長柱紫莖的花部特征與繁育系統(tǒng)

李清香，張明如，顧翠花，李銅攀，萬 琦，高 磊，張婷宇，趙楠楠，蔡益杭

（1.浙江農(nóng)林大學(xué) 風(fēng)景園林與建筑學(xué)院，浙江 杭州 311300；2.浙江農(nóng)林大學(xué) 浙江省園林植物種質(zhì)創(chuàng)新與利用重點實驗室，浙江 杭州 311300；3.浙江農(nóng)林大學(xué) 南方園林植物種質(zhì)創(chuàng)新與利用國家林業(yè)和草原局重點實驗室，浙江 杭州 311300）

植物繁育系統(tǒng)是指直接影響后代遺傳組成的所有有性特征，包括花部特征、開放式樣、花各性器官壽命長短，自交親和程度與交配系統(tǒng)等[1]。作為植物重要的繁殖器官，花內(nèi)部器官發(fā)育和外部形態(tài)特征與植物的傳粉效率、交配方式密不可分。因此，系統(tǒng)研究植物的花部特征和繁育系統(tǒng)有助于理解其繁殖過程限制因子的生態(tài)效應(yīng)，對生物多樣性保育具有重要價值[2]。

長柱紫莖Stewartia rostrata為山茶科Theaceae紫莖屬Stewartia的落葉灌木或小喬木，主要分布于浙江西北部、安徽南部及西部、江西北部及湖南東部，地理分布較為狹窄。花白繁茂，花瓣多帶有形狀、顏色不一的紅斑，樹干造型多樣；集中開花，觀賞價值極高，在園林綠地應(yīng)用潛力巨大。近年來，由于人類干擾頻繁和自然環(huán)境惡化，長柱紫莖的野外生存受到極大的威脅，迫切需要開展保育生物學(xué)系列研究。實地調(diào)查發(fā)現(xiàn)：盡管盛花期花量極大，但長柱紫莖群落下層幼苗稀少，天然更新不良，與同屬的瀕危植物紫莖Stewartia sinensis衰退型種群結(jié)構(gòu)類似[3-4]。紫莖屬木本植物幼苗幼樹稀少，其原因可能涉及群落環(huán)境(如植物間競爭排斥關(guān)系、植物與傳粉昆蟲關(guān)系)與非生物環(huán)境(如陰雨天氣的出現(xiàn))的限制作用、種子發(fā)芽受阻、花部特征與繁育系統(tǒng)影響傳粉過程造成種子發(fā)育質(zhì)量不良等。已有研究表明[5]：紫莖的種子發(fā)芽率無論是實驗室還是圃地最高僅為10%，甚至為0。長柱紫莖和紫莖在同屬中親緣關(guān)系最為接近，形態(tài)特征、生物學(xué)特性有許多相近之處，推測此2個種的繁育過程受阻有相似之處。

目前，紫莖屬已有研究集中于群落結(jié)構(gòu)[4]、繁殖技術(shù)[5]、種子發(fā)芽[6]、植物種分類[7]及系統(tǒng)發(fā)育[8]等方面，未發(fā)現(xiàn)有關(guān)紫莖屬特別是長柱紫莖花部特征、傳粉過程的限制因素、繁育系統(tǒng)所屬類型等的報道。繁育系統(tǒng)類型是否對長柱紫莖結(jié)實率和種子敗育產(chǎn)生影響，其衰退型種群結(jié)構(gòu)是否與其繁育系統(tǒng)類型有關(guān)，生境自然條件變化是否影響傳粉昆蟲的行為，從而影響繁殖成功率；這些都是當(dāng)前亟待深入研究的科學(xué)問題。為此，本研究以長柱紫莖為材料，通過觀察(測)長柱紫莖花部特征和昆蟲訪花特性、測定花粉活力和柱頭可授性、測算雜交指數(shù)和花粉胚珠比等，深入揭示其繁殖過程限制因素的影響，為紫莖屬種群更新、人工擴(kuò)繁及園林推廣應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)，為紫莖屬的瀕危植物致瀕機(jī)制研究提供思路。

