金昭膠囊對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠的保護(hù)作用

賈 嵐 孟智睿 魏益謙 李 麗 邵紫萱 高學(xué)敏 王景霞

(北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京，100029)

近年來隨著人民生活水平的提高和生活方式的改變，對(duì)酒類的消費(fèi)也日益增多，過量飲酒已經(jīng)成為全世界范圍內(nèi)極受關(guān)注的社會(huì)公共問題。一次大量飲酒會(huì)引發(fā)急性乙醇中毒，對(duì)機(jī)體健康產(chǎn)生嚴(yán)重危害[1]。人體攝入的乙醇90%在肝臟代謝，乙醇代謝不暢是造成酒精性肝病的主要原因[2]。中醫(yī)學(xué)中沒有“酒精性肝病”之名，但在中醫(yī)學(xué)古文獻(xiàn)中有“傷酒”“酒痞”“酒疸”“脅痛”等相關(guān)記載。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為過量飲酒，可致濕熱有毒之邪困遏脾胃，脾胃失和，胃失降濁，則氣機(jī)壅滯；或損傷肝膽，致肝失疏泄，肝膽氣機(jī)逆亂，病位主要在肝和胃[3]。

目前，國內(nèi)外對(duì)解酒保健藥的研發(fā)頗多，但尚無明確療效的藥物面向臨床[4-7]。金昭膠囊由藥食兩用的葛根、枳椇子、梔子組成。其中葛根味辛、甘，性涼，歸脾胃經(jīng)。《千金方》載其“葛根主解酒毒”，能升舉脾胃清陽之氣，故為方中君藥。枳椇子為臣藥，與葛根同用，通利小便，加強(qiáng)酒毒排解，達(dá)到協(xié)同增效之能。梔子在配方中為佐藥，可使肝、膽、脾胃酒毒從小便而出，達(dá)到很好的解酒毒利肝膽作用[8-9]。金昭膠囊將3種藥食同源的中藥合用，既能解毒保肝，改善臨床癥狀，同時(shí)具有良好的安全性。現(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示，葛根可治療酒精性中毒[10]。高學(xué)清[11]發(fā)現(xiàn)葛根提取物能夠有效抑制血清中GOT和GPT活性，同時(shí)能夠減輕肝細(xì)胞的腫脹。枳椇子水提取物具有顯著的解酒毒，抗肝纖維化，抗氧化等作用[12]。梔子具有保肝利膽的作用[13]。以上研究均為金昭膠囊防治酒精性肝、胃損傷提供了藥理學(xué)方面的科學(xué)支撐。

本研究主要挖掘其產(chǎn)品優(yōu)勢，探究其對(duì)酒精性肝損傷的保護(hù)機(jī)制，提升科技含量。通過研究金昭膠囊對(duì)急性酒精性肝損傷模型小鼠醉酒狀態(tài)、肝功、肝脂質(zhì)及乙醇代謝酶、肝組織和胃組織抗氧化酶活性等指標(biāo)的影響，對(duì)金昭膠囊對(duì)急性酒精性肝損傷的保護(hù)作用及機(jī)制進(jìn)行初步探討，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 選取無特定病原體(Specific Pathogen Free，SPF)級(jí)雄性美國癌癥研究所(Institute of Cancer Research，ICR)小鼠，周齡8～10周，體質(zhì)量為25～35 g，由北京斯貝福實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司提供，許可證號(hào)為SCXK(京)2016-0002，動(dòng)物倫理審批號(hào)BUCM-4-2019091801-3074，動(dòng)物飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室的屏障環(huán)境中，室溫為(24±2)℃，空氣相對(duì)濕度為(50±10)%，光照12 h/d，自由飲水。

1.1.2 藥物 金昭膠囊[無限極(中國)有限公司，批號(hào)：17C04ADB01]，規(guī)格：0.35 g/粒。茵梔黃顆粒(魯南厚普制藥有限公司，批號(hào)：Z20030028)，氯化鈉(常州市海拓實(shí)驗(yàn)儀器有限公司，批號(hào)：20160704)。

