）；非肺結核組287例中，檢出陽性8例，全部經PNB培養基初步鑒定為非結核分枝桿菌，占2.79%，檢出陰性279例，占97.21%。見表1。

表1 TB-DNA檢測和TB培養的結果比較（n）

2.3 聯合檢測結果在肺結核組471例中，檢出陽性291例，占61.78%，陰性180例，占38.22%；非肺結核組中，檢出陽性8例，占2.79%，全部經PNB培養基初步鑒定為非結核分枝桿菌，其中6例涂陽患者核酸經廈門致善分枝桿菌鑒定試劑盒（熒光PCR熔解曲線法）均鑒定為非結核分枝桿菌，檢出陰性279例，占97.21%。見表2。

2.4 診斷價值以臨床診斷為金標準，TB-DNA檢測、TB培養及二者聯合的靈敏度分別為59.02%、42.68%、61.78%，特異度分別為100.00%、97.21%、97.21%，陰性預測值分別為59.79%、50.82%、60.78%，陽性預測值分別為100.00%、96.17%、97.32%；聯合檢測的靈敏度高于單項TB-DNA檢測及TB-培養（P＜0.05）。見表2和表3。

表2 不同診斷方法與臨床診斷的結果比較（n）

表3 不同檢測方案的診斷效能比較［%（n／n）］

3 討論

近年來，分子生物學在TB診斷中的應用越來越廣泛，實時熒光定量PCR是近年來WHO向全球極力推薦的診斷技術［5-6］。本研究結果顯示，TB-DNA檢測的靈敏度顯著高于TB培養，說明熒光PCR具有快速、靈敏度高的優點，其檢測時間短于TB培養，可以為結核病的早期診斷提供依據。本研究中肺結核組471例病例中，TB培養陽性而TB-DNA檢測陰性者13例，其中10例為涂陰病人，可能是TB-DNA檢測與TB培養為不同的痰標本；3例為涂陽病人，進一步實驗確認3例為結核分枝桿菌復合群。此3例患者可能存在IS6110基因位點的缺失或突變，導致擴增不到目的引物，因此TB-DNA檢測亦存在一定的假陰性，有條件的情況下做進一步的鑒定更有利于結核病的及時診斷。287例非肺結核組患者中，8例為TB培養陽性，經PNB鑒定均為非結核分枝桿菌，此8例TB-DNA檢測全部為陰性，對其中6例涂陽患者提取的核酸進行進一步實驗鑒定為非結核分枝桿菌，說明TB-DNA檢測陰性在涂陽患者中提示感染非結核分枝桿菌肺病的可能，進一步的菌型鑒定有利于結核病的鑒別診斷；TB培養是診斷肺結核的金標準，但結核分枝桿菌與大部分的非結核分枝桿菌均可在改良羅氏培養基上生長，同時做菌型鑒定有利于疾病的鑒別，否則也存在一定的假陽性。

TB-DNA檢測對結核病的診斷效果顯著，但特異性較差，存在一定假陽性、假陰性，使其難以發揮有效作用［7］。實時熒光PCR法對IS6110基因進行檢測，通過擴增信號的有無判斷是否存在結核分枝桿菌，檢測試劑采用預分裝干試劑，全程閉管，無需PCR后處理，加入UNG酶，可有效防止污染，杜絕假陽性，特別添加外源內控檢測，可有效避免假陰性，使結果準確可靠［8］，但其不能區分死菌跟活菌，不能作為療效觀察方法，TB培養可進一步做菌型鑒定和藥敏實驗，雖然特異性、靈敏度高，但所需時間較長，與TB-DNA檢測聯合應用可以提高疾病的診斷率。

綜上所述，TB-DNA檢測可快速診斷結核病，TB-DNA檢測聯合TB培養的檢出率更高，可有效提高診斷率，有利于早期診斷結核病。