抗菌藥物聯合中藥單體對泛耐藥鮑曼不動桿菌生物被膜的影響

孟千琳 彭勤 凌保東,*

(1 成都醫學院結構特異性小分子藥物研究四川省高校重點實驗室，成都 610500；2 成都醫學院藥學院，成都 610500；3 南充市中心醫院，南充 637000)

近年來，全球泛耐藥鮑曼不動桿菌(extensively drug resistant,XDRAB)檢出率急劇增加，已被世界衛生組織(WHO)列入ESKAPE家族的最高級別耐藥病原體之一[1-2]，其中XDRAB生物被膜的形成作為重要的毒力因素[3-4]，通過阻止抗菌藥物的滲入、抵抗宿主免疫系統、保護休眠菌，甚至導致全耐藥細菌出現，使頑固性感染難以治愈[5-6]。因此，迫切需要從新的角度對細菌耐藥機制進行研究，尋找新的防治策略與方法。筆者前期研究表明抗菌藥物與中藥單體組合用藥對XDRAB具有逆轉耐藥性作用[7]，本研究擬深入探討這種逆轉XDRAB耐藥性作用是否與生物被膜的抑制作用相關，以期為臨床防治XDRAB感染提供新的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 試驗藥物

4種抗菌藥物：多黏菌素B(批號：J0716A，含量: ＞6500 IU/mg)、亞胺培南(M0502A，含量＞95%)、美羅培南(M0108A，含量＞98%)、替加環素(F1208A，含量＞98%)；3種中藥單體：黃芩苷(大連美侖生物公司，批號：M0515A，含量: ≥95% )、鹽酸小檗堿(大連美侖生物公司，批號：J1202A，含量:≥97%) 、槲皮素二水物( 上海源葉生物科技有限公司，批號: C13A9Y58602，含量: ≥95% ) ;

1.2 菌株

2018—2019年成都醫學院第一附屬醫院不同科室的臨床標本分離的XDRAB 9株，其中臨床分布重癥醫學科5株，呼吸科2株，老年醫學科1株，急診科1株，質控菌大腸埃希菌DH5α為本實驗室留存。

1.3 試劑

胰蛋白胨大豆肉湯培養基(批號：20200815青島海博生物技術有限公司)、MH肉湯培養基(批號：MB0148大連美侖生物公司)、磷酸緩沖液(批號：20201228上海生工生物工程有限公司)

1.4 儀器

恒溫培養箱(上海一恒科技有限公司)、生物安全柜(Thermo Fisher Scientific公司)、酶標儀(伯騰儀器有限公司)。

1.5 方法

1.5.1 抗菌藥物、中藥單體對XDRAB生長的影響

使用96孔細胞培養板，每株菌設置6個復孔，每孔加入20 μLA600=0.12的菌液和170 μL TSB培養基，模型對照組加入10 μL PBS，實驗組加入10 μL對應濃度的藥液，37℃，孵育24 h，每隔4 h測一次A600值，利用比濁法檢測24 h內4種抗菌藥物及3種中藥單體在1、1/2、1/4、1/8和1/16×MIC的濃度下對9株XDRAB生長的影響，最終選擇不抑制細菌生長的藥物濃度作為后續實驗的工作濃度。

1.5.2 抗菌藥物、中藥單體單用及組合用藥對XDRAB生物被膜的影響

菌液的制備：接種細菌于L B 固體培養板，37℃細菌培養箱孵育16～20 h，挑取3～5顆單克隆于200 μL 0.9%生理鹽水中進行混勻，取100 μL于酶標儀測定A600值，最終通過加入0.9%生理鹽水調整至A600=0.12，細菌含量達到1×108CFU/mL。XDRAB生物被膜形成能力的檢測：使用96孔細胞培養板，陰性對照組選取無生物被膜形成能力的大腸埃希菌DH5α菌株，設置6個復孔，每孔依次加入180 μL的TSB培養基和20 μLA600=0.12的菌液，37℃，孵育24 h。去除培養基后用200 μL PBS清洗3遍，空氣干燥20 min，0.1%結晶紫染色20 min，去除結晶紫，重復3遍，最后加入95%乙醇，酶標儀下測定570 nm的吸光度A。生物被膜形成能力判定標準為:①BF陰性：A模型對照≤A陰性對照，②BF陽性：A模型對照＞A陰性對照，結晶紫棋盤染色法(crystal violet staining,CVS)：參照文獻[8-9]的實驗方法，并稍作調整，使用96孔細胞培養板，每株菌設置6個復孔，藥物濃度選擇不抑制細菌生長的濃度，以此濃度為基礎進行倍比稀釋，設置高、中、低3個濃度梯度。將4種特殊使用級抗菌藥物分為A1、A2、A3、A4；3種中藥單體分為B1、B2、B3。以A1和B1組合為例進行藥物分組：①藥物單用組：A1濃度分別為(A1高濃度)、(A1中濃度)、(A1低濃度)；B1濃度分別為(B1高濃度)、(B1中濃度)、(B1低濃度)；②藥物聯用組：A1和B1的3個濃度分別兩兩組合，得到A1與B1聯合應用的9個濃度組合，綜上通過棋盤組合法比較藥物單用和聯用時各個濃度下對XDRAB生物被膜的抑制作用。空白對照組加入180 μL TSB培養基，藥物單用組加入170 μL TSB培養基、對應濃度的藥液10 μL，藥物聯用組加入160 μL TSB培養基、兩個組合濃度的藥液各10 μL，最后加入A600為0.12的細菌重懸液20 μL，總體系為200 μL，37 ℃，孵育24 h，吸出培養基后用200 μL PBS清洗3遍，空氣中干燥20 min，每孔加入200 μL 0.1%結晶紫染色20 min，吸出結晶紫，重復PBS清洗3遍，空氣干燥20 min，加入95%乙醇溶解，酶標儀測定570 nm下吸光度A，生物被膜抑制率(%)=[1-(藥物組吸光度A/模型對照組吸光度A)]×100。