1 材料與方法

1.1 試驗區(qū)概況

研究地浙江農(nóng)林大學(xué)東湖校區(qū) (30°15′28″N，119°43′35″E)海拔 101.3 m，屬于中亞熱帶季風(fēng)氣候，四季分明，年平均氣溫為16.1 ℃，全年降水量為1 628.6 mm，年降水日為154 d，無霜期為236 d。研究地周邊地帶性植被為亞熱帶常綠闊葉林。選擇3 a生長柱紫莖為材料，株高為2.5～3.0 m。研究時間為2021年4—6月。

1.2 開花動態(tài)及花部特征觀察 (測)

1.2.1 開花動態(tài) 于花蕾期隨機(jī)選取30朵花掛牌標(biāo)記，每天16:00觀察直至單花開放；開花當(dāng)天及開花第2天8:00—18:00連續(xù)觀察，每隔2 h定點觀測1次并拍照，之后每天觀測1次。觀察花的開花動態(tài)，記錄單花結(jié)構(gòu)、花朵大小和形狀、雄雌蕊位置形態(tài)變化、花瓣顏色、苞片顏色、萼片顏色、花藥開裂時間等，直至花部萎蔫[9]。

1.2.2 花部形態(tài)特征 于盛花期，在15株植株上隨機(jī)選取30朵發(fā)育良好的花，測定花部結(jié)構(gòu)參數(shù)，記錄花冠直徑、苞片長寬、花瓣長寬、萼片長寬、子房直徑及長度等數(shù)據(jù)。

1.3 花粉活力測定

1.3.1 花粉 離體 培 養(yǎng) 隨 機(jī)采 集當(dāng) 天開 放花 朵 的花 粉，設(shè)置 5 種蔗 糖質(zhì) 量濃 度 (0、5、10、15、20 g·L-1)處理，于25 ℃下培養(yǎng)6 h后觀察并統(tǒng)計花粉萌發(fā)率。

1.3.2 花粉活力測定 隨機(jī)采集當(dāng)天開放花朵的花粉，分別采用 2，3，5-氯化三苯基四氮唑 (TTC)染色法、碘-碘化鉀(I2-KI)染色法，篩選最適蔗糖質(zhì)量濃度培養(yǎng)6 h后測定花粉活力，以加熱致死的花粉作對照，每個處理3次重復(fù)。在光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取3個視野統(tǒng)計著色花粉數(shù)，每個視野花粉數(shù)不少于100 粒[10]。

1.3.3 花粉萌發(fā)率測定 選取開放前1 d至開放后第3天的花朵，每個階段選取10朵，測定最適蔗糖質(zhì)量濃度培養(yǎng)下的花粉活力，以加熱致死的花粉為對照。在光學(xué)顯微鏡下觀察統(tǒng)計花粉萌發(fā)率，每視野內(nèi)花粉數(shù)不少于100粒。

1.4 柱頭可授性測定

隨機(jī)選取開放前1 d至開放后7 d的花朵，將柱頭放在凹面載玻片上，完全浸泡于質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%的過氧化氫(H2O2)溶液中，30 min后在體式顯微鏡下觀察，若有氣泡產(chǎn)生則表明柱頭有活性，反之則無[11]。

1.5 花粉胚珠比計算

隨機(jī)選取不同植株的20朵即將開放的花蕾，記錄每朵花的雄蕊數(shù)。隨機(jī)選取1個花藥，用解剖針將花藥搗碎，蒸餾水定容至1 mL，吸取1 μL液體在光學(xué)顯微鏡下統(tǒng)計花粉數(shù)量；每朵花選取3個花藥，重復(fù)3次，取平均數(shù)乘雄蕊數(shù)再乘1 000得出單花花粉量。解剖相對應(yīng)的子房，統(tǒng)計胚珠數(shù)[12]。根據(jù)CRUDEN[13]標(biāo)準(zhǔn)，計算花粉胚珠比(單花花粉總數(shù)/單花胚珠數(shù)，P/O)；并由此判斷長柱紫莖繁育系統(tǒng)類型。

