基于PI3K/PDK1/Akt信號通路研究丹參-紅花藥對對寒凝血瘀型心肌缺血大鼠的保護作用及機制

王小平，薛志鵬，杜少兵，周慧慧，白吉慶，李 菁，王鵬飛，謝李紅，陳 妮

基于PI3K/PDK1/Akt信號通路研究丹參-紅花藥對對寒凝血瘀型心肌缺血大鼠的保護作用及機制

王小平，薛志鵬，杜少兵，周慧慧，白吉慶，李 菁，王鵬飛，謝李紅，陳 妮

陜西中醫藥大學藥學院，陜西 咸陽 712046

研究丹參-紅花藥對對異丙腎上腺素（isoprenaline hydrochloride，ISO）誘導的心肌缺血大鼠的保護作用及其機制。大鼠隨機分為對照組、模型組、復方丹參滴丸（73 mg/kg）組和丹參-紅花低、中、高劑量（4、8、16 g/kg）組，給予相應藥物干預7 d。于第6天開始ig藥物1 h后，大鼠于0 ℃的冰浴中寒冷刺激4 min，sc ISO（85 mg/kg），連續2 d。采用2,3,5-氯化三苯基四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）染色法測定各組大鼠心肌梗死面積；采用TUNEL法檢測各組大鼠心肌細胞凋亡情況；采用蘇木素-伊紅（HE）染色法觀察各組大鼠心肌組織病理變化；采用ELISA法檢測各組大鼠血漿中肌酸激酶同工酶（creatine kinase，CK）、天冬氨酸轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、CK-肌紅蛋白（myoglobin，MB）活性及心肌肌鈣蛋白-I（cardiac troponin-I，CTn-I）、CTn-T、C反應蛋白（C-reaction protein，CRP）、MB、末端利鈉肽前體（-terminal pro-brain natriuretic peptide，NT-proBNP）和B型腦利鈉肽（B-brain natriuretic peptides，BNP）水平；采用Western blotting檢測各組大鼠心肌組織中磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）、磷酸化PI3K（phosphorylated PI3K，p-PI3K）、磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1（pyruvate dehydrogenase kinase isozyme 1，PDK1）、蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）、p-Akt、內皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）、p-eNOS、B淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、核因子-κB p65（nuclear factor-κB p65，NF-κB p65）、p-NF-κB p65、Bcl-2相關X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）、細胞色素C（cytochrome C，Cyt C）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cystein-asparate protease-3，Caspase-3）和Caspase-9蛋白表達。丹參-紅花藥對顯著抑制ISO誘導的心肌缺血模型大鼠的心肌梗死面積（＜0.01）；改善心肌組織病理變化；顯著抑制心肌細胞的凋亡（＜0.05、0.01）；顯著降低血漿中心肌酶活性以及心肌蛋白水平（＜0.05、0.01）；顯著上調心肌組織中Bcl-2、PDK1、p-eNOS、p-PI3K和p-Akt蛋白表達水平（＜0.05、0.01），降低Bax、Cyt C、剪切型Caspase-3（cleaved Caspase-3）、cleaved Caspase-9和p-NF-κB p65蛋白表達水平（＜0.05、0.01）。丹參-紅花藥對能夠通過調控PI3K/PDK1/Akt信號通路，從而發揮對ISO誘導的心肌缺血的保護作用。

丹參-紅花藥對；心肌缺血；磷脂酰肌醇3-激酶/磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1/蛋白激酶B信號通路；心肌酶；心肌蛋白；丹參素；羥基紅花黃色素A；迷迭香酸；紫草酸；丹酚酸B

缺血性心臟病（ischemic heart disease，IHD）的發病率及死亡率逐年上升，給國家和人民帶來沉重的經濟負擔，已成為全球性的公共衛生問題[1-3]。現代醫學針對IHD主要采用藥物干預及手術治療，然而手術治療可能出現心肌缺血-再灌注（myocardial ischemia-reperfusion，MI/R），造成不可逆的心肌二次損傷[4-5]。中藥已有上千年的藥用歷史，能夠有效地緩解IHD患者的癥狀，其多成分、多靶點治療的特點及整體觀念對病理機制復雜的IHD展現出較好的臨床療效[6-7]。

