水稻稻瘟病抗性基因座Piz和Pik的探秘之旅

田大剛

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所， 福建 福州 350003)

由稻瘟病菌引起的水稻稻瘟病是水稻生產(chǎn)上最具破壞性的病害之一。在流行年份大大降低了水稻產(chǎn)量和稻米品質(zhì)，病害暴發(fā)時(shí)幾乎無(wú)法控制。對(duì)水稻生產(chǎn)者來(lái)說(shuō)，避免由此造成的經(jīng)濟(jì)損失是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。在防治該病害的措施中，培育抗稻瘟病品種是經(jīng)濟(jì)和環(huán)境友好的首選策略[1]。水稻對(duì)稻瘟病的抗性符合“基因?qū)颉被プ髂Ｊ剑@使得抗性基因會(huì)因稻瘟病菌生理小種的快速變異而快速失去抗性，并由此導(dǎo)致抗病育種的進(jìn)展緩慢，嚴(yán)重地影響了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的需求。因此，不斷挖掘和利用新型稻瘟病抗性基因，將有助于解決這一難題。

自20世紀(jì)末以來(lái)，分子遺傳學(xué)技術(shù)在農(nóng)作物上的應(yīng)用大大加快了水稻抗稻瘟病研究的步伐。目前，水稻中已有超過(guò)130個(gè)抗性基因和350個(gè)數(shù)量性狀位點(diǎn)(QTL)定位在所有染色體上[2-3]；然而，大多數(shù)抗性基因的抗性水平較低，大部分功能還有待驗(yàn)證。在水稻中目前已克隆的26個(gè)主效抗性基因中，大多數(shù)編碼具有核苷酸結(jié)合位點(diǎn)(NBS)和富亮氨酸重復(fù)結(jié)合域(LRR)的蛋白質(zhì)，并且許多NBS-LRR型抗性基因作為等位基因位于同一基因座上[4]，其中以第6染色體的Piz基因座和第11染色體的Pik基因座最為突出。Piz基因座含有Pi9、Pi2、Pi50、Piz-t和Pigm等抗性基因，Pik基因座包含Pi1、Pik、Pik-m、Pik-p、Pik-s、Pik-h和Pike等抗性基因，這兩個(gè)基因座的大多數(shù)基因已被證實(shí)具有廣譜抗性，在抗病育種中具有較大的應(yīng)用潛力[5-6]。Piz和Pik基因座上的稻瘟病抗性基因Pi9、Piz-t和Pik/km/kp的有效性取決于其對(duì)應(yīng)的無(wú)毒基因AVR-Pi9、AVR-Piz-t和AVR-Pik/km/kp，目前已發(fā)現(xiàn)AVR-Pik主要有AVR-Pik-A、AVR-Pik-B、AVR-Pik-C、AVR-Pik-D、AVR-Pik-E和AVR-Pik-F等多個(gè)等位基因，并有報(bào)道AVR-Pik/km/kp和AVR-Piz-t通過(guò)基因獲得/缺失、堿基替換和轉(zhuǎn)座子插入等多種方式來(lái)逃避抗性基因的識(shí)別[7-11]。

為促進(jìn)Piz和Pik基因座上的功能基因在生產(chǎn)上的廣泛應(yīng)用，本課題組自2008年以來(lái)采用分子生物學(xué)、植物病理學(xué)和多組學(xué)的研究方法，一直在對(duì)它們的抗性機(jī)制和育種應(yīng)用進(jìn)行相關(guān)的研究。本文回顧了本課題組在稻瘟病抗性基因鑒定與篩選、新型抗性基因挖掘、功能基因標(biāo)記開(kāi)發(fā)和標(biāo)記輔助改良抗性等方面的研究工作，以及水稻抗病基因及稻瘟病菌無(wú)毒基因的研究進(jìn)展。

1 水稻稻瘟病抗性資源的篩選與鑒定

由于稻瘟病菌的遺傳復(fù)雜性和易變性等特點(diǎn)，造成利用單一主效基因的抗病品種在推廣應(yīng)用3～5年后易喪失抗性，引起病害的暴發(fā)和流行。因此，尋找廣譜抗性的抗源、挖掘及利用新抗病基因是解決問(wèn)題的關(guān)鍵。常規(guī)的抗性基因篩選利用不同的稻瘟病菌生理小種從地方品種、栽培品種或野生稻群體中進(jìn)行鑒定[12]，這種依據(jù)發(fā)病表型的篩選方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不適宜于大規(guī)模種質(zhì)資源鑒定。