1.6 雜交指數(shù)估算

按照DAFNI[14]標(biāo)準(zhǔn)，通過雜交指數(shù)(OCI)評判繁育系統(tǒng)類型。用游標(biāo)卡尺測定花冠直徑；觀察記錄花藥開裂時間與柱頭可授期，雌雄蕊是否同時成熟；記錄花藥與柱頭之間的相對空間關(guān)系。

1.7 訪花昆蟲觀察

隨機(jī)選擇5株長柱紫莖，于晴天9:00—17:00連續(xù)觀察訪花昆蟲。每株長柱紫莖選擇10朵花，每2 h觀察1次，每天觀察5次，記錄訪花昆蟲的種類和訪花時間[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 開花動態(tài)及花部形態(tài)特征

2.1.1 開花動態(tài) 長柱紫莖居群花期為 5 月初至 5 月中下旬，約 17 d (2021 年 5 月 1—17 日)，單花花期2 d。5月1日該居群的第1朵花開放，5月8日單日開花最多，占總開花數(shù)的15%，達(dá)到盛花期，5月13日進(jìn)入末花期。

長柱紫莖單花開放過程分為花蕾期(苞片、萼片包裹花蕾)、初展期(花藥、柱頭顯露)、盛放期(花瓣平展)、凋落期(花瓣枯萎)及坐果期(子房膨大結(jié)實) 5個過程(圖1)。具體的，①花蕾期(圖1A和B)，苞片、萼片呈綠色，緊緊包裹花蕾。臨近開放時，綠色的苞片和萼片從基部向邊緣轉(zhuǎn)為紫紅色，同時向外伸展，逐漸顯現(xiàn)出花苞。花苞頂部受光影響，呈現(xiàn)紅斑。②初展期(圖1C)，單花花瓣展開，花藥和柱頭顯露，彎曲的花絲慢慢伸展高出柱頭。③盛放期(圖1D)，花瓣完全平展，雄蕊高于柱頭伸展，柱頭反向彎曲，呈5裂。④凋落期(圖1E和F)，花瓣枯萎、脫落，開放24～32 h后，花藥逐漸由橘黃色變?yōu)榈厣ü跇O易掉落，柱頭萎蔫，萼片和苞片逐漸收縮，花朵直徑變小。⑤坐果期(圖1G和H)，子房膨大，萼片和苞片再逐漸展開，由紅色轉(zhuǎn)為綠色，果實由綠色轉(zhuǎn)為棕色，逐漸木質(zhì)化。

圖1 長柱紫莖的開花動態(tài)Figure 1 Flowering dynamics of S. rostrata

2.1.2 花部形態(tài)特征 長柱紫莖的平均單花直徑為 (50.2±11.7) mm (表1)，花瓣 5 枚，白色，邊緣裂狀，有1～3枚花瓣帶紅斑(圖1K)；每花具1對葉狀苞片(圖1J-1)，披針葉形，開花時基部由綠色轉(zhuǎn)為紫紅色；萼片5枚(圖1J-2)；雄蕊50～84枚，長17～19 mm，花絲黃色呈線形，基部連合成短管，花絲的連合處不及花絲長度的1/3(圖1J-4)，花藥橘黃色，干后變?yōu)榈厣淮迫?枚，長14～16 mm，柱頭呈5裂(圖1J-5)，花朵盛開時花絲高于柱頭；子房5室，每室4枚胚珠，稀2～3枚，中軸胎座。

表1 長柱紫莖的花部形態(tài)特征Table 1 Flower characteristics of S. rostrata

2.2 花粉活力測定

2.2.1 花粉離體培養(yǎng)的適宜蔗糖質(zhì)量濃度 在無蔗糖培養(yǎng)基下，長柱紫莖花粉萌發(fā)率僅為13.7%；隨著培養(yǎng)基蔗糖質(zhì)量濃度的增加，花粉萌發(fā)率增大，在15 g·L-1出現(xiàn)峰值，為69.3%。當(dāng)蔗糖質(zhì)量濃度為20 g·L-1時，花粉萌發(fā)率降至33.3%。因此，15 g·L-1的蔗糖培養(yǎng)基為最適培養(yǎng)基(圖2)。

