硫酸卡那霉素及注射液的有關物質測定方法研究

劉照振,寇晉萍,劉海濤,侯金鳳,齊麟,黃曉春,李彧,劉琦,車寶泉（北京市藥品檢驗研究院 國家藥品監督管理局仿制藥研究與評價重點實驗室 中藥成分分析與生物評價北京市重點實驗室,北京 102206）

氨基糖苷類抗生素主要對金黃色葡萄球菌和需氧革蘭陰性桿菌，包括銅綠假單胞菌有強大的抗菌作用；對沙雷菌屬、布魯桿菌、沙門桿菌、嗜血桿菌、痢疾桿菌以及結核分枝桿菌、其他分枝桿菌屬亦具有良好的抗菌作用。氨基糖苷類抗生素優點較多，如水溶性好、抗菌能力強、性質穩定、吸收排泄較好等，因此在臨床上應用較為廣泛[1]?？敲顾兀╧anamycin）是1958年日本明治制果藥業株式會社開發生產的由α-去氧鏈胺衍生物組成的氨基糖苷類抗菌藥，對革蘭陰性菌及青霉素、鏈霉素、紅霉素等產生耐藥性的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、產氣桿菌、肺炎桿菌和痢疾桿菌有很強的抗菌作用[2]。目前各國藥典對卡那霉素均有收錄[3-7]，其原料藥根據硫酸鹽數目不同分為單硫酸卡那霉素（C18H36N4O11·H2SO4）和硫酸卡那霉素（C18H36N4O11·xH2SO4）兩種[8]。據文獻報道，卡那霉素主成分為卡那霉素A，發酵和純化工藝中會產生卡那霉素B、卡那霉素D等副產物和脫氧鏈霉胺降解產物[9-10]。

卡那霉素缺乏特征的紫外吸收，因此一般采用蒸發光檢測器（HPLC-ELSD）法對其進行質量控制?！吨袊幍洹?020年版[7]（Ch.P2020）收載的硫酸卡那霉素原料及硫酸卡那霉素注射液有關物質測定方法均為HPLC-ELSD法，僅對雜質卡那霉素B進行檢查，未對其他雜質進行控制，并且也有文獻[10]采用ELSD方法對其他雜質的控制進行研究，由于ELSD要求流動相具有揮發性，使得色譜系統的優化受到限制，因此分離能力較差。除《中國藥典》2020年版外，各國藥典均采用薄層色譜法進行有關物質檢查，方法專屬性較差且分離能力較低，無法對雜質譜進行深入分析。近幾年已有文獻[10-14]相繼報道，采用高效液相色譜-柱后衍生化-熒光檢測法對硫酸卡那霉素滴眼液、硫酸異帕米星注射液、妥布霉素滴眼液等氨基糖苷類制劑的質量控制方法展開研究。因此，針對硫酸卡那霉素原料及注射液需要開發新的質量控制方法。本方法重點參考文獻[10-14]，在原有文獻報道的高效液相色譜-柱后衍生化-熒光檢測法的基礎上，調整色譜系統和柱后衍生化系統，增加系統載樣量，提高檢測靈敏度和雜質分離度，新驗證的方法相比《中國藥典》2020年版和文獻方法，雜質的分離更好，檢測靈敏度和測定準確度進一步提高，可更好地控制硫酸卡那霉素原料及注射液的質量。

1 試驗材料

1.1 試驗儀器 LC-20A高效液相色譜儀（島津公司）；RF-20A熒光檢測器（島津公司）；waterse2695高效液相色譜儀（美國沃特斯公司）；2000ES蒸發光散射檢測器（ELSD）（奧泰公司）；Pickering PCX 5200柱后衍生化系統（美國沃特斯公司）；XA205電子天平（Mettler-toleto公司）等。

