木本植物不定根發生機制研究進展

苗大鵬，賈瑞瑞，李勝皓，席 爍，朱 葛，文書生

（南京林業大學 風景園林學院，江蘇 南京 210037）

不定根是指從植物莖或葉等非中柱鞘組織產生的根。不定根發生既是植物器官分化的重要理論問題，又關系到無性繁殖和完整植株的再生。多數木本植物不定根發生難度較大，從而阻礙了無性繁殖技術的應用，尤其是制約了諸多果樹、林木和木本花卉的工廠化育苗。因此，探究木本植物不定根發生機理是突破無性繁殖技術瓶頸的迫切需求。木本植物不定根發生機理的研究始于對不定根發生過程的解剖觀察，通過顯微觀察解析了不定根發生的類型和過程，可為深入的機制研究奠定形態學基礎[1]。隨著生根過程中激素、酶等物質的變化規律及調控機制的深入研究，生理生化水平上的不定根發生相關理論日益完善[2-4]。近年來，植物分子生物學技術的高速發展有力地推動了木本植物不定根發生的分子機制研究，目前已克隆出多個參與生長素合成代謝的相關基因[5]，并鑒定出諸多參與不定根形成的轉錄因子[6]以及微小核糖核酸[microRNA(miRNA)][7]等，極大地豐富了木本植物不定根發生機制的內容。本研究從解剖學、生理學以及分子生物學這3個層面，系統綜述了木本植物不定根發生機制研究進展，以期為解析木本植物不定根發生機制提供理論依據。

1 木本植物不定根發生的解剖學研究

1.1 木本植物不定根發生類型

1.1.1 依據不定根原基形成時間劃分 依據根原基形成時間不同，可將不定根分為潛伏根原基型和誘生根原基型[8]。潛伏根原基型的根原基在外植體離體前便已產生并一直處于休眠狀態，離體后在適宜條件下打破休眠，發育形成不定根，通常這種類型的植物不定根發生難度小，例如南林895楊Populus×euramericana‘Nanlin 895’[9]、冬青Ilex chinensis[10]等。誘生根原基型的根原基形成需要適宜的環境條件誘導，發生有2種途徑：①誘導組織內薄壁細胞恢復分生能力進而分化出根原基，然后形成不定根；②在外植體基部先分化出一部分具有旺盛分裂能力的愈傷組織，再由愈傷組織分化出根原基，進而形成不定根。目前，生根難度較大的木本植物通常屬于誘生根原基型，例如銀杏Ginkgo biloba[11]、牡丹‘太平紅’Paeonia suffruticosa‘Taipinghong’[12]等。

1.1.2 依據不定根原基形成部位劃分 不同木本植物的不定根發生部位存在差異，可發生根原基的部位包括皮層、韌皮部、形成層、髓射線、木質部和愈傷組織。依據根原基形成部位不同，可將木本植物不定根分為3種類型：①皮部生根型。指在皮層、韌皮部、形成層、髓射線、木質部等組織內部產生根原基，例如銀杏[11]、榿木Alnus cremastogyne[13]。②愈傷組織生根型。指在愈傷組織中產生根原基進而形成不定根，愈傷組織產生是生根的前提，例如矮紫衫Taxus cuspidatavar.nana[14]、四合木Tetraena mongolica[15]。然而，屬于該生根類型的木本植物通常生根率較低且生根質量不高，這主要是由于一方面愈傷組織的形成會消耗大量營養物質，且老化的愈傷組織誘導生根難度較大；另一方面存在根與莖的維管組織連接不通暢的現象，繼而導致根無法吸收水分和養分，此類為無效根。③混合生根型。在皮層、形成層等組織以及基部愈傷組織內均可產生根原基，例如牡丹‘正午’Paeonia×lemoinei‘High Noon’[16]、桃Amygdalus persica[17]、側柏Platycladus orientalis[18]等。

