長鏈非編碼RNA在肝纖維化發生發展中的作用研究進展

賈剛剛，吳承駿，盧利霞，鄭英，王俊科，于曉輝

1 蘭州大學第二醫院消化內科，蘭州 730030；2 中國人民解放軍聯勤保障部隊第九四〇醫院消化內科

肝纖維化是肝內結締組織異常增生、正常結構扭曲的病理過程，是病毒性肝炎、酒精性肝病、自身免疫性肝病及膽汁淤積性肝病等慢性肝病的創傷愈合反應。肝纖維化的發生主要與肝星狀細胞（HSCs）活化、炎性介質釋放、上皮間質轉化等因素相關，但并未完全闡明肝纖維化發生的分子機制。長鏈非編碼RNA（lncRNA）是一類長度大于200 nt并且可以在多個層面調控基因表達的RNA，其調控作用主要表現在表觀遺傳調控、轉錄調控和轉錄后調控。lncRNA 可以作為海綿分子吸附一些特定的microRNA，進而調控microRNA 靶基因的表達，這種作用方式被稱為“海綿效應”，具備該特征的lncRNA 被 稱為 競 爭性 內 源RNA（ceRNA）［1］。lncRNA 在肝纖維化發生及進展中發揮不同作用，大部分發揮促進作用，少部分發揮抑制作用，極少數lncRNA 具備促進和抑制肝纖維化發生的雙重作用。現就lncRNA 在肝纖維化發生發展中的作用研究進展情況綜述如下。

1 lncRNA在肝纖維化發生發展中的促進作用

在肝纖維化發生進程中，有些lncRNA 發揮促進作用，包括肺腺癌轉移相關轉錄本1、lncLFAR1、lncRNA HULC、lncRNA HEIH、lncRNA-ATB、漿細胞瘤變型異位因子1、核旁斑組裝轉錄本1、小核RNA宿主基因7等。

1.1 肺腺癌轉移相關轉錄本1（MALAT1） MALAT1是一種廣泛表達的lncRNA，在人類的早期非小細胞肺癌中首次發現，位于人類染色體11q13.1，長約8 kb，在腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲中發揮重要作用。MALAT1在各類疾病中的表達失調及其作用機制已被廣泛研究，在肝纖維化方面，WU 等發現其通過抑制沉默調節蛋白1（SIRT1）的表達和功能促進肝纖維化的發展［2］。SIRT1 屬于哺乳動物sirtuin 蛋白家族的成員，是一種依賴于煙酰胺腺苷二核苷酸的去乙酰化酶，具有對底物去乙酰化功能的基因，參與多種生物過程，對一些轉錄因子的去乙酰化可以保護細胞免受代謝、缺氧及基因等損傷。TGF-β 是一種來自自分泌或旁分泌途徑的促纖維化細胞因子，是促進HSCs 活化的關鍵信號分子，也是肝損傷—炎癥—纖維化病理過程中的關鍵調節因子。在TGF-β信號通路中，SIRT1能引起下游蛋白Smad3的去乙酰化，并且降低與Smad3 相關纖維基因啟動子的功能，如膠原蛋白Ⅰ型基因啟動子，這意味著SIRT1 的激活能夠減弱TGF-β 信號轉導，從而減少膠原蛋白的表達。據此推測MALAT1可能通過阻斷SIRT1 介導的TGF-β 信號通路在肝纖維化進程中的抑制作用，進而促進HSC 的激活，導致肝纖維化的發生。國內研究［3］發現，MALAT1 還參與腹膜間皮細胞纖維化的形成。WANG 等進一步通過對151 例肝纖維化患者進行研究，發現MALAT1 可通過海綿化miR-181a，作用于TLR4，進而激活NF-κB 信號通路，促進肝纖維化的發生。此外有研究［4］發現，MALAT1/PTBP1/USP8/TAK1 信號可以軸通過巨噬細胞凋亡和M1 極化促進肝纖維化的發生。MALAT1 還可通過海綿化miR-101b 來調節RAS 相關的C3 肉毒毒素底物1（Rac1）的表達，從而影響HSC 的增殖、細胞周期及活化［5］。也有研究者發現，在亞砷酸鹽誘導的肝纖維化中，來自肝細胞的外泌體MALAT1 可以通過海綿化miRNA-26b 參與HSCs的活化。這些研究結果表明，MALAT1 在肝纖維化的發生中扮演促進作用，同時提示了參與纖維化發生的機制。