圖2 不同蔗糖質(zhì)量濃度對長柱紫莖花粉活力的影響Figure 2 Effects of different sucrose concentrations on pollen viability

2.2.2 不同方法測定花粉活力 采用I2-KI染色，活力較強的花粉會呈現(xiàn)藍(lán)黑色，但在操作時，易混入雜質(zhì)，視野中觀察到的藍(lán)黑色不夠明顯，不利于計數(shù)。采用TTC染色，有活力的花粉會呈現(xiàn)紅色；但觀察到大部分花粉未變紅，說明TTC染色不利于測定長柱紫莖的花粉活力。因此，TTC染色法和I2-KI染色法均不適合長柱紫莖花粉活力的測定。實際研究中，與TTC染色法和I2-KI染色法相比，花粉離體培養(yǎng)下，花粉會萌發(fā)較長的花粉管，更有利于觀察。

2.2.3 不同開放時間花粉萌發(fā)率 采用 15g·L-1的蔗糖培養(yǎng)基培養(yǎng)花粉，由圖3 可知：開放前 1 d，花粉萌發(fā)率較高，為49.3%，開花當(dāng)天花粉活力最高，為65.0%。之后花粉活力逐漸下降，到第3天，已降至11.7%。

圖3 不同時間下長柱紫莖花粉活力Figure 3 Pollen germination rate of S. rostrata tested in different time

2.3 柱頭可授性

由圖4可知：開放前1 d長柱紫莖花藥尚未開裂，柱頭合攏，呈白色，可授性弱。開放1～2 d，柱頭逐漸張開，具有較強可授性，之后可授性逐漸增強。到第3天柱頭開始萎蔫，由白色轉(zhuǎn)變?yōu)樽攸S色，可授性強。在開放的第4天，柱頭完全展開，向外反卷呈5裂，呈棕黃色、萎蔫皺巴的狀態(tài)，此時花粉活性最強。之后，柱頭可授性逐漸下降，到第7天，柱頭基本失去可授性。

圖4 長柱紫莖開花過程中柱頭可授性Figure 4 Changes in stigma receptivity of S. rostrata during flowering process

2.4 花粉胚珠比

根據(jù)統(tǒng)計結(jié)果，長柱紫莖花粉數(shù)為(1 618 666.7±254 775.4)粒，胚珠數(shù)為 (18.6±2.4)枚，花粉/胚珠比 (P/O)為 2 108.0～195 525.0，平均為 87 025.1。依照CRUDEN的標(biāo)準(zhǔn)，判斷長柱紫莖的繁育系統(tǒng)屬于專性異交。

2.5 雜交指數(shù)測算

依照DAFNI的評判標(biāo)準(zhǔn)，測算長柱紫莖的雜交指數(shù)。長柱紫莖成熟花朵的花冠直徑平均為50.24 mm，大于6 mm，記為3。雌雄蕊在成熟時間上一致，記為0；在花蕾期，長柱紫莖的柱頭高于雄蕊，當(dāng)花朵完全盛開時，雄蕊高于雌蕊，柱頭和花藥存在空間分離，記為1。因此，OCI結(jié)果為4，說明長柱紫莖的繁育類型屬于以異交為主，需要傳粉者，部分自交親和。