1.2 木本植物不定根發生過程

根據木本植物不定根發生過程中的組織形態變化，將生根過程分為3個時期[12,19-20]：①脫分化期。該階段薄壁細胞經過脫分化轉變為代謝旺盛的胚性細胞，形成潛在的根原始點。②誘導期。該階段主要特征是根原基的誘導形成。脫分化細胞經過刺激開始細胞分裂，形成分生組織細胞群，后進一步形成可見根原基。③分化期。該階段根原基不斷生長，細胞分化出現分層現象。根原基頂端產生多層根冠細胞并繼續分裂分化成根尖，后方分生組織細胞逐漸延長形成維管組織，并與原組織中的維管束連接起來，最終根原基伸出表皮層，形成不定根。此外，不同木本植物的生根節點持續時間存在差異，例如牡丹‘太平紅’[12]生根誘導3 d后維管束中出現根原基，12 d后根原基分化伸長并逐漸突破表皮，而海棠果Calophyllum inophyllum[19]扦插10 d后維管射線薄壁細胞才恢復分生能力，15 d達到根原基發育的高峰期。因此，通過解剖觀察對生根階段進行劃分，是木本植物不定根發生機制研究的前提和基礎。

2 木本植物不定根發生的生理學機制研究

2.1 激素

2.1.1 生長素類 多數木本植物不定根發生依賴外源生長素類物質誘導，常用外源生長素種類包括吲哚乙酸(IAA)、吲哚丁酸(IBA)、萘乙酸(NAA)，其主要通過調控內源IAA含量來影響不定根發生。研究表明：內源IAA是促進不定根發生的主要激素，它對根原基誘導、愈傷組織形成以及根伸長均起著重要作用[21]。歐陽芳群等[22]和王青等[23]采用酶聯免疫吸附法，對歐洲云杉Picea abies與麻楝Chukrasia tabularis不定根發生過程中的內源IAA含量進行測定，發現IAA含量在根原基誘導期迅速上升，并且峰值與根原基出現的高峰期基本一致，至不定根伸出表皮后其含量降低。尚文倩等[24]和de ALMEIDA等[25]進一步通過免疫組織定位法對牡丹‘鳳丹白’Paeonia ostii‘Fengdanbai’與桉Eucalyptus robusta不定根發生過程中的內源IAA進行定位，發現生根誘導開始時IAA主要分布在維管組織中，隨著根原基的出現和發育，維管組織中的IAA信號逐漸減弱，根原基成為IAA分布中心。這些結果證實了IAA在根原基發端位置的積累是不定根發生的重要基礎。此外，IAA不僅自身對生根起到促進作用，還能通過與其他內源激素間的互作，來調控不定根發生，例如內源IAA的運輸受到脫落酸抑制，內源IAA含量過高能夠誘導乙烯的產生，從而對生根產生抑制作用[26]。

2.1.2 細胞分裂素類 植物體內天然存在的細胞分裂素類 (CTKs)主要有玉米素核苷 (ZR)、玉米素(ZT)、異戊烯腺苷(iPA)等，其中ZR在木本植物不定根發生中的作用得到廣泛研究。已有研究證實：在牡丹‘太平紅’[12]、杜鵑‘紫蝴蝶’Rhododendron pulchurum‘Zihudie’[27]等植物的生根過程中，不定根脫分化期由于插穗處于離體初期，ZR的供應路線被切斷，而其仍被正常消耗，因此ZR含量降低，一段時間后插穗自身開始合成ZR，其含量開始逐漸增加，在誘導期和分化期呈上升趨勢，有利于增加細胞數量、提高細胞分裂速度，繼而促進根原基的形成和生長。此外，內源細胞分裂素(CTK)和IAA的相對含量與根和芽的形成有關，CTK作為IAA的抑制劑，兩者在生根過程中發揮著拮抗作用[28]。內源IAA/CTK值高，有利于不定根發生，而值低則利于誘導芽分化，但不利于根的誘導，例如白皮松Pinus bungeana[29]插穗和蘋果Malus pumila[30]組培苗的生根率與IAA/CTK均呈正相關。