1.1.3 試劑與儀器 氯化鈉(常州市海拓實(shí)驗(yàn)儀器有限公司，批號(hào)：20160704)；谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Glutamic-pyruvic Transaminase,GPT)試劑盒，批號(hào)：2019001，谷草轉(zhuǎn)氨酶(Glutamic-oxaloacetic Transaminase,GOT)試劑盒，批號(hào)：2019002；均購于長春匯力；三酰甘油(triacylglycerol，TG)試劑盒，批號(hào)：20190605；總膽固醇(Total Cholesterol,TC)試劑盒，批號(hào)：20190605；丙二醛(malondialdehyde,MDA)試劑盒，批號(hào)：20190510；超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)試劑盒，批號(hào)：20190327；還原型谷胱甘肽(glutathion,GSH)試劑盒，批號(hào)：20190529；過氧化氫酶(Catalase.CAT)試劑盒，批號(hào)：20190528；均購于南京建成科技有限公司；MDA試劑盒，批號(hào)：20190525；SOD試劑盒，批號(hào)：20190701；一氧化氮(Nitric Oxide，NO)試劑盒，批號(hào)：20190708；均購于南京建成科技有限公司；4%多聚甲醛，批號(hào)：30525-89-4，甘油明膠封片劑，批號(hào)：G1402，OCT包埋劑，批號(hào)：4583，武漢谷歌生物；醇脫氫酶(Alcohol Dehydrogenase，ADH)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒，批號(hào)：201905，醛脫氫酶(Aldehyde Dehydrogenase,ALDH)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒，批號(hào)：201905；均購于酶聯(lián)生物；前列腺素E2(Prostaglandin E2，PGE2)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒，批號(hào)：C0190030183；購于華美生物。純水儀(青島富勒姆科技，型號(hào)：FBZ2001-UP-P)，超聲細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝生物，型號(hào)：JY92-Ⅱn)，臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(Heal Force，型號(hào)：Neofuge 15R)，渦旋混合器(Servicebio，型號(hào)：MX-F)，水浴鍋(姜堰市天力醫(yī)療器械廠有限公司，型號(hào)：TL-420D)，超低溫冰箱(海爾，型號(hào)：DW-86L626)，全自動(dòng)研磨儀(賽維爾生物，型號(hào)：KH-Ⅲ)，自動(dòng)洗板機(jī)(Rayto，型號(hào)：RT3100)，酶標(biāo)檢測儀(BioTeK，美國，型號(hào)：Epoch)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備

1.2.1.1 動(dòng)物分組 所有ICR小鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，按體質(zhì)量隨機(jī)區(qū)組法分為空白組，模型組，茵梔黃顆粒(陽性藥)組，金昭膠囊低、中、高劑量組共6組，每組10只。

1.2.1.2 金昭膠囊制備 將葛根、枳椇子和梔子(9∶4.5∶2)放入提取罐中，加10倍量的水，煎煮2次，2 h/次，提取并過濾，合并得到提取液(藥材提取率為20%～25%)。將提取液濃縮至相對(duì)密度為1.0～1.5，60～85 ℃干燥至含水率≤5%，粉碎，過60～100目篩，加輔料玉米淀粉和硬脂酸鎂，混合均勻，直充膠囊[14]。

1.2.1.3 模型制備 末次給藥1 h后，除空白組外，其余各組灌胃50%的乙醇溶液12 mL/kg，空白組灌予等體積的蒸餾水，建立小鼠急性酒精性肝胃損傷模型[2]。

1.2.2 給藥方法 金昭膠囊低、中、高劑量組小鼠每日灌胃金昭膠囊混懸液0.21 g/kg、0.42 g/kg和0.84 g/kg，灌胃體積為20 mL/kg(金昭膠囊臨床成人用量2.52 g/d，動(dòng)物系數(shù)按照10倍計(jì)算，成人體質(zhì)量按照60 kg計(jì)算，按人體推薦攝入量的5、10、20倍折算[15])；陽性藥組灌胃茵梔黃顆粒混懸液1.5 g/kg，20 mL/kg；空白對(duì)照組和模型對(duì)照組給予等體積蒸餾水灌胃,灌胃1次/d，并觀察動(dòng)物一般狀況，稱重1次/周，并按動(dòng)物體質(zhì)量調(diào)整灌胃量，持續(xù)給藥4周。

1.2.3 檢測指標(biāo)與方法

1.2.3.1 樣本采集 在進(jìn)行完醉酒狀態(tài)檢測后，摘眼球取血后處死，取肝臟、胃組織凍存、固定，檢測相關(guān)指標(biāo)。

1.2.3.2 一般行為觀察 觀察灌酒后小鼠行為狀態(tài)、精神狀態(tài)、二便狀態(tài)等。

1.2.3.3 醉酒狀態(tài)檢測 小鼠醉酒是否以翻正反射是否消失為標(biāo)準(zhǔn)：小鼠灌酒后一定時(shí)間將其背向下輕輕側(cè)翻，若小鼠背向下的姿勢保持30 s以上，則認(rèn)為翻正反射消失，即為醉酒[16]。

