基于網絡藥理學探討三棱-莪術藥對治療子宮內膜異位癥的作用機制

宗春曉 徐 信 謝 偉 劉小麗 薛曉鷗 王 謙 徐 立

(北京中醫藥大學第一臨床醫學院，北京，100010)

子宮內膜異位癥(Endometriosis,EMT)指子宮內膜組織(腺體和間質)出現在子宮體以外的部位，臨床癥狀以痛經、慢性盆腔痛、月經失調、不孕等為主。近年來EMT發病率呈上升趨勢，嚴重影響患者的健康及生命質量[1-2]。雖然目前用于治療EMT的藥物種類很多，但存在長期服用不良反應多、停藥后易復發等弊端。

中醫藥治療EMT在臨床取得良好療效，具有較好的應用前景。EMT在中醫學古文獻中無確切病名記載，但根據其主要臨床癥狀與體征，可歸屬于“痛經”“癥瘕積聚”“月經不調”“不孕”等范疇。唐容川《血證論》云：“離經之血，雖清血鮮血，亦是瘀血。”EMT患者的異位內膜組織隨雌孕激素的變化出現周期性出血，故認為血瘀是貫穿EMT發生發展過程的中心環節，EMT的基本病機為“瘀血阻滯胞宮、沖任”，因此，活血化瘀是治療EMT的常法[3-4]。

三棱-莪術藥對為活血化瘀最常用的藥對之一，二者配伍使用首見于《經驗良方》，屬于相須配伍關系。三棱、莪術皆辛散苦泄，為破血消癥之品，其中三棱性平，破血祛瘀之力較強，莪術性溫，破氣消積之力較強，二者相須為用，共奏破血逐瘀、消癥止痛、行氣散積之功。武梅等[5]關于EMT中醫用藥規律的研究表明，三棱-莪術藥對為中醫藥治療EMT使用最多的藥對。臨床研究報道，三棱-莪術藥對治療EMT取得較好療效，但其作用機制仍有待深入研究[6-8]。網絡藥理學具有整體性和系統性的特點，是研究中藥和疾病復雜關系的有效方法[9]。本研究擬采用網絡藥理學方法，通過篩選三棱-莪術藥對的活性成分和作用靶點，從系統生物學的角度探索三棱-莪術藥對治療EMT的作用機制。

1 資料與方法

1.1 三棱-莪術藥對活性成分的挖掘與篩選 將三棱、莪術兩味中藥分別輸入中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php)進行檢索，通過設置口服生物利用度(Oral Bioavailability,OB)≥30%和類藥性(Drug Likeness，DL)≥0.18 2個篩選條件，得到各自的活性成分。

1.2 三棱-莪術藥對活性成分作用靶點的預測 利用TCMSP數據庫獲取三棱-莪術藥對篩選出的活性成分所對應的潛在靶點信息，通過UniProt(http://www.Uniport.org)數據庫中的UniProtKB搜索功能對靶點進行檢索，設置背景為Homo sapiens(人類)，得到所有靶點的official gene symbol，以用于后續分析。

1.3 EMT靶點的挖掘 GeneCard(http://www.genecards.org)是人類基因的綜合數據庫，可提供簡明的基因組學、蛋白質組學、轉錄組學的基因信息。人類孟德爾遺傳數據庫(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM，http://www.omim.org)是關于人類基因和遺傳紊亂的數據庫，包含所有已知的遺傳病、遺傳決定的性狀及其基因信息。利用GeneCard和OMIM獲得EMT這一疾病的相關治療靶點信息。

1.4 核心靶點篩選及疾病-藥物-活性成分-靶點相互作用網絡的構建 利用韋恩圖在線繪制工具(http://www.bioinformatics.com.cn)繪制三棱-莪術藥對有效活性成分靶點和EMT靶點的韋恩圖，將其交集靶點定義為三棱-莪術藥對治療EMT的核心靶點。利用Cytoscape 3.7.2軟件構建三棱-莪術藥對治療EMT的疾病-藥物-活性成分-靶點相互作用網絡圖。

1.5 蛋白質-蛋白質相互作用(Protein-protein Interaction，PPI)網絡構建和分析 將篩選得到的三棱-莪術藥對治療EMT的交集靶點蛋白以gene symbol的形式上傳到String數據庫(http://string-db.org)，限定研究物種為Homo sapiens，進行PPI分析，得到PPI網絡。將篩選得到的三棱-莪術藥對治療EMT的34個交集靶點上傳到String數據庫進行PPI分析，得到PPI網絡。通過Cytoscape 3.7.2軟件進行網絡構建并繪制按Degree值排序的PPI網絡。在所構建的PPI網絡中，節點大小和顏色變化反映了Degree值大小，節點越大、顏色越紅的靶點Degree值越大，在網絡中越處于核心位置。

