任鋒：丁型病毒性肝炎

本刊記者:陳詞

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任鋒：首都醫科大學附屬北京佑安醫院教授/研究員，博士生導師，博士后合作導師。入選北京市優秀人才，北京市十百千衛生人才“百”層次人才，北京衛生系統技術人才學科骨干；美國加州大學洛杉磯分校（UCLA）訪問學者；主持國家“13.5”課題，國家自然科學基金面上項目、北京市自然科學基金、北京市科委臨床特色研究、首都衛生發展科研專項重點攻關項目等20余項課題，參加國家 “12.5”、“11.5”等重大專項以及973等科研項目研究。

記者問：丁型肝炎病毒特點是什么？

任鋒教授：丁型肝炎（丁肝）是由丁型肝炎病毒（HDV）感染引起的一種病毒性肝炎。HDV是一種缺陷病毒，利用乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）進入肝細胞。因此，HDV可與HBV聯合或重疊感染。與單獨慢乙肝患者相比，HDV/HBV重疊感染的肝臟疾病更為嚴重并且進展更快，約90%會進展為慢性肝炎，發生肝衰竭、肝硬化和肝癌等不良結局風險顯著增加。丁型肝炎病毒顆粒直徑大小為35～37nm，外層由脂質雙層和HBV表面抗原組成，核內包含有HDV抗原和HDV RNA基因組結合的核蛋白體，是目前所知唯一具有共價閉合環狀負鏈RNA基因組的病毒，基因組長度1.7kb。HDV是一種缺陷病毒，需要利用乙型肝炎病毒表面抗原進入肝細胞。因此，HDV的感染方式可分為與HBV共同感染或重疊感染。

記者問：目前丁型肝炎病毒感染的現狀如何？

任鋒教授：HDV感染和危害長期以來被低估甚至忽視。在中國最新一項薈萃分析表明：抗－HDV陽性患者在慢性乙肝患者中的流行率為2.1%，在普通人群中流行率為0.4%。一些流行病學家認為，由于我們長期忽視HDV感染以及造成的嚴重后果，導致了HDV的診斷沒有受到足夠的重視。而在其他國家，也僅在小部分的HBV患者中進行了研究，目前掌握的數據還不夠充分。此外，由于實驗室檢測方法僅局限于HDV抗體檢測，少有HDV RNA的檢測，容易造成檢測結果不準確。所以，在世界范圍內，HBsAg陽性患者的HDV感染率均需要更進一步的研究和明確。

記者問：乙型肝炎病毒和丁型肝炎病毒聯合或者重疊感染的后果如何？

任鋒教授：與單獨慢性乙肝相比，HDV重疊感染增加疾病的死亡率以及終末性肝病（肝硬化、肝細胞癌和肝衰竭）的發生率，并且HDV重疊感染加快肝硬化和肝細胞癌疾病進程。

記者問：目前丁型肝炎病毒感染率為什么被低估？

任鋒教授：我們長期忽視HDV感染以及其造成的嚴重后果，導致了HDV診斷沒有受到臨床大夫足夠的重視，例如2019年和2020年，全國法定傳染病疫情報告顯示，HDV病例的報告病例數僅有352例和187例，這與流行率估算結果存在很大差距。只有通過高性能的HDV診斷方法，才能對HDV的感染率展開全面的調查。因此，HDV 感染檢測方法的局限性是丁型肝炎病毒感染被顯著低估的重要原因之一。

記者問：目前丁型肝炎病毒的實驗室檢測方法有哪些？

任鋒教授：目前，一般通過檢測HDV抗原（HDV-Ag）、HDV抗體（HDV-Ab）和HDV RNA來診斷HDV感染。肝臟活檢時，HDVAg可通過免疫熒光和免疫組織化學法等方法檢測到，但是目前的應用比較少；ELISA方法檢測HDV抗體是實驗室常用的檢測手段，IgM被認為是HDV感染中具有代表性的標志物之一，而且其清除效率與疾病的療效緊密相關；IgG會在HDV感染后持續存在。HDV RNA 是當前診斷HDV感染的“金標準”，HDV RNA的定量測定可用于監測抗病毒治療的應答，RT-PCR方法對HDV RNA是實驗室常用的檢測手段。

記者問：目前丁型肝炎病毒的實驗室檢測方法的不足是什么？

任鋒教授：ELISA方法檢測HDV抗體時受到許多因素的影響：一方面，急性HDV 感染時，HDV抗體存在時間很短很難檢出，所以HDV抗體陰性不能否定丁型肝炎的發生；而慢性HDV感染時，血液中的HDV抗體和抗原形成免疫復合物，會對檢測結果造成影響。另一方面，HDV IgG與肝細胞受損和炎癥活動密切相關，因此聯合血清HDV RNA的檢測結果才能確HDV抗體的陽性結果。盡管RTPCR檢測具有快速、方便、特異等優點，但是，由于HDV RNA 中GC含量和互補性高，給HDV擴增帶來了巨大的技術挑戰，而且HDV的高度遺傳變異性也使得需要精心設計其引物和探針。由于HDV RNA的廣泛遺傳變異性，迄今為止尚無完全標準化的PCR檢測技術。

記者問：如何改進丁型肝炎病毒的實驗室檢測方法呢？

任鋒教授：丁肝的檢測主要包括抗原檢測，抗體的檢測和病毒核酸的檢測三個方面：

1、ELISA方法檢測HDV病毒抗原：存在窗口期短，靈敏度特異度較差的缺點。

2、HDV病毒抗體的檢測包括IgG 型和IgM型。ELISA試劑盒通常使用間接法檢測抗HDV-IgG，但是容易出現假陽性結果，不同廠家的試劑盒質量參差不齊，通常用于臨床HDV感染的初步篩查。ELISA檢測抗HDV-IgM通常使用捕獲法，抗HDV-IgM反映了患者體內HDV感染的情況，也可以用來指導HDV抗病毒治療。但是目前檢測試劑盒的準確性仍然需要進一步提高。

3、HDV RNA檢測是診斷丁肝感染的金標準。目前RT-PCR檢測靈敏度可以達到103拷貝/微升，巢式PCR 檢測下限可以達到10拷貝/微升。但是由于HDV基因組高度可變性，給引物的設計帶來了巨大的挑戰。目前尚無統一的標準，不同實驗室的結果也不具有可比性。

記者問：你們實驗室在丁型肝炎病毒的精準檢測方法方面有什么新進展？

任鋒教授：針對于HDV的檢測，我們課題組分別從抗體、核酸兩個方面對檢測方法進行了探索與改進：

1、抗體檢測：目前 ELISA試劑盒普遍使用酶催化底物的顯色反應，存在靈敏度不高，特異性不強的缺點。我們課題組對HDV抗原重新表達，純化，將其固定于固相載體，并且進一步與納米酶顯色技術相結合，進一步提高檢測的靈敏性和穩定性。

2、核酸檢測：首先，基于微滴數字PCR技術，建立了可以絕對定量HDV患者體內HDV RNA水平的ddPCR技術檢測方法，檢測下限可低至單個拷貝。其次，我們使用最新的CRISPR/Cas13a檢測技術建立了對HDV RNA進行精準、快速的檢測方法，檢測下限分別低至10拷貝/微升和100拷貝/微升。

相信經過我們的努力，在不遠的將來我們的研究成果可以投入HDV的臨床應用檢測，更有利于HDV感染的早期篩查，為更多的臨床醫生和患者提供幫助。