1.2.3.4 血清轉(zhuǎn)氨酶活性 嚴(yán)格按照試劑盒說明書，應(yīng)用全自動(dòng)生化分析儀檢測血清GPT和GOT的含量。

1.2.3.5 肝組織脂質(zhì)水平和酶活性 嚴(yán)格按照試劑盒說明書，應(yīng)用全自動(dòng)生化分析儀檢測肝組織勻漿MDA、SOD、CAT、GSH、TC、TG活性水平，應(yīng)用酶標(biāo)儀采用酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測酒精代謝酶細(xì)胞色素ADH、ALDH的含量。

1.2.3.6 肝臟病理切片的觀察 用蘇木精-伊紅(Hematoxylin Eosin，HE)法染色肝臟組織，切片，顯微鏡的放大倍數(shù)為200，觀察病理學(xué)切片。

1.2.3.7 胃組織酶活性 嚴(yán)格按照試劑盒說明書，應(yīng)用全自動(dòng)生化分析儀檢測胃組織勻漿MDA、SOD、NO活性，應(yīng)用酶標(biāo)儀采用酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測胃組織勻漿PEG2水平。

2 結(jié)果

2.1 金昭膠囊對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠行為狀態(tài)的影響 灌酒后，模型組小鼠均相繼出現(xiàn)不同程度的醉酒狀態(tài)，表現(xiàn)為步態(tài)不穩(wěn)、動(dòng)作遲緩、尿失禁、昏睡等癥狀，提示小鼠醉酒模型構(gòu)建成功。與模型組比較，金昭膠囊組與陽性藥組小鼠的步態(tài)更穩(wěn)、自主活動(dòng)相對(duì)增加，尿失禁、昏睡癥狀減少，醉酒狀態(tài)改善。

2.2 金昭膠囊對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠醉酒狀態(tài)的影響 灌酒后，與空白組比較，模型組小鼠醉酒數(shù)和醉酒率升高；與模型組比較，陽性藥組、金昭膠囊各劑量組小鼠醉酒數(shù)和醉酒率降低。見表1。

表1 金昭膠囊對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠 醉酒狀態(tài)的影響(n=10)

2.3 金昭膠囊對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠血清GPT、GOT活性的影響 與空白組比較，模型組小鼠血清GPT、GOT活性顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，陽性藥組小鼠血清GPT、GOT活性顯著降低(P<0.01，P<0.05)；金昭膠囊低、中、高劑量組小鼠血清GPT、GOT活性顯著降低(P<0.01，P<0.05)。見表2。

表2 金昭膠囊對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠血清GPT、GOT活性的影響

2.4 金昭膠囊對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠肝組織MDA、SOD、CAT、GSH活性的影響 與空白組比較，模型組小鼠肝組織MDA活性顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，陽性藥組、金昭膠囊低、中、高劑量組小鼠肝組織MDA活性顯著降低(P<0.01)。與空白組比較，模型組小鼠肝組織SOD、CAT、GSH活性顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，陽性藥組小鼠肝組織SOD、CAT、GSH活性顯著升高(P<0.01)；金昭膠囊中劑量組小鼠肝組織GSH活性顯著升高(P<0.01)；金昭膠囊高劑量組小鼠肝組織SOD、CAT、GSH活性顯著升高(P<0.01)。見表3。

表3 金昭膠囊對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠肝組織MDA、SOD、CAT、GSH活性的影響

2.5 金昭膠囊對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠肝組織TC、TG、ADH、ALDH活性的影響 與空白組比較，模型組小鼠肝組織TC、TG活性顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，陽性藥組小鼠肝組織TC、TG活性顯著降低(P<0.01)；金昭膠囊低、中、高劑量組小鼠肝組織TC、TG活性顯著降低(P<0.01)。與空白組比較，模型組小鼠肝組織ADH、ALDH活性顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，陽性藥組小鼠肝組織ADH、ALDH活性顯著升高(P<0.01，P<0.05)；金昭膠囊低劑量組小鼠肝組織ADH活性顯著升高(P<0.01)；金昭膠囊中、高劑量組小鼠肝組織ADH、ALDH活性顯著升高(P<0.01)。見表4。

