安溪縣青錢柳總三萜含量動態變化及萜類成分分析

陳旭鵬，陳由強，朱錦懋，陳建楠*

(1.福建師范大學生命科學學院， 福建 福州 350117;2.福建師范大學南方海洋研究院， 福建 福州 350117)

青錢柳CyclocaryaPaliurus是胡桃科Juglandaceae青錢柳屬Cyclocarya植物，為我國特有的植物種，主要分布于福建、浙江、江蘇、湖北等省份[1]。青錢柳主要含有萜類、黃酮、生物堿、多糖、有機酸等有益成分[2]，其中萜類物質占有較大比例，具有優良的藥用價值，FANG等[3]研究表明青錢柳萜類物質能夠顯著增加3T3-L1細胞對胰島素的敏感性，并增加葡萄糖的攝取；周琴等[4]研究表明青錢柳三萜能夠保護STZ損傷的INS-1細胞，并促進INS-1細胞分泌胰島素；LIU等[5]研究表明青錢柳三萜類化合物能夠顯著降低糖尿病小鼠的血脂水平。

萜類化合物是青錢柳重要的次生代謝物，它的積累與季節變化有著緊密的聯系，青錢柳萜類物質的含量隨著月份的變化而產生顯著差異[6-7]，因此選擇適宜的采收月份對青錢柳藥材質量具有重要影響。研究青錢柳總三萜含量月份動態變化及積累趨勢對科學采收青錢柳葉片具有重要意義。柏明娥等[8]研究表明浙江青錢柳4月至9月總三萜含量呈上升趨勢，9月總三萜積累量高，最佳的采收月份為9月；夏和元等[9]研究表明湖北青錢柳6月、7月總三萜含量高，此時青錢柳葉片提取液能顯著抑制α-葡萄糖苷酶的活性。前人研究表明，在總三萜含量高的月份采收青錢柳葉片具有顯著的降血糖活性，為了明確高總三萜含量的青錢柳葉片中降血糖成分，采用代謝組學的方法研究萜類的組成，為青錢柳藥理活性的深度開發提供重要理論參考[10-11]。谷海燕等[12]采用UPLC-MS/MS分析三七的萜類代謝組，發現多種具有生物活性的人參皂苷；傅俊等[13]采用UPLC-QTOF/MS分析牛膝的萜類成分，共發現40種三萜皂苷，其中齊墩果酸型三萜皂苷有38種。

青錢柳保健產品的市場需求不斷增加，目前福建省安溪縣青錢柳人工種植區多集中于育種、栽培等[14-15]，然而青錢柳總三萜含量動態變化及適宜采收月份的萜類代謝組未見報道，因此本研究以福建省安溪縣4月至11月青錢柳葉片為試驗材料，定量分析總三萜質量分數，研究總三萜含量動態變化，探究適宜的采收月份，并通過UPLC-MS/MS進一步定性定量分析適宜采收月份的青錢柳萜類組成成分。本研究為探究適宜采收青錢柳葉片的月份和青錢柳葉片萜類化合物進一步開發藥用價值及食品保健功能提供重要的科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

青錢柳樣品于2021年采自福建泉州安溪縣桃舟鄉(E117.45′42′，N25.22′ 48′)，選取的采摘時期為4月至11月。在樣地中隨機選取植株高度相似、樹冠大小相似、長勢相似、生長狀態良好的青錢柳，采收成熟的青錢柳葉片，液氮速凍后存放于超低溫冰箱，樣品1式3份用于測定總三萜質量分數和萜類代謝組分析。

1.2 主要儀器和試劑

1.2.1主要儀器 JXFSTPRP研磨儀(購自上海凈信實業發展有限公司)、INFINITE M PLEX全波長酶標儀(購自TECAN公司)、KQ-500E數控超聲波清洗儀(購自昆山市超聲儀有限公司)、超速離心機(購自Thermo SCIENTIFIC公司)、超高效液相色譜(SHIMADZU Nexera X2)、串聯質譜(Applied Biosystems 4500 QTRAP)。

1.2.2主要試劑 冰醋酸、高氯酸、無水乙醇均為分析純；甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純(購自國藥集團化學試劑有限公司)，齊墩果酸標準品純度>99%(購自阿拉丁公司)，香草醛分析純>99%(購自麥克林公司)。

1.3 定量分析4月至11月青錢柳總三萜

精密吸取0.2 mg·mL-1的齊墩果酸標準溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL于25 mL具塞試管中，置于氮吹儀內揮干溶劑，加入0.1 mL的5%香草醛-冰醋酸和0.8 mL高氯酸，混合均勻后60℃水浴酸解20 min顯色，取出冰水浴3～5 min，加入5 mL冰醋酸，室溫靜置10 min，使用全波長酶標儀在550 nm處測吸光值，以齊墩果酸質量為縱坐標，吸光值為橫坐標得到回歸方程y=337.29x-15.31，R2=0.994 8。