現代藥理學研究表明，丹參具有改善微循環、增加冠脈血流、擴血管、清除自由基、抗炎、抗氧化、抑制血小板凝集等作用，臨床常用于治療心肌缺血、心肌梗死、腦缺血等心腦血管疾病[8-12]。紅花具有降壓、抗炎、抗心律失常、抗氧化、抗腫瘤、抗缺血等作用，臨床常用于治療冠心病、心絞痛、腦血栓等多種心腦血管疾病[13-15]。丹參-紅花常作為活血化瘀藥對被廣泛用于治療冠心病、心絞痛等缺血性心血管疾病，其藥理作用及臨床療效顯著[16]。復方丹參滴丸由丹參、三七、冰片組成，具有活血化瘀之功效，用于治療冠心病心絞痛等癥，且給藥，與丹參-紅花藥對的功效、臨床應用及給藥途徑均一致，本研究以復方丹參滴丸為陽性對照藥物，采用鹽酸異丙腎上腺素（isoprenaline hydrochloride，ISO）構建急性心肌缺血大鼠模型，基于磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1（pyruvate dehydrogenase kinase isozyme 1，PDK1）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號通路探討丹參-紅花藥對對心肌缺血的保護機制。

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠60只，6周齡，體質量180～220 g，購自成都達碩實驗動物有限公司，動物生產許可證號SCXK（川）2020-030，動物質量合格證號0043215，實驗動物使用許可證號SCXK（川）2020-030。動物飼養于陜西中醫藥大學藥理實驗中心的動物房，飼養環境為溫度（25±2）℃，相對濕度（75±5）%，12 h光照/黑暗交替，普通飼料喂養，自由飲水。所有動物實驗操作均在陜西中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準下進行（批準號SUCMDL-20190309001）。

1.2 藥材

丹參飲片（產地山東，批號160821）、紅花飲片（產地新疆，批號181012）購自安徽澤華國藥飲片有限公司，經陜西中醫藥大學白吉慶教授鑒定分別為唇形科植物丹參Bge.的干燥根及根莖、菊科植物紅花L.的干燥花，均符合《中國藥典》2020年版規定。

1.3 藥品與試劑

復方丹參滴丸（批號202012）購自天津天士力制藥股份有限公司；戊巴比妥鈉（批號57-33-0）購自德國Merck公司；ISO（批號I5627-5G）、2,3,5-三苯基氯化四唑（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC，批號T8877-100G）購自美國Sigma公司；蘇木素（批號517-28-2）購自北京索萊寶生物科技有限公司；醇溶性伊紅Y（批號15086-94-9）購自山東西亞化學工業有限公司；肌紅蛋白（myoglobin，MB）檢測試劑盒（批號ml016170）、肌酸激酶同工酶（creatine kinase，CK）檢測試劑盒（批號ml076416）、天冬氨酸轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）檢測試劑盒（批號ml-E5734）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）檢測試劑盒（批號ml076592）、CK-MB檢測試劑盒（批號ml-slisa-4870）、心肌肌鈣蛋白-I（cardiac troponin-I，CTn-I）檢測試劑盒（批號ml092662）、CTn-T檢測試劑盒（批號ml076416）、C反應蛋白（C-reaction protein，CRP）檢測試劑盒（批號ml092609）、末端利鈉肽前體（-terminal pro-brain natriuretic peptide，NT-proBNP）檢測試劑盒（批號ml028489）和B型腦利鈉肽（B-brain natriuretic peptides，BNP）檢測試劑盒（批號ml076416）購自上海酶聯生物科技有限公司；TUNEL檢測試劑盒（批號WLA029a）、BCA蛋白定量試劑盒（批號WLA004）、核因子-κB p65（nuclear factor-κB p65，NF-κB p65）抗體（批號WL01980）、磷酸化NF-κB p65（phosphorylated NF-κB p65，p-NF-κB p65）抗體（批號WL02169）、B淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）抗體（批號WL01556）、Bcl-2相關X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）抗體（批號WL01637）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cystein-asparate protease-3，Caspase-3）抗體（批號WL02117）、Caspase-9抗體（批號WL03421）、內皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）抗體（批號WL01789）、Akt抗體（批號WL0003b）、p-Akt抗體（批號WLP001）、HRP標記的羊抗兔IgG抗體（批號WLA023）、β-actin抗體（批號WL01845）購自沈陽萬類生物科技有限公司；p-eNOS抗體（批號9570）購自美國CST公司；細胞色素C（cytochrome C，Cyt C）抗體（批號AC909）購自碧云天生物；PI3K抗體（批號ab191606）、p-PI3K抗體（批號ab182651）、PDK1抗體（批號ab90444）購自英國Abcam公司。