表4 金昭膠囊對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠肝組織TC、TG、ADH、ALDH活性的影響

2.6 金昭膠囊對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠肝臟病理學(xué)變化的影響 肝組織病理學(xué)切片結(jié)果表明，空白組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)正常，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，未見肝細(xì)胞變性、壞死等病理變化。模型組組織肝細(xì)胞排列規(guī)則，廣泛可見肝細(xì)胞胞質(zhì)疏松，胞質(zhì)內(nèi)可見微小的圓形空泡(黑色箭頭)，并可見少量炎癥細(xì)胞浸潤(黃色箭頭)，未見其他明顯異常。陽性藥組、金昭膠囊低、中、高劑量組組織肝細(xì)胞排列規(guī)則，廣泛可見肝細(xì)胞空泡變性，胞質(zhì)內(nèi)可見微小的圓形空泡(黑色箭頭)，未見其他明顯異常。結(jié)果表明，陽性藥及金昭膠囊對(duì)小鼠的肝臟具有一定程度的保護(hù)作用。見圖1。

圖1 小鼠肝臟組織病理切片(HE染色，×200)

2.7 金昭膠囊對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠胃組織MDA、SOD、NO、PGE2活性的影響 與空白組比較，模型組小鼠胃組織MDA活性顯著升高(P<0.01)。與模型組比較，陽性藥組小鼠胃組織MDA活性顯著降低(P<0.01)；金昭膠囊低、中、高劑量組小鼠胃組織MDA活性顯著降低(P<0.01)。與空白組比較，模型組小鼠胃組織SOD、NO、PGE2活性顯著降低(P<0.01，P<0.05)。與模型組比較，陽性藥組小鼠胃組織SOD、NO、PGE2活性顯著升高(P<0.01，P<0.05)；金昭膠囊低劑量組小鼠胃組織SOD活性顯著升高(P<0.01)；金昭膠囊中劑量組小鼠胃組織SOD、NO活性顯著升高(P<0.01)；金昭膠囊高劑量組小鼠胃組織SOD、NO、PGE2活性顯著升高(P<0.01，P<0.05)。見表5。

表5 金昭膠囊對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠胃組織MDA、SOD、NO、PGE2活性的影響

3 討論

本研究模型組小鼠灌酒后均相繼出現(xiàn)不同程度的醉酒狀態(tài)，表現(xiàn)為步態(tài)不穩(wěn)、動(dòng)作遲緩、尿失禁、昏睡等癥狀，且小鼠醉酒數(shù)和醉酒率顯著升高，血清中GOT、GPT水平明顯升高，且肝組織形態(tài)及功能出現(xiàn)明顯損傷改變，肝組織各指標(biāo)出現(xiàn)了明顯改變，證明急性酒精性肝損傷模型建立成功。陽性對(duì)照藥茵梔黃顆粒由茵陳、梔子、黃芩組成，具有清熱解毒，利濕退黃的作用[17-18]。本研究中金昭膠囊各劑量組小鼠灌酒后醉酒數(shù)和醉酒率均比模型組低，步履不穩(wěn)、昏睡等醉酒癥狀較模型組輕。與模型組比較，血清中GOT、GPT水平明顯降低，且肝組織損傷狀況明顯改善。從表征與肝損傷情況上看，金昭膠囊對(duì)急性酒精性肝損傷具有一定程度的保護(hù)功效。短期內(nèi)乙醇的攝入過量會(huì)造成三羧酸循環(huán)障礙和脂肪酸氧化障礙，影響脂肪代謝，導(dǎo)致TC、TG在肝臟中大量蓄積，TG大量積聚進(jìn)而造成脂肪病變，最終會(huì)導(dǎo)致酒精性脂肪肝的形成[19-20]。當(dāng)肝組織受到損傷，乙醇在代謝過程中產(chǎn)生過量的活性氧損傷肝細(xì)胞膜，肝細(xì)胞膜的通透性增大，存在于肝細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的GPT和肝細(xì)胞線粒體中的GOT會(huì)大量進(jìn)入血清[21-22]。本研究金昭膠囊各劑量組顯著降低急性酒精性肝損傷小鼠血清GPT、GOT水平，肝組織TC、TG水平，改善肝組織細(xì)胞腫脹、壞死、炎癥細(xì)胞浸潤等病理狀態(tài)，說明金昭膠囊對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠的保護(hù)機(jī)制可能與調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)氨酶水平，脂質(zhì)水平有關(guān)。