取200 g青錢柳樣品，真空冷凍干燥3 d后用研磨儀磨碎，過0.425 mm篩。稱取0.5 g樣品于250 mL錐形瓶中，加入95%乙醇50 mL超聲提取1 h，8 000 r·min-1離心10 min，過濾，取上清。將上清稀釋3倍后，取0.2 mL作為待測液于試管中，測定步驟參照標準曲線，總三萜含量計算公式：

式中x：樣品總三萜的含量；m1：根據標準曲線計算出待測液中總三萜的質量 (μg)；v1：提取時加入無水乙醇的體積(mL)；f：稀釋倍數；m2：樣品質量 (g)；v2：測定時移取的溶液體積 (mL)。

1.4 UPLC-MS /MS檢測青錢柳萜類物質

通過總三萜定量分析發現10月青錢柳總三萜積累量高，因此選取10月青錢柳葉片研磨成細膩粉末，用甲醇提取萜類物質，按料液比1∶100，渦旋混勻，超聲提取5次，合并提取液后12 000 r·min-1離心10 min，棄沉淀取上清，過0.22 μm濾膜，保存于超低溫冰箱以供上機分析。

采用超高效液相色譜(UPLC)和串聯質譜(MS/MS)檢測含有萜類化合物的青錢柳葉片提取液。液相條件：采用Agilent SB-C18(1.8 μm，2.1 mm×100 mm)的色譜柱，柱溫箱溫度維持在40℃，A流動相為超純水(0.1%的甲酸)，B流動相為乙腈(0.1%的甲酸)，梯度洗脫0.00～9.00 min B (5%～95%)，9～10 min B (95%)，10～11 min B (95%～5%)，11～14 min B (95%)，流速0.35 mL·min-1，柱溫40℃，進樣量4 μL。MS/MS質譜條件：離子源溫度550℃，離子源噴霧電壓5500V(+)/4500V(-)，離子源氣體Ⅰ為50 psi，氣體Ⅱ為60 psi，簾氣(CUR)為25 psi，碰撞誘導電離參數設置為高，三重四級桿掃描使用多反應監測模式(MRM)。

1.5 數據處理

采用spss 26.0軟件進行單因素方差分析、Duncan多重比較、皮爾森相關系數分析。采用Excel繪制月份動態變化的柱形圖，基于本地的代謝數據庫對樣本萜類代謝物進行定性分析。使用三重四級桿質譜，通過多反應監測模式(MRM)對樣本萜類代謝物進行定量分析。采用Analyst 1.6.3軟件處理質譜數據，采用MultiaQuant軟件打開質譜文件，積分色譜峰面積并校正，得到萜類代謝物的相對含量[16]。

2 結果與分析

2.1 青錢柳總三萜含量月份動態變化及其與月份相關性分析

2.1.1青錢柳總三萜含量的月份動態變化規律 對4月至11月青錢柳總三萜定量分析，結果(圖1)表明總三萜質量分數變化范圍在3.96%～8.36%，呈“雙峰型”的動態變化規律，單因素方差分析結果表明青錢柳總三萜質量分數在不同月份之間差異達到極顯著水平(P<0.01)。6月(8.36%)、7月(7.63%)、10月(8.05%)總三萜質量分數高，5月(4.49%)、9月(4.71%)、11月(3.96%)總三萜質量分數低，方差分析結果表明6、7、10月總三萜質量分數極顯著高于5、9、11月(P<0.01)。7月(7.63%)、8月(6.47%)、9月(4.71%)總三萜質量分數為下降趨勢，方差分析結果表明7、8月總三萜質量分數差異達到顯著水平(P<0.05)，8、9月總三萜質量分數差異達到極顯著水平(P<0.01)。

注：圖中不同小寫字母表示差異達到顯著水平(P<0.05)，不同大寫字母表示差異達到極顯著水平(P<0.01)

2.1.2青錢柳總三萜含量與月份的相關性分析 一元線性回歸分析結果表明，青錢柳總三萜質量分數與月份間呈負相關關系(圖2)。青錢柳總三萜質量分數與月份間的皮爾森相關性系數為-0.203，存在負相關關系。4月至11月青錢柳總三萜質量分數整體為下降的積累趨勢。

圖2 青錢柳總三萜質量分數與月份的相關性

2.2 10月青錢柳葉片的萜類物質成分分析

在青錢柳保健茶生產過程中，生產者通常在秋季采收青錢柳葉片，秋季的青錢柳葉片已成為生產青錢柳保健茶的主要原料。本研究結果表明，10月總三萜積累量高，因此決定分析10月青錢柳葉片的萜類代謝組。通過UPLC-MS/MS對10月青錢柳葉片萜類化合物進行定性定量分析，結果表明10月青錢柳葉片共檢測到69種萜類化合物，其中三萜類化合物含量最高為83.02%，其次分別為三萜皂苷類為11.02%、二萜類為2.01%、倍萜類為1.40%、萜類為1.37%、倍半萜為1.18%(圖3)。