1.4 儀器

KD-3358型切片機（浙江金華科迪公司）；顯微鏡（日本Nikon公司）；DYCZ-24DN型蛋白電泳儀、WD-9413B型凝膠成像系統（北京六一公司）；H-2050R型超速冷凍離心機（湖南湘儀公司）；BioTek ELx800型全自動酶標儀（美國Bio Tek公司）。

2 方法

2.1 丹參-紅花藥對的制備

本課題組前期研究發現，丹參-紅花藥對（3∶1）時療效最佳，故按照質量比3∶1取丹參、紅花飲片適量，加8倍量的水室溫浸泡1 h，45 ℃浸泡提取3次，每次2 h，濾過，合并濾液，減壓濃縮至稠膏，真空干燥，采用HPLC法測定干燥后粉末中主要成分丹參素、羥基紅花黃色素A、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B的質量分數分別為4.70、17.20、1.76、4.58、55.18 mg/g。取適量粉末，加水溶解至質量濃度為1.6 g/mL（以生藥量計）的溶液，作為高劑量組藥液；按照2倍稀釋得中、低劑量組藥液。

2.2 動物分組與給藥

SD大鼠隨機分為對照組、模型組、復方丹參滴丸（73 mg/kg）組和丹參-紅花低、中、高劑量（4、8、16 g/kg，分別相當于臨床劑量的1、2、4倍）組，每組10只。各給藥組ig相應藥物，對照組和模型組ig等體積純凈水，1次/d，連續7 d。于第6天開始ig藥物1 h后造模，除對照組外，其余各組大鼠于0 ℃的冰浴中寒冷刺激4 min，然后sc ISO（85 mg/kg），1次/d，連續2 d。

2.3 樣本收集

末次sc ISO 12 h后，大鼠ip 2%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉，腹主動脈取血，離心，用于心肌酶以及心肌蛋白的檢測；取出心臟，用于蘇木素-伊紅（HE）、TTC、TUNEL染色和相關蛋白檢測。

2.4 丹參-紅花對模型大鼠心肌梗死的影響

取各組大鼠心臟，切開后快速將心室部分切片，經2% TTC溶液室溫處理25 min，用10%福爾馬林溶液固定。未梗塞的心肌被染成紅色，而梗塞的心肌未被染色。數碼相機拍照，輸入電腦，用Image J軟件分析染色切片的圖像，計算梗死面積[16]。

2.5 丹參-紅花對模型大鼠心肌病理的影響

取固定的心臟，修塊，自來水沖洗，梯度乙醇脫水，二甲苯處理后石蠟包埋，切片（5 μm），溫水展片并移到載玻片上，烘干，依次放入二甲苯I、II中進行脫蠟，進行HE染色，滴加中性樹膠封片。于顯微鏡下觀察并拍照[12,16]。

2.6 丹參-紅花對模型大鼠心肌細胞凋亡的影響

取固定的心臟，梯度乙醇處理后，二甲苯浸泡至標本透明，石蠟包埋，切片（5 μm），溫水展片并移至載玻片上，烘干，依次以二甲苯、梯度乙醇和蒸餾水處理，PBS漂洗后，依次滴加0.1% Triton X-100、3% H2O2、TUNEL反應液、Converter-POD和DAB底物處理，PBS漂洗，浸入蘇木素染色，自來水沖洗，浸入1%鹽酸乙醇中處理，自來水沖洗，依次浸入梯度乙醇和二甲苯中處理，中性樹膠封片。于顯微鏡下觀察并拍照，并計算細胞凋亡率[12,16]。