SOD是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的清除氧化自由基的酶類，它與CAT、GSH共同構(gòu)成體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)，可以有效地清除機(jī)體產(chǎn)生的自由基，對(duì)維持機(jī)體內(nèi)自由基的平衡起著至關(guān)重要的作用[9，23]。MDA是活性氧自由基氧化生物膜過程中產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，可以與酶和蛋白質(zhì)交聯(lián)從而生成脂褐質(zhì)，改變膜的通透性，其水平的高低與氧化應(yīng)激對(duì)肝臟的損害程度相關(guān)[24-25]。SOD是生物體抗氧化酶防御體系的主要組成部分，其酶活性的降低將導(dǎo)致氧自由基蓄積，從而誘導(dǎo)細(xì)胞損傷。GSH是機(jī)體內(nèi)最重要的非酶性抗氧化物，是評(píng)價(jià)機(jī)體抗氧化能力大小的重要因素[26]。本研究金昭膠囊各劑量組顯著降低急性酒精性肝損傷小鼠肝組織MDA水平，升高SOD、CAT、GSH水平，說明金昭膠囊對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠的保護(hù)機(jī)制可能與調(diào)節(jié)抗氧化水平有關(guān)。

乙醇在人類體內(nèi)的代謝和排泄是一個(gè)復(fù)雜的、多系統(tǒng)參與的過程。攝入的乙醇90%在肝臟代謝降解,可引起肝臟脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，使肝細(xì)胞膜及細(xì)胞器結(jié)構(gòu)遭到破壞從而引起代謝和功能方面的障礙[27-29]。經(jīng)胃腸道吸收的乙醇通過胞質(zhì)ADH和線粒體ALDH途徑、微粒體乙醇氧化系統(tǒng)途徑及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑氧化代謝，上述代謝過程產(chǎn)生的大量自由基介導(dǎo)了氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而損傷肝細(xì)胞[30]。ADH通過將乙醇代謝為乙醛，再經(jīng)ALDH代謝形成乙酸，最后通過三羧酸循環(huán)排出體外[9]。本研究金昭膠囊各劑量組顯著降低急性酒精性肝損傷小鼠肝組織ADH、ALDH含量，說明金昭膠囊對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠的保護(hù)機(jī)制可能與調(diào)節(jié)乙醇代謝酶有關(guān)。

胃是乙醇代謝最先接觸的重要器官，過度飲酒或長期飲酒可引起胃黏膜急性或慢性損傷。在乙醇的刺激下，胃黏膜組織可產(chǎn)生大量氧自由基，氧自由基與膜內(nèi)多價(jià)不飽和脂肪酸結(jié)合，形成MDA[31]。SOD是機(jī)體清除氧自由基的重要酶，可通過歧化反應(yīng)清除機(jī)體內(nèi)氧代謝過程中產(chǎn)生的有害超氧負(fù)離子自由基。PGE2是胃黏膜重要的調(diào)控介質(zhì)，在組織中的減少與多種因素導(dǎo)致的胃黏膜損傷有關(guān)[32]。NO具有擴(kuò)張黏膜血管，調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答及作為神經(jīng)遞質(zhì)等作用，可增加胃黏膜血流量，從而維護(hù)黏膜完整性，發(fā)揮黏膜防御作用[33]。本研究金昭膠囊各劑量組顯著降低急性酒精性肝損傷小鼠胃組織MDA活性，增加SOD、NO、PGE2活性，說明金昭膠囊對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠的胃組織也有一定保護(hù)作用，且對(duì)胃黏膜的保護(hù)機(jī)制可能與調(diào)節(jié)過氧化物酶有關(guān)。

綜上所述，金昭膠囊具有解酒的作用，對(duì)于急性酒精性肝損傷有明顯的保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與增強(qiáng)體內(nèi)肝組織中乙醇代謝關(guān)鍵酶及抗氧化酶活性，減少脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生，保護(hù)肝細(xì)胞膜完整性，減少轉(zhuǎn)氨酶的釋放相關(guān)。同時(shí)金昭膠囊還可以通過調(diào)節(jié)胃組織過氧化物酶活性，起到保護(hù)胃黏膜損傷的作用。說明金昭膠囊對(duì)于飲酒過量所導(dǎo)致的肝、胃損傷均有良好的保護(hù)作用。