1.2 肝纖維化相關的lncRNA1（lncLFAR1）lncLFAR1轉錄本最初在小鼠肝臟中發現，位于人類染色體4q25，長約734 nt。lncLFAR1 的啟動子中有三個潛在的Smad2/3 結合位點，Smad2/3 可以與lncLFAR1 基因的啟動子結合并促進其表達，在肝纖維中，lncLFAR1 可以上調Smad2/3 的表達并促進其磷酸化［6］。Smad2/3 的磷酸化進一步增強了其與目標啟動子結合的能力，如Ⅰ型膠原蛋白基因。因此，lncLFAR1 可能通過與TGF-β 信號通路相互作用誘導HSCs 活化促進肝纖維化。研究還發現，lncLFAR1 可以通過Notch 通路促進肝纖維化。

1.3 lncRNA HULC、HEIH lncRNA HULC 和lncRNA HEIH 均在肝癌中首次發現。HULC 基因位于人類染色體6p24.3，長約500 個核苷酸。在非酒精性脂肪性肝病的大鼠模型中，抑制HULC 可以通過MAPK信號通路改善肝纖維化和肝細胞凋亡。在HBV 相關肝硬化患者的血漿中，Treg 細胞和HULC表達明顯上調，HULC通過直接下調p18水平來調節Tregs 細胞的表達及功能，進而促進肝纖維［7］。此外，HEIH、HULC還可通過調控乙肝病毒X蛋白結合蛋白影響HBV 相關肝纖維化和肝細胞癌的發生和進展。因此，對CHB 患者，HULC 和HEIH 可能是肝纖維化潛在的診斷標志物。

1.4 TGFβ 激 活 的 lncRNA （lncRNA-ATB）lncRNA-ATB 是一種新發現的致癌lncRNA，位于人類第14 號染色體，長約80 kb。HCV 相關肝纖維化患者的肝組織和血漿中lncRNA-ATB 表達水平升高，并且在血漿中其水平與肝纖維化階段明顯相關，lncRNA-ATB 的敲除抑制α-SMA 和Ⅱ型膠原蛋白的表達。lncRNA-ATB通過與miR-425-5p、miR-200a競爭性結合來激活HSC 并且增加膠原蛋白的產生，從而促進HCV 誘導的肝纖維化。最近研究發現，血漿lncRNA-ATB 可作為HBV 相關肝硬化的特異性生物標志物，其靈敏度為61.36%，特異度70.00%。據此，對于HBV、HCV 的患者，lncRNAATB可以作為其潛在診斷標志物和治療靶點。

1.5 漿細胞瘤變型異位因子1（PVT1） PVT1 是lncRNA 的一種，人類PVT1 基因位于染色體8q24，參與腫瘤的增值、遷移等過程，在胃癌、膽囊癌等組織中高表達。研究［8］表明，PVT1 在肝纖維化組織和活化的HSC 中高表達，PVT1 通過競爭性結合miR-152 下調Hedgehog 通路中PTCH1 表達，從而促進肝纖維化中的EMT 過程。在小鼠肝纖維化組織中，PVT1過表達并且自噬水平明顯升高，PVT1和自噬均與缺氧有關，缺氧誘導的自噬依賴于HSC 中PVT1 和miR-152 的表達，熒光素酶基因檢測表明自噬相關基因14（ATG14）是miR-152 的直接靶標，PVT1/miR-152/ATG14 信號軸介導缺氧條件下HSC的激活，并且自噬水平升高［9］。綜上，lncRNA-PVT1作為ceRNA 通過競爭性結合miR-152促進肝纖維化的發生，但具體機制仍不明確。