凋亡率＝凋亡細胞數/總細胞數

2.7 丹參-紅花對模型大鼠心肌酶以及心肌蛋白的影響

按試劑盒說明書測定大鼠血清中CK、AST、LDH、CK-MB活性及CTn-I、CTn-T、CRP、MB、NT-proBNP、BNP水平。

2.8 丹參-紅花對模型大鼠PI3K/PDK1/Akt通路相關蛋白表達的影響

取各組大鼠心肌組織，切割成小塊，液氮研磨，加入裂解液提取蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質量濃度。蛋白樣品經10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF膜，加入5%脫脂牛奶，室溫封閉2 h；分別加入NF-κB p65（1∶500）、p-NF-κB p65（1∶500）、Bax（1∶500）、Bcl-2（1∶1000）、Caspase-3（1∶500）、Caspase-9（1∶500）、eNOS（1∶500）、p-eNOS（1∶500）、PDK1（1∶500)、Cyt C（1∶500）、Akt（1∶1 000）、p-Akt（1∶500）、PI3K（1∶500）、p-PI3K（1∶500）、β-actin（1∶1000）抗體，4 ℃孵育過夜；分別加入HRP標記的羊抗兔IgG抗體（1∶5000），室溫孵育2 h，加入ECL試劑顯色，暗室曝光。使用Gel Pro Analyzer軟件分析條帶灰度值。

2.9 統計分析

3 結果

3.1 丹參-紅花對寒凝血瘀型心肌缺血模型大鼠心肌梗死的影響

如圖1所示，與對照組比較，模型組大鼠心肌梗死面積顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，復方丹參滴丸組和丹參-紅花中、高劑量組大鼠心肌梗死面積均顯著降低（＜0.01）。

3.2 丹參-紅花對寒凝血瘀型心肌缺血模型大鼠心肌病理的影響

如圖2所示，對照組大鼠心肌形態結構正常，細胞排列整齊，染色均勻，胞核染清晰，紋理清晰，偶見心肌間質散在炎性細胞；模型組心肌形態結構紊亂，心肌細胞界限不清，心肌間質疏松、充血、腫脹，伴有多量炎性細胞浸潤，肌纖維斷裂，細胞核固縮、碎裂，有溢出，說明造模成功；與模型組比較，各給藥組心肌形態結構均得到不同程度改善。

A-對照組 B-模型組 C-復方丹參滴丸組 D-丹參-紅花低劑量組 E-丹參-紅花中劑量組 F-丹參-紅花高劑量組 與對照組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01，下圖同

圖2 丹參-紅花對寒凝血瘀型心肌缺血模型大鼠心肌病理的影響

3.3 丹參-紅花對寒凝血瘀型心肌缺血模型大鼠心肌細胞凋亡的影響

如圖3所示，與對照組比較，模型組大鼠心肌細胞凋亡率顯著升高（＜0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠心肌細胞凋亡率均顯著降低（＜0.05、0.01）。

3.4 丹參-紅花對寒凝血瘀型心肌缺血模型大鼠心肌酶及心肌蛋白的影響

如圖4所示，與對照組比較，模型組大鼠血漿中CK、AST、LDH、CK-MB活性及CTn-I、CTn-T、CRP、MB、NT-proBNP、BNP水平均顯著升高（＜0.05、0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠血漿中CK、AST、CK-MB活性及CTn-T水平均顯著降低（＜0.05、0.01）；復方丹參滴丸組和丹參-紅花中、高劑量組大鼠血漿中LDH活性及CTn-T、CRP、MB、NT-proBNP、BNP水平均顯著降低（＜0.05、0.01）。

圖3 丹參-紅花對寒凝血瘀型心肌缺血模型大鼠心肌細胞凋亡的影響(, n = 10)