1.2 藥品與試劑 硫酸卡那霉素對照品（批號：130556-201502，中國食品藥品檢定研究院）；卡那霉素B對照品（批號：130548-200501，中國食品藥品檢定研究院）；硫酸卡那霉素樣品A（A公司，批號：180601、180602、181103），單硫酸卡那霉素樣品B（B公司，批號：20120112-1、20120203-1），單硫酸卡那霉素樣品C（C公司，批號：D1405020、D1405022），硫酸卡那霉素注射液樣品D（D公司，批號：1306171、1306172），硫酸卡那霉素注射液樣品F（F公司，批號：13091301、13091303）；氫氧化鈉、硼酸、冰醋酸、2-巰基乙醇（分析純）、無水硫酸鈉由國藥集團化學試劑有限公司提供（分析級）；鄰苯二甲醛（色譜純）由北京百靈威科技有限公司提供；三氟醋酸由J＆K CHEMICL提供（色譜級）；三氟乙酸、乙腈、甲醇均為色譜純，購自Merck公司；庚烷磺酸鈉（色譜純）由北京百靈威科技有限公司提供；水為高純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent ZORBAX SB C18柱（4.6mm×250mm，5μm）；流動相：pH3.4緩沖液（取庚烷磺酸鈉一水合物8.7g和無水硫酸鈉32g，加水溶解并稀釋至2000mL，用冰醋酸調節pH值至3.4±0.1）-甲醇（95∶5）為流動相A，以甲醇為流動相B，按表1進行線性梯度洗脫；柱溫：35℃；流速：1.0mL/min；熒光檢測器：激發波長340nm，發射波長455nm；進樣體積：5μL。配有柱后衍生化裝置，衍生化試液：取鄰苯二醛0.8g、甲醇300mL、2-巰基乙醇2ml和硼酸緩沖液（取72.0g硼酸和43.0g氫氧化鈉，加水溶解并稀釋至4000mL，用1mol/L硼酸溶液或1mol/L氫氧化鈉溶液調節pH值至10.4±0.1）700mL，混合，搖勻，置棕色瓶中，避光儲存；衍生化溫度：35℃；衍生化試液流速：0.5mL/min。

表1 流動相梯度洗脫條件

2.2 溶液的制備 有關物質測定溶液：精密稱取硫酸卡那霉素適量或精密量取硫酸卡那霉素注射液適量，加水溶解并定量稀釋制成約含卡那霉素1mg/ml的溶液，作為有關物質供試品溶液。取卡那霉素對照品適量，精密稱定，加水溶解并定量稀釋成約含卡那霉素2.5、5、10、15和20μg/mL的溶液，作為對照溶液（1）、（2）、（3）、（4）和（5），用線性回歸方程以自身對照法計算有關物質含量。

2.3 系統適用性溶液 系統適用性試驗溶液：取卡那霉素B對照品約10mg，置100ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，作為卡那霉素B對照品貯備液；另取卡那霉素對照品B約10mg，置10mL量瓶中，精密量取卡那霉素B對照品貯備液1ml，置同一量瓶中，振搖使其溶解，加水稀釋至刻度線，搖勻，作為系統適用性溶液。

將系統適用性溶液照“2.1”項下條件分析，與采用《中國藥典》2020年版中的HPLC-ELSD法比較，結果詳見圖1與圖2，如圖2所示采用新的方法，卡那霉素峰與卡那霉素B，及各雜質峰之間分離度更能滿足藥典要求。

圖1 HPLC-熒光檢測法系統適用性典型色譜圖

圖2 《中國藥典》2020年版HPLC-ELSD法測定系統適用性典型色譜圖

2.4 專屬性試驗 按企業提供的制劑處方，稱取亞硫酸氫鈉約2.0g、依地酸二鈉0.1g，置同一1000ml量瓶中，加入適量純化水使溶解，另加入濃硫酸27.6ml，加水稀釋至刻度，搖勻，精密量取1ml，置250ml量瓶中，加水稀釋至刻度搖勻，作為輔料干擾溶液。將輔料干擾溶液和空白溶劑照“2.1”項下條件分析，結果詳見圖3。如圖所示，空白與輔料均不干擾樣品測定，方法專屬性良好。