1.6 核旁斑組裝轉錄本1（NEAT1） NEAT1 是細胞核中亞細胞結構旁斑中的重要組成元件，在旁斑的構建和mRNA 的出核中發揮重要作用。NEAT1在胃腺癌［10］、肝癌［11］等腫瘤中表達上調。臨床研究［12］發現，肝纖維化患者血清NEAT1 明顯高于非肝纖維化患者。進一步動物實驗發現，與對照組相比，CCl4誘導的肝纖維化小鼠肝臟中NEAT1表達增加，而抑制NEAT1可逆轉肝纖維化，同時降低α-SMA和Ⅰ型膠原纖維含量，這在NEAT1 敲除實驗和過表達試驗中得到證實。NEAT1 通過競爭性結合miR-122促進HSC 活化，還可通過調節miR-122 加速肝纖維化的進展。酒精性脂肪性肝炎患者MiR-129-5p 的水平降低，而NEAT1 和細胞因子信號2（SOCS2）升高，抑制NEAT1或過表達miR-129-5p可抑制乙醇刺激的AML-12 細胞中的炎癥反應和肝纖維化，此外NEAT1 可 以靶向SOCS2 負調節miR-129-5p［13］。熒光共定位分析顯示，NEAT1 與miR-139-5p 均表達于活化的HSCs 細胞質中，miR-139-5p 上調可以抑制β-catenin表達，β-catenin過表達可以促進HSCs的活化。NEAT1 的敲除和miR-139-5p 過表達可以減輕小鼠肝纖維化，NEAT1 通過競爭性結合miR-139-5p而加劇肝纖維化［14］。體外模型研究［15］證實，NEAT1通過海綿化miR-506 靶向GLI3 促進非酒精性脂肪性肝炎肝纖維化。最近研究［16］表明，NEAT1 基因通過競爭性結合miR-148a-3p 和miR-22-3p 來調控哺乳動物中與胰島素變構信號相關的細胞黏著因子3的表達，來抑制肝纖維化和造血干細胞的活化過程，這表明抑制NEAT1可以抑制肝纖維化，NEAT1可成為肝纖維化的潛在治療靶點。

1.7 小核RNA 宿主基因7（SNHG7） SNHG7 是一種全長2 176 bp 的致癌lncRNA，位于人類染色體9q34.3，在癌癥中被廣泛研究。在肝纖維化小鼠模型中，SNHG7 表達增加，SNHG7 敲除實驗顯示α-SMA 和Ⅰ型膠原蛋白的表達水平下降。在肝纖維化小鼠模型中，SNHG7 表達增加，SNHG7 敲除后肝纖維化相關蛋白表達下降［17］。自噬相關基因Beclin1 是自噬過程中重要的正調節因子，主要誘導自噬的啟動，微管相關蛋白1 輕鏈3（LC3）是自噬小體形成的關鍵蛋白，下調SNHG7 可以降低Beclin1、LC3-Ⅱ和LC3-Ⅰ的表達水平，說明下調SNHG7 具有抑制HSCs 自噬的作用，而自噬可以促進肝纖維化的發展。進一步機制研究［17］發現，SNHG7 的下調與DNMT3A 的低表達水平顯著相關，SNHG7 作為ceRNA 通過與miR-29b 結合來影響下游靶基因DNMT3A 的表達，進而影響HSCs 的活化、促進自噬和增殖。SNHG7還可通過競爭性結合miR-378a-3p促進HSCs 的活化。總之，SNHG7 與肝纖維化密切相關，但具體機制仍不明確。

1.8 牛磺酸上調基因1（TUG1） TUG1 除了參與腫瘤發生，還調控不同癌細胞的生物學行為和分子機制，包括細胞增殖、侵襲、凋亡、分化、遷移等過程。小鼠模型研究顯示，TUG1 水平在肝纖維化組織和活化的HSCs 中明顯升高，沉默TUG1 通過抑制TGF-β1信號通路改善肝纖維化病理損害。TUG1 通過競爭性結合miR-29b 參與肝纖維化的發展和HSCs的激活［18］，此外還可海綿化miR-142-3p調節自噬調控的肝竇內皮細胞內皮的EMT，進一步促進肝纖維化的發展［19］。對LPS誘導的肝炎小鼠模型的研究表明，沉默TUG1 可以通過miR-140，直接靶向TNF-α 而減輕肝臟炎癥反應。TUG1 在肝臟炎癥和纖維化的發展中發揮重要作用。