1.5.3 統計學處理

運用SPSS26.0t檢驗和Graphpad Prism 8.0.1分別進行數據統計和作圖，計量資料以(±s)表示，以P＜0.05具有統計學意義。

2 結果

2.1 抗菌藥物、中藥單體對XDRAB生長的影響

結果顯示(圖1)，與模型對照組相比，亞胺培南(4 μg/mL)、美羅培南(2 μg/mL)、多黏菌素B(0.25 μg/mL)、替加環素(0.0625 μg/mL)、黃芩苷(128 μg/mL)、鹽酸小檗堿(32 μg/mL)、槲皮素二水物(64 μg/mL)，在24 h內不抑制細菌的生長，將該濃度作為后續實驗的工作濃度。

2.2 抗菌藥物、中藥單體單用及組合用藥對XDRAB生物被膜的影響

與陰性對照組相比，9株XDRAB均會形成生物被膜，藥物濃度選擇見“2.1”，以此濃度為基礎進行倍比稀釋，設置高、中和低3個濃度梯度，藥物濃度分組見表1。與模型對照組相比，4種抗菌藥物、3種中藥單體在各自高濃度下單用均能夠明顯抑制XDRAB生物被膜的形成(P＜0.05)，抑制作用槲皮素二水物＞替加環素＞美羅培南＞鹽酸小檗堿＞多黏菌素B＞黃芩苷＞亞胺培南，4種抗菌藥物分別和3種中藥單體在高濃度下聯合用藥對XDRAB生物被膜抑制效果均明顯優于單獨用藥(P＜0.05)，結果見表2，其中替加環素與黃芩苷的9個濃度組合均能夠顯著抑制XDRAB生物被膜的形成(P＜0.05)，抑制效果均比替加環素、黃芩苷分別對應濃度單用時的作用強(P＜0.05),在替加環素(0.015625 μg/mL) +黃芩苷(32 μg/mL)的濃度組合下，藥物劑量最小，結果見表3和圖3。

表1 4種抗菌藥物和3種中藥單體對9株XDRAB生物被膜抑制的工作濃度分組(μg/mL)Tab.1 The working concentration group of 4 kinds of antibacterial agents and 3 kinds of traditional Chinese medicine monomers on 9 XDRAB biofilm inhibition (μg/mL)

表2 4種抗菌藥物、3種中藥單體單用、聯用對9株XDRAB生物被膜形成的影響(±s,n=9)Tab.2 The activity of 4 kinds of antibacterial agents and 3 kinds of Chinese medicine monomers on the formation of 9 XDRAB biofilms(±s,n=9)

表2 4種抗菌藥物、3種中藥單體單用、聯用對9株XDRAB生物被膜形成的影響(±s,n=9)Tab.2 The activity of 4 kinds of antibacterial agents and 3 kinds of Chinese medicine monomers on the formation of 9 XDRAB biofilms(±s,n=9)