圖4 丹參-紅花對寒凝血瘀型心肌缺血模型大鼠血漿中心肌酶活性以及心肌蛋白水平的影響(, n = 10)

3.5 丹參-紅花對寒凝血瘀型心肌缺血模型大鼠心肌組織PI3K/PDK1/Akt通路相關蛋白表達的影響

如圖5所示，各組eNOS、NF-κB p65、PI3K、Akt、Caspase-3前體（pro Caspase-3）和pro Caspase-9蛋白表達水平無顯著差異。與對照組比較，模型組大鼠心肌組織中p-PI3K、PDK1、p-Akt、p-eNOS和Bcl-2蛋白表達水平均顯著降低（＜0.01），p-NF-κB p65、Bax、Cyt C、剪切型Caspase-3（cleaved Caspase-3）和cleaved Caspase-9蛋白表達水平均顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠心肌組織中p-Akt和p-eNOS蛋白表達水平均顯著升高（＜0.05、0.01），p-NF-κB p65蛋白表達水平均顯著降低（＜0.01）；復方丹參滴丸組和丹參-紅花中、高劑量組大鼠心肌組織中p-PI3K、PDK1和Bcl-2蛋白表達水平均顯著升高（＜0.05、0.01），Bax、Cyt C、cleaved Caspase-3和cleaved Caspase-9蛋白表達水平均顯著降低（＜0.05、0.01）。

4 討論

機體功能性改變或器質性病變導致冠脈血流和心肌需求之間不平衡，會引起心肌缺血（主要包括急性心肌缺血和慢性心肌缺血），導致患者出現不同程度的心肌損害。引起IHD的原因較多，如血壓波動范圍大；心臟的血管畸形；冠脈硬化、閉塞、狹窄；情緒緊張、焦慮以及睡眠不足等。IHD可刺激心肌細胞凋亡，產生纖維化，促進心肌間質重構，損傷心臟，同時當心肌缺血時，血漿中心肌酶活性以及心肌蛋白水平會異常升高，長時間的缺血會引發心肌梗死。血漿中心肌酶活性以及心肌蛋白水平的異常升高、心肌細胞凋亡、心肌梗死面積被認為是評價急性心肌缺血的主要指標。CK、AST、LDH、CK-MB、CTn-I、CTn-T、CRP、MB、NT-proBNP和BNP是心肌梗死早期診斷的敏感指標，心肌損傷發病6～9 h后血漿中上述指標出現增高并持續數天，因此，上述指標對心肌損傷的敏感性和特異性都較高。雖然上述指標在心肌梗死后開始升高的時間和持續的時間存在差異，但在心肌梗死12 h后，上述指標仍處于異常水平，因此本研究在末次sc ISO后12 h取血測定上述心肌酶活性和心肌蛋白水平，結果顯示，模型組CK、AST、LDH、CK-MB活性以及CTn-I、CTn-T、CRP、MB、NT-proBNP、BNP水平均顯著高于對照組，表明心肌梗死12 h后，上述指標仍處于異常水平。

圖5 丹參-紅花對寒凝血瘀型心肌缺血模型大鼠心肌組織PI3K/PDK1/Akt通路相關蛋白表達的影響(, n = 10)