1.9 同源盒轉錄反義RNA（HOTAIR） HOTAIR是一種癌癥相關的lncRNA，位于染色體位點7p15，長約4 665 bp。研究［20］發現，在CCI4 誘導的肝纖維化小鼠模型中，HOTAIR 高表達，體外研究發現過表達HOTAIR 可促肝細胞增殖和活化。進一步機制研究發現，HOTAIR 通過競爭性結合MiR-29b 表觀調控抑癌基因PTEN 表達，以此促進肝纖維化的發展［21］。過氧化物酶體增殖物活化受體（PPAR）是核受體家族的成員，也是調節細胞核基因表達的一種蛋白，功能多樣，在調節細胞分化、發育和新陳代謝等方面發揮重要作用。羅格列酮是PPAR 高效激動劑，其通過上調MiR-124-3p 抑制HSCs 活化以減輕肝纖維化，并且羅格列酮的抗肝纖維化作用可以被HOTAIR的表達所逆轉［22］。

2 lncRNA在肝纖維化發生發展中的抑制作用

參與調控肝纖維化的lncRNA 大部分發揮促進作用，少部分發揮抑制作用，包括母系表達基因3（MEG3）、生長停滯特異轉錄因5（GAS5）、長基因間非編碼RNA-p21（lincRNA-P21）。

2.1 母系表達基因3（MEG3） MEG3 是lncRNA 的一種，編碼MEG3 的核苷酸長度約為1.6 kb，位于人染色體14q32。MEG3在胃癌、前列腺癌等惡性腫瘤中均有抑癌作用［23］。在CCI4 誘導的肝纖維化模型中，核苷酸結合結構域受體家族含CRAD 結構域-5（NLRC5）可能是MEG3作用的靶點，MEG3可能通過靶向NLRC5 抑制HSCs 的活化，進而促進肝纖維化的逆轉。進一步研究發現，慢性乙型肝炎（CHB）患者血清外泌體MEG3 低表達，與肝纖維化程度呈負相關［24］。因此，lncRNA MEG3可作為CHB 患者的一種預后標志物。YU 等［25］指出，Hedgehog 通路可以調控肝纖維進程中的EMT，通路中的激活性受體SMO 蛋白參與其中，MEG3 可以作為ceRNA與miR-212 互相作用，MEG3 和miR-212 相互作用靶向SMO蛋白抑制Hedgehog通路介導的EMT，進而逆轉肝纖維化的形成。PPAR 在肝纖維化的發生中發揮重要調節作用，MEG3 可以作為ceRNA 海綿化miR-145 靶向PPARγ 而影響HSCs 的活化［26］。研究發現，N-乙酰半胱氨酸可以通過調節神經MEG3/蛋白酶激活受體2（PAR2）/NF-κB 軸減輕與肝硬化相關的周圍神經病變。因此，MEG3 可能是肝纖維化潛在的治療靶點。

2.2 生長停滯特異轉錄因5（GAS5） GAS5基因位于人染色體1q25，由12 個外顯子組成。研究發現，晚期纖維化患者的血漿GAS5 的表達顯著高于非纖維化患者，并且隨著纖維化的進展，血漿中的GAS5表達增加。細胞水平研究發現，GAS5低表達促進肝纖維化進程，這一過程與啟動子甲基化有關［27］。動物實驗表明，肝纖維化的進展與血漿GAS5 的表達呈線性相關，這提示血漿GAS5 可能成為慢性肝病患者肝纖維化的診斷標志物。進一步機制研究發現，GAS5 可以海綿化miR-23a，進而調控PTEN 的轉錄，抑制肝纖維化的進展。體外實驗驗證了GAS5還可通過調節miR-433-3p/TLR10 軸調控NF-κB 轉錄因子來抑制LX-2 細胞的活化。因此，GAS5 可作為慢性肝病患者肝纖維化診斷的生物標志物［28］。

2.3 長基因間非編碼RNA-p21（lincRNA-P21）lincRNA-p21 位于人類染色體6p21.2，長度約3.0 kb，在DNA 損傷反應、細胞凋亡、增殖等不同生物學過程中發揮關鍵調節作用。一項研究顯示，肝纖維化患者血清lincRNA-p21 的水平與α-SMA 和Ⅰ型膠原蛋白呈負相關，lincRNA-p21 過表達有助于抑制HSC 活化、增殖并誘導α-SMA 和Ⅰ型膠原蛋白顯著減少［29］。機制研究表明lincRNA-p21 的過表達促進了p21 在mRNA 和蛋白質水平上的上調［30］。同時，lincRNA-p21 誘導的這些作用可被PTEN 的缺失所阻斷，lincRNA-p21 除了通過競爭性結合miR-181b增強PTEN 表達，還可競爭性結合miR-17-5p，作用于β-catenin 通路來逆轉肝纖維化的進展。綜上所述，血清lincRNA-p21 可作為肝纖維化潛在的治療靶點。