"-"：該濃度藥物對生物被膜的抑制率與空白組一致

藥物(μg/mL)生物被膜形成能力(A570)顯著性差異(與空白組比較)BF抑制藥物(μg/mL)生物被膜形成能力(A570)顯著性差異(與空白組比較)BF抑制率/%(與空白組比較)XDRAB(n=9)PXDRAB(n=9)P率/%(與空白組比較)空白1.125±0.373小檗堿(16)0.864 ±0.107＜0.0523.2陰性對照0.410±0.030小檗堿(8)1.120 ±0.064＞0.05-亞胺培南(4)0.720±0.154＜0.0136.0槲皮素(64)0.512 ±0.049＜0.0154.5亞胺培南(2)0.874±0.183＜0.0522.4槲皮素(32)0.734±0.075＜0.0134.8亞胺培南(1)0.980±0.190＞0.0512.9槲皮素(16)0.861 ±0.081＜0.0523.5美羅培南(2)0.616±0.191＜0.0145.3亞胺培南(4) /黃芩苷(128)0.437 ±0.063＜0.0161.2美羅培南(1)0.846±0.175＜0.0524.8亞胺培南(4)/小檗堿(32)0.512 ±0.138＜0.0154.5美羅培南(0.5)0.902±0.173＜0.0520.0亞胺培南(4)/槲皮素(64)0.410 ±0.042＜0.0163.6多黏菌素B(0.25)0.682±0.129＜0.0139.4美羅培南(2) /黃芩苷(128)0.402 ±0.081＜0.0164.3多黏菌素B(0.125)0.919±0.098＜0.0518.4美羅培南(2)/小檗堿(32)0.384 ±0.094＜0.0166.0多黏菌素B(0.0625)1.034±0.101＞0.058.1美羅培南(2)/槲皮素(64) 0.376 ±0.041＜0.0166.6替加環素(0.0625)0.598 ±0.068＜0.0146.9多黏菌素B(0.25) /黃芩苷(128) 0.582 ±0.099＜0.0148.3替加環素(0.03125)0.780 ±0.084＜0.0130.7多黏菌素B(0.25)/小檗堿(32) 0.507 ±0.099＜0.0155.0替加環素(0.015625) 0.918 ±0.086＜0.0518.4多黏菌素B(0.25)/槲皮素(64) 0.450 ±0.108＜0.0160.0黃芩苷(128)0.704 ±0.082＜0.0137.5替加環素(0.0625) /黃芩苷(128) 0.412 ±0.101＜0.0163.4黃芩苷(64)0.887 ±0.053＜0.0521.2替加環素(0.0625)/小檗堿(32) 0.456 ±0.071＜0.0159.5黃芩苷(32)0.894 ±0.072＜0.0520.6替加環素(0.0625)/槲皮素(64) 0.398 ±0.079＜0.0164.7小檗堿(32)0.660 ±0.117＜0.0141.4

表3 替加環素與黃芩苷聯用對9株XDRAB生物被膜形成的影響(±s,n=9)Tab.3 The activity of tigecycline and baicalin on the formation of 9 XDRAB biofilms(±s,n=9)

表3 替加環素與黃芩苷聯用對9株XDRAB生物被膜形成的影響(±s,n=9)Tab.3 The activity of tigecycline and baicalin on the formation of 9 XDRAB biofilms(±s,n=9)

生物被膜形成能力(A570)顯著性差異(與空白組比較)藥物(μg/mL)BF抑制率/%(與空白組比較)XDRAB(n=9)P空白1.125±0.373陰性對照0.410±0.030替加環素(0.0625)/黃芩苷(128)0.412 ±0.101＜0.0163.4%替加環素(0.03125)/黃芩苷(128)0.474 ±0.067＜0.0157.9%替加環素(0.015625)/黃芩苷(128)0.512 ±0.055＜0.0154.5%替加環素(0.0625)/黃芩苷(64)0.519 ±0.120＜0.0153.9%替加環素(0.03125)/黃芩苷(64)0.592 ±0.110＜0.0147.4%替加環素(0.015625)/黃芩苷(64)0.668 ±0.105＜0.0140.7%替加環素(0.0625)/黃芩苷(32)0.579 ±0.124＜0.0148.6%替加環素(0.03125)/黃芩苷(32)0.639 ±0.133＜0.0143.2%替加環素(0.015625)/黃芩苷(32)0.779 ±0.120＜0.0530.8%

3 討論

細菌生物被膜的形成過程主要分為4步[10-11]：菌毛、鞭毛等黏附細胞器進行初始黏附、細菌聚集進行不可逆附著、形成成熟的生物被膜、生物被膜內部深層細菌與生物被膜分散后進行再定植，生物被膜形成后對抗菌藥物的耐藥性增強10～1000倍[12]。而XDRAB生物被膜一旦形成，臨床現有的抗菌藥物均難以控制，生物被膜菌所引起的院內感染是目前全球醫學界所面臨的重要難題，尋找新的抗菌藥物組合勢在必行。實驗結果表明，4種抗菌藥物與3種中藥單體在各自高濃度單用、聯用均可以顯著抑制XDRAB生物被膜的形成，單藥抑制作用槲皮素二水物＞替加環素＞美羅培南＞鹽酸小檗堿＞多黏菌素B＞黃芩苷＞亞胺培南，4種抗菌藥物亞胺培南、美羅培南、多黏菌素B、替加環素與3種中藥單體黃芩苷、鹽酸小檗堿、槲皮素二水物在單用及聯用時對 XDRAB 的生物被膜形成均具有不同程度的抑制作用，組合用藥表現為不同程度的協同抗生物被膜效應。