2.1.3 赤霉素類 目前，關于赤霉素類(GAs)對木本植物不定根發生的作用仍存在較大爭議。部分學者認為內源赤霉素(GA)對不定根發生起促進作用，例如GA4含量增加有利于落葉松Larix gmelinii插穗愈傷組織形成，繼而促進愈傷組織中產生不定根[31]。然而，更多研究發現：內源GA抑制不定根發生，例如內源GA3含量與山杏Armeniaca sibirica[32]插穗的生根率呈負相關。BRIAN等[33]認為：內源GA對不定根發生主要有抑制作用，一方面GA抑制不定根原基細胞分裂，另一方面阻礙IAA對不定根的誘導。因此，內源GA和IAA的相對含量對不定根發生具有重要調控作用，IAA/GA值高，利于不定根發生[3]。綜上，有關內源GA的種類和含量對不定根發生的作用及機制，仍有待進一步研究。

2.1.4 脫落酸 內源脫落酸(ABA)對不定根發生具有抑制作用，例如內源ABA含量高的毛白楊Populus tomentosa硬枝插穗生根能力低[34]。在麻楝[23]、山杏[32]等不定根發生過程中內源ABA含量呈動態變化，表現為脫分化期插穗受脫離母體刺激，ABA含量短暫上升，以提高插穗抗逆性，降低逆境對插穗的損傷，但是ABA含量過高會抑制根原基發育和不定根的伸長，因此當植株適應逆境后，ABA含量在脫分化后期下降并在誘導期持續下降，分化期含量低且穩定。然而，也有研究者認為：不能單純將ABA視為抑制生根的激素，并提出將內源IAA/ABA值作為植物生根能力的衡量標準，且與生根能力呈正相關，例如毛白楊[35]、馬尾松Pinus massoniana[36]、雜種鵝掌楸Liriodendron chinense×L.tulipifera[37]等生根能力強的插穗或組培苗中內源IAA/ABA值較高。此外，王清民等[38]和董勝君等[32]分別在核桃Juglans regia和山杏的生根研究中發現：IAA/ABA值呈先升后降的趨勢，在根誘導期達到峰值，并推測高IAA/ABA值有利于根原基的形成。

2.1.5 其他激素 除了上述內源激素外，乙烯 (ET)、油菜素內酯 (BRs)、茉莉素 (JAs)、水楊酸 (SA)等同樣參與木本植物不定根發生。乙烯(ET)是不定根發生的刺激因子，乙烯合成受到內源IAA調控，同時也可以調節IAA的運輸和信號傳導[39]。ET對生根的影響主要體現在與IAA的相互作用中，兩者對不定根發生具有拮抗作用，但對根毛的起始和伸長具有協同作用[40]。BRs是一種促進細胞伸長和分裂的甾體激素，較低的內源BRs能夠促進根的生長，較高的內源BRs則起抑制作用[41]。此外，BRs與內源IAA間的互作，能夠促進側根的生長[42]。JAs是一種脅迫響應激素，逆境條件能夠促使JAs快速合成，并對生根產生影響[43]。內源JAs對不定根發生存在負調控，內源IAA能夠控制JAs平衡，兩者互作調控生根[44]。SA同樣是一種脅迫響應激素。AGULLó-ANTóN等[45]研究發現：不定根發生誘導期內源SA水平明顯上升，認為高含量的SA有利于根原基的形成。

2.2 生根關聯酶

2.2.1 過氧化物酶(POD) POD能夠氧化內源IAA并促進酚類物質合成木質素，被認為是一種生根潛力指標，如POD活性較高的胡楊Populus euphratica插穗具有較強的生根能力[46]。在蘋果[47]、國槐Sophora japonica[48]、合歡Albizia julibrissin[49]等生根過程中均有發現，不定根發生分化期POD活性顯著上升，較高的POD活性促使根原基細胞內的木質素合成增加，有利于根原基的伸長和根的木質化。