3 lncRNA在肝纖維化發生發展中的雙重作用

lncRNA H19在肝纖維化調控中發揮雙重作用，即發揮促進作用，也發揮抑制作用。

3.1 lncRNA H19 的促進作用 lncRNA H19 是由H19 基因編碼的一種lncRNA 分子，位于人染色體11p15.5，長約2.3 kb，在很多種癌癥中過度表達。無論是小鼠模型還是原發性硬化性膽管炎（PSC）、原發性膽汁性肝硬化（PBC）患者，肝臟H19 的水平都與肝纖維化的嚴重程度密切相關，膽管細胞來源的外泌體H19 通過促進HSC 的活化，在膽汁淤積性肝纖維化的進展中發揮關鍵作用［31］。ZEB1 是鋅指蛋白相關轉錄因子家族成員之一，可以與靶基因啟動子上E-box 基序結合，調節基因的轉錄。研究［32］發現，肝臟中lncRNA H19 通過與ZEB1 轉錄因子的結合而促進小鼠膽汁淤積性肝纖維化。除此之外，在膽道閉鎖相關性肝纖維化中，其肝損傷程度與H19 水平也相關，H19 不僅可以通過調節膽汁酸誘導的鞘氨醇1-磷酸受體2（S1PR2）和鞘氨醇激酶2（SphK2）的表達和激活促進肝纖維化，還可海綿化microRNA let-7 導致結構性轉錄因子HMGA2 的上調，上述兩種機制在膽汁淤積性肝纖維化中發揮關鍵作用［33］。研究［34］表明，單核細胞或巨噬細胞CD11B mRNA水平在膽道閉鎖患者的肝臟中顯著增加，并且與肝臟炎癥和纖維化的程度呈正相關，條件性巨噬細胞耗竭可以通過H19抑制膽汁淤積性肝損傷和纖維化。此外，lncRNA-H19可以通過腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）的磷酸化，加速脂滴降解和脂質氧化而促進肝纖維化，雙氫青蒿素可以通過減少由缺氧誘導因子1 亞基α（HIF1α）驅動的H19 轉錄進而抑制由AMPK磷酸化介導的脂質氧化來逆轉肝纖維化的發生。綜上，膽管細胞來源的外泌體H19在膽汁淤積性肝纖維化的發生發展中發揮重要作用，可能成為膽汁淤積性肝纖維化的治療靶點和非侵入性診斷標志物。

3.2 lncRNA H19 的抑制作用 lncRNA H19 在肝纖維化中的作用尚不明確且機制復雜。活化的HSCs和大鼠肝纖維化組織中H19的表達降低，同時伴有DNA 甲基轉移酶1（DNMT1）的過表達和H19啟動子的甲基化，并且DNMT1的敲除可以提高活化HSCs 中H19 的表達，而DNMT1 的過表達抑制了活化HSCs中H19表達。這提示lncRNA H19可能通過調控靶基因的甲基化進而抑制肝纖維化的發生。CpG 結合蛋白2（MeCP2）是甲基化結合蛋白家族中的主要成員，可以通過與甲基化DNA 的結合抑制其下游靶基因的轉錄。H19是造血干細胞中胰島素樣生長因子1 受體（IGF1R）的潛在調控因子，H19 的MeCP2 沉默可使IGF1R 過表達，從而促進HSCs 增殖，H19 的過表達可抑制IGF1R 的表達和HSC 的激活。綜上，lncRNA H19 可能通過調控DNA 甲基化影響IGF1R的表達抑制肝纖維化的進展。MeCP2是肝纖維化潛在的治療靶點。

綜上所述，lncRNA 可能參與肝纖維化的發生發展進程，在肝纖維化中發揮重要作用，主要表現為促進、抑制及雙重作用。lncRNA 可能是臨床診斷肝纖維化的生物標志物，lncRNA 本身及其互作蛋白或靶基因有可能成為肝纖維化新的治療靶點。