目前，替加環素與多黏菌素被認為是治療XDRAB感染的最后一道防線，但是，XDRAB的生物被膜一旦形成，耐藥性甚至轉變為全耐藥，我們旨在通過研究臨床特殊使用級抗菌藥物與中藥單體組合治療針對XDRAB生物被膜的感染。本研究表明，亞胺培南(4 μg/mL)、美羅培南(2 μg/mL)、多黏菌素B(0.25 μg/mL)、替加環素(0.0625 μg/mL)、黃芩苷(128 μg/mL)、鹽酸小檗堿(32 μg/mL)、槲皮素二水物(64 μg/mL)的濃度下顯著抑制XDRAB生物被膜的形成，且該工作濃度均不抑制XDRAB生長，謝杰鵬等研究表明[13]，美羅培南通過抑制c-di-GMP進一步抑制銅綠假單胞菌生物被膜的形成。此外，Tahereh等[14]研究證明，替加環素在亞抑菌濃度濃度下通過調控群體感應系統abaI/abaR基因的表達從而抑制生物被膜的形成。鹽酸小檗堿作為天然異喹啉生物堿[15]，廣泛用于治療細菌性腹瀉及胃腸炎，本研究表明鹽酸小檗堿在32和16 μg/mL濃度下均可以明顯抑制XDRAB生物被膜的形成，并且臨床抗菌藥物亞胺培南、美羅培南、多黏菌素B、替加環素與鹽酸小檗堿聯合應用均具有不同程度的協同抗生物被膜效應，其中2 μg/mL美羅培南與32 μg/mL鹽酸小檗堿聯用可以有效抑制66%的XDRAB生物被膜的形成。Tong等[16]研究表明鹽酸小檗堿在亞抑菌濃度下通過下調大腸埃希菌鞭毛合成基因motA和fliA、外膜蛋白調節基因ompA從而抑制生物被膜的形成。

槲皮素二水物、黃芩苷作為典型黃酮類化合物，具有抗菌、抗病毒、抗氧化等廣泛的藥理作用[17]。本實驗結果顯示，槲皮素二水物在64、32和16 μg/mL；黃芩苷在128、64和32 μg/mL濃度下均可以明顯抑制XDRAB生物被膜的形成，4種抗菌藥物分別與其聯用均表現不同程度的協同抗生物被膜作用，其中2 μg/mL的美羅培南聯用64 μg/mL槲皮素對XDRAB生物被膜的形成抑制率高達66.6%，而替加環素與黃芩苷的9個濃度組合均能夠顯著抑制XDRAB生物被膜的形成，聯用效果均優于替加環素、黃芩苷單獨用藥，在0.015625 μg/mL替加環素與32 μg/mL黃芩苷的濃度組合下，藥物劑量最小。有研究表明，黃芩苷通過劑量依賴性抑制腐生鏈球菌中msrA基因的轉錄水平，從而抑制生物被膜的形成[18]。Du Z等[19]研究表明黃芩苷在亞抑菌濃度下有效阻止了金黃色葡萄球菌生物被膜的形成。Peng等[20]研究結果顯示黃芩苷通過干擾禽致病性大腸埃希菌(apeC)群體感應系統、降低lsrB和lsrK等毒力基因表達從而抑制生物被膜的形成。Memariani[21]的綜述中指出槲皮素通過降低大腸埃希菌rpoS的表達從而影響大腸埃希菌生物被膜的成熟。Aygül等[22]研究認為槲皮素對奇異變形桿菌可能通過抑制群體感應系統調節基因、編碼調節蛋白flhDC從而抑制生物被膜的形成。本課題組前期實驗已經證明替加環素與黃芩苷聯合對抗XDRAB的協同抗菌效應為100%，本實驗進一步證明替加環素與黃芩苷聯合應用可協同抑制XDRAB生物被膜形成，抗菌藥物聯合中藥單體通過協同抗菌+協同抗生物被膜的雙重作用，實現雙靶標對抗XDRAB的耐藥性問題，降低了替加環素和黃芩苷單一藥物的使用劑量，可有效預防XDRAB對替加環素產生耐藥性，為防控泛耐藥及全耐藥鮑曼不動桿菌感染提供了新的治療方案，為新型抗菌藥物聯合中藥單體復方制劑的研制提供了實驗數據，具有一定參考價值。