中醫中藥治療IHD有著幾千年的經驗積累，其治療效果顯著，越來越受到人們的重視，然而中藥“方-證”的對應關系及其作用機制尚不明確。采用適宜的動物模型研究中醫藥理論是提高中醫藥臨床療效、提高中醫診療水平、促進中醫藥發展和中藥現代化的有效途徑[17-18]。目前主要通過開胸結扎冠狀動脈左前降支或藥物誘導復制心肌缺血模型。然而開胸手術實驗動物存活率低，實驗難度大，要求技術人員要有豐富的心導管實驗經驗和嫻熟的技術；藥物誘導法操作簡單，與人心臟陣發性疼痛的病理處境接近，ISO是常用的藥物之一，復制的心肌缺血模型不但具有心絞痛的病理狀態而且模型的病理狀態穩定[19-20]。中醫認為心肌缺血多為心脾肝腎虛，心脈失養，血瘀、寒凝、氣滯，痹阻心脈，其中血瘀是病理關鍵[18,21]。本研究參考寒凝血瘀證動物模型[22]和心肌缺血動物模型[12]的制備，結合寒凝血瘀型心肌缺血疾病的冬季發病特點，采用ISO和寒冷刺激聯合的方法，建立大鼠寒凝血瘀證心肌缺血模型，結果顯示，模型大鼠爪尾部呈現紫色，身體蜷縮、少動，甚至出現寒戰等癥狀，心肌組織病理、血漿中心肌酶活性和心肌蛋白水平與對照組比較均有顯著性差異，表明建立的寒凝血瘀心肌缺血大鼠模型符合中醫證侯特點，因此本研究參照文獻方法[12,22]和前期實驗積累，選用ISO同時聯合寒冷刺激制備寒凝血瘀型的心肌缺血大鼠模型，研究丹參-紅花活血化瘀藥對抗心肌缺血的作用機制。

研究發現，PI3K/PDK1/Akt信號通路通過調節心肌細胞凋亡、血管內皮生成等保護心臟[23-24]。激活的PI3K不能直接使Akt磷酸化，需要和PDK1結合，最終激活Akt，活化的Akt可使eNOS磷酸化，進而促進內源性NO的產生。NO具有促進內皮再生、血管舒張等作用，從而改善動脈粥樣硬化和冠心病引起的心肌缺血、缺氧或壞死；激活的Akt通過激活抗凋亡蛋白Bcl-2或激活NF-κB p65使其進入細胞核，轉錄抗凋亡基因，進而抑制細胞凋亡。研究表明，PI3K/Akt途徑可以調控藥物對ISO引起的心肌缺血性損傷的保護作用[25]。本研究發現，模型組大鼠心肌組織中PI3K/Akt通路被抑制，導致p-PI3K、PDK1和p-Akt蛋白表達水平降低；丹參-紅花藥對能夠顯著上調ISO誘導的p-PI3K、PDK1和p-Akt蛋白表達的降低。表明丹參-紅花可能通過調控PI3K/PDK1/Akt信號通路來保護心肌缺血。

PI3K/PDK1/Akt信號通路能夠通過調控Bcl-2蛋白家族和Caspase蛋白家族。Bcl-2蛋白家族包括抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax，能夠控制線粒體外膜的通透性，與細胞凋亡密切相關。線粒體釋放Cyt C并激活Caspase-9，隨后激活Caspase-3[26]。Caspase-3是凋亡的關鍵執行者，是Caspase家族的關鍵成員。本研究結果顯示，模型組大鼠心肌組織中Caspase-3、Caspase-9和Bax蛋白表達上調，Bcl-2蛋白表達下調，進而誘發心肌細胞凋亡，與細胞凋亡的特征一致。TTC結果顯示丹參-紅花對ISO誘導的心肌缺血具有顯著的抑制作用，進一步通過HE染色結果看出，模型組大鼠心肌細胞核出現皺縮等凋亡的現象，丹參-紅花可以顯著改善心肌細胞形態，推測丹參-紅花能夠抑制ISO誘導的心肌細胞凋亡。為了驗證此推測，本研究進一步通過TUNEL染色檢測丹參-紅花藥對抗心肌細胞凋亡的作用，結果發現模型組大鼠心肌細胞凋亡率顯著升高，而丹參-紅花藥對能夠顯著降低ISO誘導的心肌細胞凋亡，證實了丹參-紅花對ISO誘導的心肌細胞凋亡的保護作用。此外，Western blotting結果顯示，模型組大鼠心肌組織中促凋亡蛋白Bax、cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9表達水平顯著升高，抗凋亡蛋白Bcl-2表達水平顯著降低；丹參-紅花能夠顯著降低促凋亡蛋白Bax、cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9表達，升高抗凋亡蛋白Bcl-2表達，表明其可能通過調控凋亡蛋白表達，從而發揮抗ISO誘導的心肌細胞凋亡作用。