2.6 訪花昆蟲觀察

長柱紫莖上觀察到的訪花昆蟲有熊蜂Bombussp.、中華蜜蜂Apis cerana、黑帶食蚜蠅Episyrphus balteatus、葉甲Chrysomelidae和日本弓背蟻Camponotus japonicus等，有效傳粉者主要為熊蜂，其他種類出現(xiàn)頻率低或進(jìn)行無效傳粉(圖5)。長柱紫莖的開花高峰為7:00—11:00，昆蟲的訪花時間也集中在這段時間。黑帶食蚜蠅在同一朵花上同一部位停留超過20 s，舔食花蜜，但數(shù)量較少，傳粉作用不佳(圖5A)。熊蜂單次訪花時間為2～5 s，訪花頻率很高，在較短時間內(nèi)頻繁地在多朵花間逗留。訪花時喜歡頭部向下，整個身體鉆入花冠筒，身上的絨毛黏附花粉量大，與柱頭接觸面積大，可有效傳粉(圖5B)。中華蜜蜂與熊蜂行為相似，但出現(xiàn)頻率不及熊蜂，且體積小，能夠黏附到的花粉少(圖5C)。葉甲外殼光滑，花粉難以黏附。偶見1只在花冠上停留較長時間，與柱頭未進(jìn)行有效接觸，傳粉貢獻(xiàn)小(圖5D)。日本弓背蟻的足部和腹部會黏附花粉，徘徊逗留，偶爾實現(xiàn)有效傳粉(圖5E)。

圖5 長柱紫莖的訪花昆蟲Figure 5 Insect visitors of S. rostrata

3 討論

3.1 花部特征與傳粉適應(yīng)性

花部特征包含花部構(gòu)成(結(jié)構(gòu)、顏色、氣味等)和開放式樣(開花數(shù)目、大小及類型等)，因此可以從花部特征、開放式樣解析植物與傳粉者的生態(tài)依存關(guān)系。植物為了與傳粉者的行為習(xí)慣相適應(yīng)而使其花部形態(tài)結(jié)構(gòu)、顏色等逐步進(jìn)化[16]。對于蜂類，白色和黃色是可見花色。長柱紫莖花冠白色，平均直徑達(dá)(50.2±11.7) mm，花絲黃色，顏色耀眼，同時平展的花冠為傳粉昆蟲提供停靠點，符合蜂媒花特征，此類花部特征與四川牡丹Paeonia decomposita一致[17]。同一物種內(nèi)不同個體或居群間花色差異即花色多態(tài)性，傳粉者的偏好因為花色差異造成訪花頻率的差異[18]。長柱紫莖的白色花瓣上常出現(xiàn)紅色，推測是為適應(yīng)單一的傳粉媒介而進(jìn)化出的特征，以便增加對其他類昆蟲的吸引力，從而提高傳粉效率[19]。

在強大的選擇壓力下，很多植物形成了“大量、集中開放”的開花模式，有利于吸引訪花昆蟲在短時間大量、密集表達(dá)訪花行為，從而增加傳粉機(jī)會[20]。長柱紫莖花期為5—6月，屬于浙江的梅雨季節(jié)，陰雨天氣極大地減少了傳粉昆蟲的活動。長柱紫莖集中開花，持續(xù)開花時間短，日均開花數(shù)量多，有利于提高繁殖成功率。此開花式樣呈現(xiàn)的特征與山茶科Theaceae瀕危植物金花茶Camellia nitidissima的研究結(jié)果一致[21]。長柱紫莖的有效傳粉者主要為熊蜂，在陰雨天氣熊蜂頻繁地在同一植株上訪花，且開花植株又少，原生境植株間相距較遠(yuǎn)，不利于花粉在植株間傳播，結(jié)果增加同株異花授粉的可能性，降低接受花粉的質(zhì)量，從而影響長柱紫莖的結(jié)實率。

3.2 繁育系統(tǒng)

參照CRUDEN[13]所述標(biāo)準(zhǔn)，長柱紫莖的繁育系統(tǒng)為專性異交。長柱紫莖P/O極高，達(dá)87 025.1，意味著長柱紫莖更加趨向于遠(yuǎn)交；但根據(jù)DAFNI[14]的標(biāo)準(zhǔn)，長柱紫莖OCI為4，判斷其繁育系統(tǒng)為異交為主，部分自交親和，需要傳粉者。長柱紫莖開花后雄蕊逐漸伸長，最后花藥高于柱頭，且花蕾期有花藥散粉現(xiàn)象，因此長柱紫莖的花部特征增加了自花授粉的可能性。在自然界中，絕大部分被子植物傾向于自交與異交結(jié)合的混合交配模式，只有極少數(shù)利用單一交配模式完成授粉[22]。綜合得出：長柱紫莖的繁育系統(tǒng)屬于傾向于異交的混合交配系統(tǒng)，當(dāng)其異株(異花)授粉受阻時，可表現(xiàn)為自交親和，自交是長柱紫莖適應(yīng)長期陰雨環(huán)境的繁殖保障策略，此種混合交配系統(tǒng)與流蘇樹Chionanthus retusus相似[23]。