圖3 專屬性試驗色譜圖。注：A.空白；B.輔料

2.5 破壞試驗 取D企業批號為1306171的樣品，精密量取5份，各1mL，分別置250mL量瓶中，進行如下處理：①酸破壞：加2mol/mL鹽酸溶液5mL，60℃水浴加熱12h，加2mol/mL氫氧化鈉溶液5mL中和；②堿破壞：加2mol/mL氫氧化鈉溶液5mL，60℃水浴加熱12h，加5mol/mL鹽酸溶液1mL中和；③光破壞：在5000lx照度下放置12h；④熱破壞：60℃水浴加熱12h；⑤氧化破壞：加6%過氧化氫溶液5mL，60℃水浴加熱12h。將上述5種破壞的溶液用水稀釋至刻度，搖勻，按“2.1”項下條件進樣分析，色譜圖詳見圖4。結果表明，在硫酸卡那霉素光照和加熱破壞下均穩定，在堿和氧化條件下，降解雜質Ⅱ和雜質Ⅲ的含量略有上升，在酸性破壞中降解雜質Ⅱ和雜質Ⅲ的含量有明顯上升。由結果可以看出，卡那霉素在各條件破壞下得到的雜質均能實現滿意分離。

圖4 樣品原液及5種方式破壞樣品溶液的色譜圖。注：A.未破壞；B.加熱破壞；C.光照破壞；D.氧化破壞；E.堿破壞；F.酸破壞

2.6 線性關系考察 精密稱定硫酸卡那霉素對照品適量，用水溶解并稀釋制成約1.0mg/mL的卡那霉素溶液，作為線性儲備液。分別精密量取線性儲備液適量，制成系列濃度的線性溶液，作為線性考察用溶液。分別取線性考察溶液5μL，注入色譜儀，記錄色譜圖。以卡那霉素峰面積y對質量濃度（x）進行線性回歸，得出回歸方程：y=43.415x-15.627（r＝0.9998）結果表明卡那霉素在0.005-1.0mg/mL濃度范圍內，與卡那霉素峰面積呈良好線性。

2.7 檢測限和定量限 熒光方法的最低檢測濃度為0.3μg/mL（LOD，S/N=3），最低定量濃度0.5μg/mL（LOQ，S/N=10），按進樣量5μL換算，得到方法的檢測限為1.5ng，定量限為2.5ng，分別相當于供試品濃度的0.03%和0.05%。

2.8 重復性考察 取批號為1306171的樣品，按2.2項下方法配制供試品溶液各6份，照2.1項下的方法色譜條件，在10h內每2h進樣，分別測定其已知雜質、其他單個最大雜質和總雜質的量，結果詳見表2：卡那霉素B的RSD（n=6）為0.5%，雜質Ⅰ的RSD（n=6）為0.4%，雜質Ⅱ的RSD（n=6）為0.8%，雜質Ⅲ的RSD（n=6）為1.3%，雜質Ⅳ的RSD（n=6）為1.0%，總雜質的RSD（n=6）為0.3%，表明重復性良好。

表2 重復性試驗結果

2.9 耐用性試驗 對方法的耐用性進行分析，分別改變流速、柱溫、流動相pH值和相同色譜柱的批次，以卡那霉素峰與卡那霉素B峰之間、卡那霉素與雜質Ⅳ、雜質Ⅱ分別與雜質Ⅰ、雜質Ⅲ之間分離度衡量分離情況，耐用性試驗結果見表3。由結果可見，最優條件為1.0mL/min流速，35℃柱溫，流動相為pH值為3.4。

表3 耐用性試驗結果

2.10 有關物質檢查結果 分別取各企業硫酸卡那霉素原料及注射液，按“2.2”項下方法配制有關物質供試品溶液及有關物質對照品溶液，按照“2.1”項下條件分析。計算雜質含量，結果見表4。

表4 有關物質測定結果

3 討論

3.1 色譜條件選擇 本文重點參考硫酸卡那霉素滴眼液質量控制相關文獻[12-14]，采用高效液相色譜-柱后衍生化-熒光檢測器法，新建硫酸卡那霉素原料及注射液有關物質的測定方法。在已有文獻方法的基礎上，調整色譜系統和衍生化條件。