綜上所述，丹參-紅花藥對能夠通過調控PI3K/ PDK1/Akt信號通路，抑制心肌細胞凋亡，進而實現對心肌缺血的保護作用。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Protective mechanism ofetdrug pair on myocardial ischemia rats with cold coagulation and blood stasis syndrome based on PI3K/PDK1/Akt signaling pathway

WANG Xiao-ping, XUE Zhi-peng, DU-Shao-bing, ZHOU Hui-hui, BAI Ji-qing, LI Jing, WANG Peng-fei, XIE Li-hong, CHEN Ni

College of pharmacy, Shaanxi University of Chinese Medicine, Xianyang 712046, China

To study the protective effect and mechanism of Danshen (et)-Honghua () on myocardial ischemia rats induced by isoprenaline hydrochloride (ISO).Rats were randomly divided into control group, model group, Compound Danshen Dropping Pills (73 mg/kg) group andet-low-, medium-and high-dose (4, 8, 16 g/kg) groups, rats were given corresponding drug for 7 d. 1 h after ig drug on 6th day, rats were stimulated with cold in ice bath at 0 ℃ for 4 min and sc ISO (85 mg/kg) for 2 d. 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride (TTC) staining was used to determine the myocardial infarction area of rats in each group; TUNEL method was used to detect myocardial cell apoptosis of rats in each group; Hematoxylin-eosin (HE) staining method was used to observe the pathological changes in myocardial tissue of rats in each group; ELISA method was used to detect creatine kinase (CK), aspartate aminotransferase (AST), lactate dehydrogenase (LDH), CK-myoglobin (MB) activities and cardiac troponin-I (CTn-I), CTn-T , C-reaction protein (CRP), MB,-terminal pro-brain natriuretic peptide (NT-proBNP), B-brain natriuretic peptides (BNP) levels in plasma of rats in each group; Western blotting was used to detect phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K), phosphorylated PI3K (p-PI3K), pyruvate dehydrogenase kinase isozyme 1 (PDK1), protein kinase B (Akt), p-Akt, endothelial nitric oxide synthase (eNOS), p-eNOS, B-cell lymphoma-2 (Bcl-2), nuclear factor-κB p65 (NF-κB p65), p-NF-κB p65, Bcl-2 associated X protein (Bax), cytochrome C (Cyt C), cysteine-aspartate protease-3 (Caspase-3) and Caspase-9 protein expressions in myocardial tissue of rats in each group.et-significantly inhibited the myocardial infarction area in ISO-induced myocardial ischemia model rats (< 0.01), improved the pathological changes of myocardial tissue, significantly inhibited the apoptosis of cardiomyocytes (< 0.05, 0.01), significantly decreased myocardial enzyme activities and myocardial protein levels in plasma (< 0.05, 0.01), significantly increased protein expression levels of Bcl-2, PDK1, p-eNOS, p-PI3K and p-Akt in myocardial tissue (< 0.05, 0.01), decreased protein expression levels of Bax, Cyt C, cleaved Caspase-3 (cleaved Caspase-3), cleaved Caspase-9 and p-NF-κB p65 (< 0.05, 0.01).et-drug pair can exert a protective effect on ISO-induced myocardial ischemia by regulating PI3K/PDK1/Akt signaling pathway.

et-drug pair; myocardial ischemia; PI3K/PDK1/Akt signaling pathway; myocardial enzymes; cardiac proteins; Danshensu; hydroxysafflor yellow A; rosmarinic acid; shikoric acid; salvianolic acid B

R285.5

A

0253 - 2670(2022)16 - 5085 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.16.018

2022-04-06

國家自然科學基金資助項目（81974544）；陜西省科學技術廳資助項目（2019SF-286）；陜西省教育廳資助項目（18JS025）

王小平（1976—），女，碩士生導師，教授，博士，研究方向為中藥藥效物質基礎研究。Tel: (029)38185165 E-mail: wangxiaoping323@126.com

[責任編輯 李亞楠]