1.6 基因本體(Gene Ontology,GO)富集分析和京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)富集分析 利用Bioconductor生物信息軟件包(http://www.bioconductor.org)，借助R軟件，首先將基因名字轉化為基因ID，然后設定P≤0.05進行GO功能富集分析與KEGG通路富集分析，選取P值前20的條目制圖。并利用Cytoscape 3.7.2軟件構建靶點-信號通路網絡圖，進一步說明靶點和信號通路在三棱-莪術藥對治療EMT中的作用。紅色為信號通路，綠色為靶點。

2 結果

2.1 三棱-莪術藥對的活性成分 共得到三棱-莪術藥對的8個活性成分，其中三棱5個，莪術3個。表1為活性成分詳細信息。

表1 三棱-莪術藥對活性成分

2.2 三棱-莪術藥對活性成分靶點預測及EMT靶點挖掘 獲得三棱-莪術藥對活性成分所對應的靶點共77個；檢索GeneCard和OMIM數據庫得到1 600個EMT相關靶點。得到34個交集靶點即三棱-莪術藥對治療EMT的核心靶點。見圖1。詳細信息見表2。

圖1 三棱-莪術藥對與EMT交集靶點韋恩圖

表2 三棱-莪術藥對治療EMT相關靶點

2.3 疾病-藥物-活性成分-靶點相互作用網絡的構建 利用Cytoscape 3.7.2軟件構建疾病-藥物-活性成分-靶點相互作用網絡，得到了一個包含42個節點(Node)和93條邊(Edge)的網絡。見圖2。圖中黃色代表疾病，紅色代表藥物，紫色代表三棱的活性成分，藍色代表三棱莪術共有的活性成分，綠色代表靶點。其中，自由度(Degree)值排名前6的靶點是前列腺素內過氧化物合酶2(Prostaglandin-endoperoxide Synthase2,PTGS2)、前列腺素內過氧化物合酶1(Prostaglandin-endoperoxide Synthase1,PTGS1)、核受體輔激活蛋白2(Nuclear Receptor Coactivator 2,NCOA2)、視黃酸X受體A(Retinoid X Receptor Alpha，RXR-α，RXRA)、孕酮受體(Progesterone Rceptor,PGR)、神經元乙酰膽堿受體亞基α-7(Neuronal Acetylcholine Receptor Subunit Alpha-7,CHRNA7)，它們的Degree值分別是6、6、5、4、4、4。

圖2 三棱-莪術藥對治療EMT的疾病-藥物-活性成分-靶點相互作用網絡

2.4 PPI網絡的構建和分析 結果顯示，該網絡含有34個節點，157條邊，平均節點Degree值為9.24。見圖3。通過Cytoscape 3.7.2軟件進行網絡構建并繪制按Degree值排序的PPI網絡見圖4。圖5為Degree值排名前30的靶點。PPI網絡中處在核心位置的靶點主要有胱天蛋白酶3(Caspase-3,CASP3)、原癌基因c-Jun(Proto-oncogene c-Jun,JUN)、PTGS2、雌激素受體(Estrogen Receptor,ESR1)、促分裂原活化的蛋白激酶14(Mitogen-activated Protein Kinase 14,MAPK14)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(Peroxisome Proliferator Activated Receptor Gamma,PPARG)、內皮型一氧化氮合酶(endothelial Nitric Oxide Synthase 3,eNOS3)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴性脫乙酰酶沉默信息調節因子1(Ailence Infor-mation Regulator，sirtuin-1,SIRT1)、雄激素受體(Androgen Receptor,AR)、胱天蛋白酶9(Caspase-9，CASP9)、白細胞介素4(Interleukin-4,IL4)。這些靶點是連接網絡中其他節點的樞紐，在PPI網絡中起關鍵作用，可能是三棱-莪術藥對治療EMT的重要靶點。

圖3 三棱-莪術藥對治療EMT的PPI網絡

圖4 三棱-莪術藥對治療EMT的PPI網絡(按Degree值排序)