2.2.2 多酚氧化酶(PPO) PPO是植物體內的一種含銅氧化酶，植物生根能力與PPO活性呈正相關，例如在尾葉桉Eucalyptus urophylla[50]的生根研究中發現：易生根株系中PPO活性高于難生根株系。在楸樹Catalpa bungei[51]和牡丹‘鳳丹白’[24]中，PPO活性在不定根發生脫分化期和誘導期逐漸升高并達到峰值。這主要是由于PPO能夠催化酚類物質與IAA結合，形成一種生根輔助因子‘IAA-酚酸復合物’，繼而促進不定根發生[52]。

2.2.3 吲哚乙酸氧化酶(IAAO) IAAO主要通過降解IAA來調節內源IAA水平，從而調控不定根發生[53]。木本植物不定根發生過程中IAAO活性呈動態變化，在杜梨Pyrus betulifolia[54]、毛白楊[55]等的生根研究中發現：IAAO活性呈“升高—降低—升高”的變化趨勢，脫分化期的IAAO活性高，能夠適量降低IAA含量，使得植物內部環境適于薄壁細胞脫分化和愈傷組織的誘導。此外，大量研究已證實：生根過程中IAAO活性過高將抑制植物不定根發生，例如在歐榛Corylus avellana[56]和含笑‘香妃’Michelia figo‘Xiangfei’[57]的生根研究中發現：IAAO活性過高的插穗生根率低。

2.3 其他物質

除激素和酶外，植物體內的營養物質、酚類物質、多胺以及丙二醛(MDA)等對不定根發生也有重要調控作用。木本植物不定根發生過程中的能量主要源于體內可溶性糖、淀粉和可溶性蛋白質等營養物質分解。其中，可溶性糖是不定根發生的直接能量來源，其含量與生根率呈正相關，例如可溶性糖含量高的白皮松插穗生根率更高[29]；淀粉是不定根發生的間接能量來源，牡丹‘鳳丹白’[58]等多種木本植物的生根研究表明：不定根發生過程中淀粉含量總體呈下降趨勢；可溶性蛋白質是重要的滲透調節物質與營養物質，其水解產物能夠降低原生質的黏質，有利于根原基的誘導和形成[59]。酚類物質是植物主要次生代謝產物之一，易導致插穗或試管苗莖基部褐化，從而抑制木本植物不定根發生[60]。多胺主要包括腐胺(Put)、亞精胺(Spd)和精胺(Spm)，它對木本植物不定根發生有促進作用，例如橄欖Olea europaea插條內多胺含量增加，生根能力提高[61]。多胺還與內源激素存在密切關系，例如杜梨組培苗生根過程中，Spm與ZR呈負相關，Spd與IAA、ABA呈正相關，Put與GA、IAA、ABA呈正相關[54]。此外，CRISTOFORI等[62]認為：IAA與多胺結合能夠促進不定根發生。MDA是膜脂被氧化的產物，是衡量植物抗氧化能力的重要指標，對垂枝櫻花Cerasus subhirtellavar.pendula[63]等木本植物不定根存在毒害作用。

3 木本植物不定根發生的分子機制研究

3.1 基因

目前，在木本植物不定根發生的分子機制研究領域，已有部分直接或間接調控生根的功能基因被鑒定與分析(表1)。例如ARRO-1被認為是木本植物不定根發生的分子標記之一，蘋果生根的研究中發現：在外源生長素IAA和IBA誘導下或者復壯培養后ARRO-1上調表達，在根誘導期逐漸上升達到峰值，植株生根率提高，而RNAi-ARRO-1構建體轉化的植株，ARRO-1表達水平降低，生根能力變弱，對外源生長素更敏感。ARRO-1可能作為一種生長素觸發生根特異性的基因聯合體發揮作用，主要通過調節內源生長素的動態平衡，以促進不定根發生[64]。賀丹等[65]在牡丹‘烏龍捧盛’中同樣克隆得到PsARRO-1，并發現PsARRO-1表達量在生根初期就開始快速上升，根原基形成后達峰值，之后迅速回落，說明PsARRO-1與根原基的形成密切相關。此外，還有諸如LRP1、PRP1,2、TIR1和YUCCA基因以及PIN和GH3基因家族成員在部分木本植物中均有鑒定。