圖3 萜類代謝物的類別及占比

萜類物質中相對含量排名前10的物質為馬達積雪草酸、坡模酸、常春藤皂苷元、2α-羥基熊果酸、11-酮基-熊果酸、α-香樹脂酮、科羅索酸、山楂酸、青錢柳苷Ⅱ、Pterocaryoside B，其中大多數為三萜類化合物，少部分為三萜皂苷(表1)。本研究共檢測到10種青錢柳苷類化合物，均屬于三萜類，分別為青錢柳苷Ⅱ、青錢柳苷K、青錢柳苷F、青錢柳苷J、青錢柳苷A、青錢柳苷C、青錢柳苷H、青錢柳苷Ⅰ、青錢柳苷E、青錢柳苷Ⅲ，其中青錢柳苷I、青錢柳苷A均屬于達瑪烷型三萜皂苷是青錢柳甜味的主要來源。

表1 萜類代謝物成分及相對含量

續表1

3 結論與討論

通過定量分析4月至11月青錢柳葉片總三萜，結果表明6月、10月總三萜積累量高，因此6月、10月為適宜的采收月份；青錢柳總三萜類物質呈“雙峰型”動態變化規律，產生的原因可能是青錢柳內在的生長節律、基因表達動態等[17-18]，外在的土壤肥力、光照、溫度、水分等[19-21]。4月至5月青錢柳剛結束休眠，次生代謝活動較弱[22-23]；6月營養生長期，總三萜積累量逐漸增加，SUN等[24]認為中國東南部低山丘陵的青錢柳人工種植區和天然群落可能會形成獨有的小氣候，在青錢柳生長期提供充足的水熱條件從而有利于萜類物質的合成；7月至9月是夏季，青錢柳進入繁殖階段，開花結果過程中可能逐漸消耗大量底物和中間體，只有少部分被用于萜類合成[25]；10月地上部分生物量高，然而氣溫逐漸下降，低溫等脅迫因子可能使總三萜在葉片的積累逐漸增加[26-27]；11月進入冬季葉片變黃脫落，總三萜積累量最低。今后可以通過青錢柳代謝組及轉錄組聯合分析，并結合環境因素進一步揭示萜類物質的積累變化規律[28-30]。

在青錢柳保健茶的生產過程中，生產者通常在秋季采收青錢柳葉片，此時青錢柳地上部分生物量高，活性物質積累多[31-32]，秋季的青錢柳葉片已成為生產青錢柳保健茶的主要原料，且本研究結果表明10月青錢柳總三萜積累量高，因此決定選取總三萜質量分數高的10月進一步研究萜類代謝組。本研究結果表明，10月青錢柳葉片共檢測到69種萜類化合物，其中三萜類最多，少部分以倍半萜、單萜等形式存在。在萜類中相對含量排名前10的物質為馬達積雪草酸、坡模酸、常春藤皂苷元、2α-羥基熊果酸、11-酮基-熊果酸、α-香樹脂酮、科羅索酸、山楂酸、青錢柳苷Ⅱ、Pterocaryoside B。積雪草酸及其衍生物屬于烏蘇烷型三萜皂苷，在青錢柳萜類代謝組中含量最高，郭冰潔[33]研究表明積雪草酸能夠抑制肝癌細胞增殖及轉移，并誘導癌細胞凋亡；柳軍等[34]研究表明積雪草酸能夠增加肝細胞對外周葡萄糖的攝取，并改善糖代謝，因此在未來進一步開發青錢柳積雪草酸及其衍生物，對治療糖尿病及癌癥等具有重要意義。坡模酸屬于烏蘇烷型三萜皂苷，其含量僅次于積雪草酸，LEE等[35]研究表明坡模酸能夠顯著增加肌肉細胞對葡萄糖的攝取，在未來可以作為無毒副作用的胰島素增敏劑。在青錢柳萜類化合物中科羅索酸、山楂酸含量相對較高，研究表明科羅索酸、山楂酸具有顯著的抗糖尿病、抗氧化、抗炎癥的作用[36]。青錢柳苷屬于三萜類，本研究共檢測到10種青錢柳苷類化合物，目前有7種被分離純化[37-39]，青錢柳苷類化合物在提取、分離、鑒定方面雖有一定的基礎，但其化學成分和結構與降血糖活性之間的關系尚未明確，因此今后對青錢柳苷類化合物降血糖活性進行深入的研究，對青錢柳藥理活性的深度開發具有重要意義。青錢柳在民間常被作為甜茶飲用，青錢柳茶獨特的甜味深受人們的歡迎，現代研究表明青錢柳三萜類物質是甜味的主要來源，舒任庚等[40]從青錢柳提取液中分離得到青錢柳苷I，并證實其具有強甜味；楊大堅等[41]從青錢柳提取液中分離得到青錢柳苷A，并證實其甜度超蔗糖的200倍。本研究檢測到青錢柳苷I、青錢柳苷A均屬于達瑪烷型三萜皂苷，可以進一步開發這類天然的甜味物質。綜上所述，青錢柳葉片中的萜類化合物在藥物方面具有良好的降血糖、抗氧化等功效，在食品方面具有獨特的風味，因此青錢柳葉片萜類成分的開發為功能性保健食品的市場及天然藥物的研發提供廣闊的前景。