在液相色譜條件方面：在不改變流動相中緩沖鹽的情況下，進一步調整流動相中緩沖鹽和乙腈的比例，并相應地調整梯度洗脫時間程序，色譜柱由（4.6mm×100mm，3.5μm）的短柱，改變為Agilent ZORBAX SB C18（4.6mm×250mm，5μm）長柱。

柱后衍生化條件：在不改變柱后衍生化試劑、緩沖鹽等條件下，充分考察了衍生劑的流速、衍生化的溫度、衍生化試劑的用量和衍生劑的pH值等方面的因素。在衍生劑的流速方面，衍生劑流速影響衍生化率，在流速0.3mL/min、0.4mL/min、0.5mL/min時主峰面積無明顯變化，當衍生劑流速增大到0.6-1.0mL/min時，主峰面積呈現減小趨勢，但是各雜質分離度隨衍生劑流速增大而提高，因此綜合考慮各色譜峰分離度和衍生化率的因素，衍生劑流速確定為0.5mL/min；衍生化試劑鄰苯二甲醛用量方面，衍生劑加入量在1.2g/L、1.0g/L、0.9g/L、0.8g/L和0.7g/L時各峰面積無明顯變化，當衍生劑加入量減少至0.6g/L和0.5g/L時，各峰面積呈現減小趨勢，因此綜合考慮衍生化率，衍生劑加入量確定為0.8g/L；考察了衍生劑不同pH值時（10.2、10.4、10.6）和衍生化溫度（30℃、35℃、40℃）各峰面積的變化，溫度和pH值的變化對峰面積幾乎無影響，故選擇與文獻相同的衍生化溫度為35℃和pH值10.4。

3.2 雜質定位及計算方法選擇 中檢院提供的卡那霉素B為定性鑒別用對照品，缺乏純度值，雜質Ⅰ、雜質Ⅱ、雜質Ⅲ和雜質Ⅳ各國藥典均未有相關對照品，無法進行雜質回收率的準確度試驗，也無法按雜質對照外標法或帶校正因子的自身對照法計算。此外，《中國藥典》2020年版也采用不帶校正因子的自身對照法，其他各國藥典均采用自身對照的薄層色譜法進行有關物質檢查，因此受各國藥典無對照品的限制，新建方法也采用不帶校正因子的自身對照法計算。

3.3 新建方法與《中國藥典》現行標準有關物質測定結果的比較 用新建硫酸卡那霉素及注射液有關物質的測定方法與《中國藥典》2020年版收載硫酸卡那霉素有關物質測定方法HPLCELSD，分別對企業提供樣品進行測試，測試樣品的代表性圖譜詳見圖5和圖6，樣品測定結果詳見表5。

表5 HPLC-柱后衍生化-熒光檢測法（新擬定方法）和HPLCELSD（中國藥典方法）有關物質測定結果對比

圖5 HPLC-ELSD系統有關物質測定法供試品溶液實驗色譜圖

圖6 HPLC-柱后衍生化-熒光檢測系統有關物質測定法供試品溶液實驗色譜圖

根據測定結果，HPLC-FLD法檢出雜質數量更多（見表5）；對于樣品中主要的降解雜質Ⅱ與雜質Ⅲ和工藝雜質Ⅰ，HPLC-柱后衍生化-熒光檢測法都能實現更好的分離和檢測（見圖6），因此，本法更能真實、客觀、有效地反映出硫酸卡那霉素的質量。

4 小結

本研究是國家藥典委員會關于硫酸卡那霉素原料及硫酸卡那霉素注射液藥品標準提高項目，本文所建立的HPLC-柱后衍生化-熒光檢測法較HPLC-ELSD法（《中國藥典》2020年版）提高了分離度和靈敏度，新方法測定硫酸卡那霉素原料及注射液的有關物質，檢出雜質數量更多，結果更加準確。因此，本文建立的HPLC-柱后衍生化-熒光檢測法更能有效控制硫酸卡那霉素原料及注射液的質量。