圖5 Degree值排名前30位的三棱-莪術藥對治療EMT的靶點

2.5 GO功能富集分析 GO功能富集分析共得出1 054個生物過程(Biological Process,BP)，涉及對類固醇激素的反應、節律過程、生殖結構發育、生殖系統開發、對雌二醇的反應、對氧氣水平的反應、細胞對類固醇激素刺激的反應、對缺氧的反應、對氧氣水平降低的反應、排卵周期等；22個細胞組分(Cellular Component,CC)，涉及膜筏、膜微區、膜區、核染色質、線粒體外膜、細胞器外膜、外膜、肥大細胞顆粒、孔復合體、質膜筏等；65個分子功能(Molecular Function,MF)，涉及核受體活性、轉錄因子活性、類固醇激素受體活性、核激素受體結合、激素受體結合、凋亡過程中半胱氨酸型內肽酶活性、核受體結合、RNA聚合酶Ⅱ轉錄因子結合、轉錄共激活因子活性、類固醇結合等。見圖6～7。柱狀圖長度越長則富集基因數目越多，顏色越紅則富集越顯著；氣泡圖節點越大則富集基因數目越多，顏色越紅則富集越顯著。

圖6 三棱-莪術藥對治療EMT的GO功能富集分析柱狀圖

圖7 三棱-莪術藥對治療EMT的GO功能富集分析氣泡圖

2.6 KEGG信號通路富集分析 得到一個包含66個節點和243條邊的網絡，Degree值最大的靶點主要有JUN、MAPK14、CASP3、BAX、CASP8。圖中紅色為信號通路，綠色為靶點，節點越大的靶點Degree值越大。見圖8。KEGG通路富集分析共得到91條通路，其共同靶點主要富集于雌激素信號通路、乙肝、弓形蟲病、大腸癌、卡波西氏肉瘤相關皰疹病毒感染、小細胞肺癌、白細胞介素17(Interleukin-17，IL-17)信號通路、糖尿病并發癥中晚期糖基化終產物(Advanced Glycation End Products,AGE)-AGE受體(Receptor of AGE,RAGE)信號通路、多物種凋亡、利什曼病、EB病毒(Epstein-Barr Virus,EBV)感染、麻疹、乳腺癌、非酒精性脂肪肝疾病、內分泌抵抗、甲狀腺激素信號通路、鉑耐藥、P53信號通路、細胞凋亡等。見圖9。氣泡圖節點越大則富集基因數量越多，顏色越紅則富集越顯著。

圖8 三棱-莪術藥對治療EMT的靶點-信號通路網絡

圖9 三棱-莪術藥對治療EMT的KEGG富集分析氣泡圖

3 討論

EMT為婦科常見疾病，近年來發病率持續上升，嚴重影響患者的生命質量。西醫藥物存在不良反應大、停藥后易復發的弊端。中醫學認為，異位內膜的周期性出血為離經之血，屬于“瘀血”的范疇，“瘀血阻滯胞宮、沖任”是EMT的基本病機，血瘀是EMT最基本的病理基礎。趙玉芹[10]關于EMT中醫證型分布規律的研究表明,氣滯血瘀證占EMT證型的比例最大，治療以理氣行滯、化瘀止痛為法。三棱-莪術為行氣止痛、活血化瘀的常用藥對，臨床治療EMT取得了良好的療效。張錫純《醫學衷中參西錄》云：“莪術、三棱性近和平，而以治女子瘀血，雖堅如鐵石亦能徐徐消除，而猛烈開破之品不能建此奇功，此莪術、三棱獨具之良能也。”三棱為血中氣藥，善行氣中之滯；莪術為氣中血藥，善破血中之結。二者相須為用，共奏行氣活血，散瘀消癥之功。現代藥理研究表明，莪術具有抗血小板聚集、抗血栓的作用，可降低血液黏度，改善血液流變學，且能抗炎鎮痛，抗痛經及改善大鼠血清激素水平紊亂[11-14]。三棱具有抗炎鎮痛、抑制血管生成、抑制血小板聚集及抗血栓作用[15-18]。但三棱-莪術藥對治療EMT的作用機制尚未完全明確，網絡藥理學從多靶點出發，從分子信息學、分子生物學及現代藥理學的角度對中藥配伍規律及作用機制進行探究，通過網絡學科語言呈現出中藥多成分、多靶點和多途徑的復雜作用關系，與中醫整體論治的觀念相一致[19-20]。本研究利用網絡藥理學平臺技術，對三棱-莪術藥對治療EMT的作用機制進行了預測。