有效的傳粉過程包含大量有活力的花粉、可授期的柱頭及有效傳粉媒介[24]三大要素。長柱紫莖平均雄蕊數(shù)為(64.9±11.8)枚，單花平均花粉量多達(dá)(1 618 666.7±254 775.4)粒，為傳粉昆蟲提供豐厚的報酬，且花粉黏附力強，易被傳粉昆蟲攜帶，為異交授粉提供了充足的物質(zhì)保障，故花粉數(shù)量不是其繁殖受限的原因。柱頭可授期長，達(dá)7 d，在第3和第4天達(dá)到最強活力，為實施人工授粉的最佳時期。柱頭5裂增加傳粉表面積和柱頭可授期長為異花授粉提供了基本保障，有利于提高傳粉效率和結(jié)實率，此現(xiàn)象與陳雄偉等[25]觀測紫背天葵Begonia fimbristipula的結(jié)果一致。當(dāng)天開花的花朵保持最強活力(65.0%)，隨著開花時間增加，花粉活力顯著下降，到第2天僅38.3%，第3天降至11.7%。觀察發(fā)現(xiàn)長柱紫莖大多數(shù)花朵壽命很短，開花損失率高，花粉強活力和較強柱頭可授性僅1 d的相遇期，嚴(yán)重影響花朵的傳粉效率。無論授粉與否，長柱紫莖在開花24～32 h后，花冠和雄蕊都存在易脫落的現(xiàn)象，脫落后花粉迅速失活，大大減少了受精的可能性[26]。推測已授粉花朵脫落可能與營養(yǎng)資源限制有關(guān)，減少繁殖成本[27]；未授粉花朵可能通過短壽命減小花展示程度，從而減少同株異花傳粉的概率[28]。

P/O是衡量植物對雄性資源分配量的指標(biāo)[29]，高P/O值可能是對傳粉效率低造成柱頭接受的花粉量少、質(zhì)量低的補償[30]，多樣化的傳粉媒介有利于提高授粉成功率。長柱紫莖授粉受限可能與傳粉者的種類、數(shù)量有關(guān)。長柱紫莖的主要傳粉昆蟲熊蜂，飛行距離遠(yuǎn)，訪花頻率高，多朵花之間穿梭，攜帶花粉量大，有效地進(jìn)行異花傳粉，但其他昆蟲傳粉效率較低，有效傳粉媒介單一。長柱紫莖花粉離開花朵后迅速失活，不利于傳粉昆蟲遠(yuǎn)距離完成植株之間的傳粉，因此居群間的基因不能充分交流[31]。

4 結(jié)論

綜上所述，長柱紫莖花冠白色和花絲黃色，與蜂類傳粉特性相適應(yīng)，為典型蜂媒花；傳粉受陰雨天氣影響，集中開花模式是對惡劣天氣的有效適應(yīng)，但傳粉昆蟲單一。開花24～32 h，花冠和雄蕊都極易脫落從而導(dǎo)致花粉迅速失活。以上因素限制了長柱紫莖的繁殖。集中開花模式、花粉量大、柱頭5裂及可授期長等花部特征是長柱紫莖維持繁殖成功的基本保障。長柱紫莖繁育系統(tǒng)屬于以異交為主，需要傳粉者，當(dāng)其授粉受阻時，可表現(xiàn)為自交親和，自交是長柱紫莖適應(yīng)長期陰雨天氣的繁殖策略。