表1 木本植物不定根發生相關調控因子Table 1 Regulation factors related to adventitious root in woody species

3.2 轉錄因子

轉錄因子(transcription factor，TF)是能直接或間接與順式調控元件起作用而影響基因轉錄的蛋白質因子。目前，已發現多個轉錄因子家族的成員參與調控木本植物不定根發生，包括植物特有的WOX家族和GRAs家族以及生長素信號轉導相關的ARFs家族等(表1)。例如屬于AP2/EREBP家族的PtAIL1，過量表達PtAIL1的轉基因楊樹不定根數量大大增加，而PtAIL1干擾株的不定根形成數量減少、形成時間延遲，推測PtAIL1為毛果楊不定根發育早期階段促進根原基形成的正向調控轉錄因子[72]。從魯桑[76]中克隆得到涉及不定根發生的3個編碼MYB家族轉錄因子的典型基因，分別命名為MmMYB1、MmMYB2、MmMYB3，表明MmMYB1通過調節AHLs通路繼而影響生長素和細胞分裂素的合成，抑制MmMYB2表達會阻礙類黃酮的合成從而促進生根，MmMYB3通過調節內源赤霉素水平從而影響不定根發生。

3.3 微小核糖核酸 (microRNA)

microRNA (miRNA)是一類內源性非編碼RNA，其靶基因多為轉錄因子，主要參與植物的生長發育、信號轉導及響應逆境脅迫等生理過程。近年來，隨著高通量測序的發展和生物信息學水平的提高，在一些木本植物中發現miRNA對不定根發生具有一定的調控作用(表1)。例如在蘋果砧木小金海棠[7]不定根發生的研究中，miR156在生根能力強的插穗中有更高的表達水平，外源生長素誘導miR156高表達，通過下調轉錄因子MxSPL26的水平，促進不定根原基的啟動和發育，繼而顯著提高生根率與生根速度。從蘋果砧木圓葉海棠‘M26’、‘T337’和‘SH6’[78]中均克隆得到mdm-miR160。研究發現：mdm-miR160能夠負調控MdARF16和MdARF17的表達，對不定根發生具有抑制作用，通過IBA誘導生根可以減輕mdm-miR160的抑制效果。此外，對轉基因毛白楊[80]的生根研究發現：miR319a通過靶向調控轉錄因子TCPs，影響了生長素信號轉導，繼而負調控楊樹不定根發生。

4 結語

綜上可見，木本植物不定根發生機制研究主要集中于解剖學和生理學層面，研究結果揭示了木本植物不定根的來源以及發生過程，闡明了不定根發生過程中生理生化方面的變化規律。此外，初步解析了木本植物不定根發生過程中涉及的代謝通路，并進一步鑒定獲得了多個調控不定根發生的基因、轉錄因子以及非編碼的miRNA。

木本植物不定根發生機制的研究正由簡單的解剖學和生理學逐步深入到基因和蛋白的調控層面。雖然在分子水平上已經取得了一定進展，但總體仍處于初步探究階段。后續研究可以從3個方面展開：①以建立植株再生體系為基礎，推進基因組測序工作，聯合多組學研究并結合RNA干擾等現代分子生物技術，深入探究木本植物不定根發生機制。②深入分析相關基因在木本植物中的調控機制，并將其應用于解決生根問題。③注重向表觀遺傳調控領域擴展，多維度、全方位地構建木本植物不定根發生相關的基因調控網絡。