本研究借助TCMSP，以OB≥30%、DL≥0.18為篩選條件，共得到三棱-莪術藥對的8個活性成分，通過TCMSP篩選得到77個三棱-莪術藥對活性成分所對應的靶點，檢索GeneCard和OMIM數據庫得到1 600個EMT相關靶點，取交集后得到34個三棱-莪術藥對治療EMT的核心靶點。借助Cytoscape軟件構建疾病-藥物-活性成分-靶點相互作用網絡，顯示三棱-莪術藥對具有多成分、多靶點治療EMT的作用特點,其中Degree值排名前6位的靶點為PTGS2、PTGS1、NCOA2、RXRA、PGR、CHRNA7，提示三棱-莪術藥對治療EMT的作用機制涉及炎癥反應、激素調控、免疫調節等。通過String數據庫和Cytoscape軟件得到PPI網絡圖，提示蛋白之間存在著復雜的聯系，是一個復雜交互的網絡而非單線作用，因此靶點之間的相互作用調節可能是三棱-莪術藥對治療EMT的潛在機制之一。篩選出的核心靶點主要有CASP3、JUN、PTGS2、ESR1、MAPK14、PPARG等，其中胱天蛋白酶3屬于胱天蛋白酶蛋白家族成員，位于細胞凋亡有序級聯反應的下游，是細胞凋亡的關鍵執行者，其活化標志著細胞凋亡進入不可逆階段。多項研究已表明，EMT的發生發展與子宮內膜組織細胞凋亡的失調有關[21-24]。

從GO功能富集分析可知，三棱-莪術藥對治療EMT可影響1 054個生物學過程，65個分子功能和22個細胞組分。主要涉及的生物學過程包括對類固醇激素的反應、節律過程、生殖結構發育、生殖系統開發、對雌二醇的反應、對氧氣水平的反應、細胞對類固醇激素刺激的反應、對缺氧的反應、對氧氣水平降低的反應、排卵周期等，多生物學過程與代謝通路為深入探討三棱-莪術藥對治療EMT的作用機制提供了科學依據。

從KEGG富集分析結果可知，三棱-莪術藥對治療EMT所涉及的通路主要有雌激素信號通路、IL-17信號通路、AGE-RAGE信號通路、甲狀腺激素信號通路、P53信號通路等，通路上所含靶點越多則該通路發揮作用的可能性越大。EMT是雌激素依賴性疾病，局部高水平的雌激素是EMT發生的關鍵。EMT患者的雌激素受體1表達升高，刺激異位內膜生長，而異位病灶又能持續合成雌激素。雌激素可激活MAPK、WNT、核因子κB、PI3K-AKT、Notch等信號通路，調控上皮孕激素受體、凋亡調節劑B細胞淋巴瘤-2等的表達，參與EMT的發生發展[25-28]。研究表明，EMT異位病灶的炎癥反應是影響其發生發展的重要因素，IL-17是一種炎癥介質，可以激活核因子κB、MAPK等信號通路，上調IL4、環氧合酶2等的表達，促進炎癥反應[29-30]。近年來研究發現,AGE-RAGE信號通路中的晚期糖基化終產物受體在EMT患者異位內膜細胞中過表達[31]。本研究結果表明，RAGE可與多種配體結合，激活PI3K-AKT、Jak-STAT、MAPK信號通路及鈣離子信號通路等，促進胱天蛋白酶3、白細胞介素1、白細胞介素6等因子的表達，誘導細胞凋亡、促進炎癥反應，從而促進EMT的發展。EMT與甲狀腺激素通路有關。研究表明，甲狀腺刺激激素在EMT患者和對照組患者的子宮內膜中均起著增生和氧化性激素的作用，而三碘甲狀腺素和甲狀腺素則可以特異性地增加異位子宮內膜細胞的增殖和活性氧的產生。動物實驗研究證實，當小鼠甲狀腺激素增加時，其子宮內膜異位植入物會增大[32]。P53是一種腫瘤抑制基因，參與細胞周期調控、DNA修復、細胞凋亡等重要的生物學過程。臨床研究報道，80%以上的EMT惡變患者P53蛋白過度表達，而其在正常子宮內膜及異位內膜中很少表達,提示P53基因突變在EMT惡變中起重要作用[33]。

綜上所述，三棱-莪術藥對治療EMT具有多靶點、多途徑、多通路的特點，其主要作用可能與雌激素信號通路、IL-17信號通路、AGE-RAGE信號通路、甲狀腺激素信號通路、P53信號通路等有關。本研究基于網絡藥理學，初步闡述了三棱-莪術藥對治療EMT的潛在靶點和信號通路，為進一步深入研究三棱-莪術藥對治療EMT的作用機制奠定了基礎。但由于中藥相互作用的復雜性及網絡藥理學本身所具有的局限性，本研究所得結果可能存在一定的偏差，仍有待進一步驗證。