通過(guò)在稻瘟病重發(fā)區(qū)的田間自然鑒定，可簡(jiǎn)便快捷地初選出抗性材料，再結(jié)合基于PCR的分子標(biāo)記鑒定，在確定含有已克隆基因材料的同時(shí)，可篩選出可能含有的新抗性基因種質(zhì)資源。目前，該方法已用于Piz和Pik基因座的功能基因的鑒定中[13-15]。例如，福建省沙縣富口鎮(zhèn)良種場(chǎng)位于沙縣西北部，水稻生長(zhǎng)季節(jié)高溫高濕，是稻瘟病重發(fā)、多發(fā)區(qū)，本課題組在該地從2009-2011年間對(duì)1 092份不同類型水稻種質(zhì)資源進(jìn)行了田間苗葉瘟和穗莖瘟的自然鑒定，篩選到中抗以上的種質(zhì)資源344份；同時(shí)，利用已報(bào)道的抗性基因分子標(biāo)記，確定了部分抗性種質(zhì)資源源于已知的抗性基因[16]。進(jìn)一步為挖掘新的抗病基因，本課題組還對(duì)篩選出來(lái)的谷豐A、閩北晚秈和02428等抗性資源進(jìn)行遺傳分析，確定谷豐A抗性不僅源于Pigm、Pid2和Pid3等已知基因[17]，還可能含有新基因[18-19]，閩北晚秈的抗性主要由Pigm基因貢獻(xiàn)，而02428中發(fā)現(xiàn)了新單倍型的抗性基因pi21[20]。

全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWAS)有助于理解復(fù)雜數(shù)量性狀和遺傳變異[21-23]。在水稻中，GWAS結(jié)合高通量測(cè)序和基因敲除技術(shù)已被用于快速鑒定影響產(chǎn)量、抽穗期、芒長(zhǎng)和其他農(nóng)藝性狀的新功能基因[24-25]。近年來(lái)，GWAS在定位水稻抗稻瘟病基因中也得到了廣泛的應(yīng)用。如陳學(xué)偉等[26]挖掘到1個(gè)調(diào)控廣譜抗病的C2H2轉(zhuǎn)錄因子Bsr-d1；Wang等[27]利用從中國(guó)各地收集的16個(gè)典型稻瘟病菌株，在秈稻群體中鑒定到30個(gè)與稻瘟病抗性相關(guān)的位點(diǎn)；Wang等[28]通過(guò)對(duì)低SSR標(biāo)記覆蓋率的151份材料進(jìn)行GWAS分析，確定了21個(gè)與稻瘟病抗性有關(guān)的位點(diǎn)，其中6個(gè)位于與已克隆的稻瘟病抗性基因的區(qū)域；Guo等[29]在對(duì)同樣是SSR標(biāo)記覆蓋率較低的227個(gè)粳稻的稻瘟病抗性基因分析中，確定13個(gè)顯著位點(diǎn)，其中8個(gè)是以前報(bào)道的稻瘟病抗性基因；Raboin等[30]通過(guò)對(duì)150份熱帶粳稻和190份秈稻品種的田間抗性評(píng)價(jià)，分別在粳稻品種的第1號(hào)、12號(hào)染色體和秈稻品種的第8號(hào)染色體上定位到3個(gè)顯著的位點(diǎn)，并確定了2個(gè)候選基因；Kang等[31]和Zhu等[32]分別通過(guò)在室內(nèi)用5個(gè)不同的稻瘟病菌株進(jìn)行接種試驗(yàn)及在3個(gè)水稻主產(chǎn)區(qū)對(duì)5個(gè)主要栽培稻亞群體的420份代表性材料進(jìn)行田間自然發(fā)病鑒定，前者鑒定出97個(gè)稻瘟病抗性位點(diǎn)，其中82個(gè)屬于未報(bào)道的基因；田間鑒定出的16個(gè)稻瘟病抗性位點(diǎn)中，有13個(gè)也是未報(bào)道的基因。Lin等[33]利用RDP I和兩個(gè)臺(tái)灣稻瘟病菌株，鑒定出32個(gè)與抗瘟性有關(guān)的QTLs，其中22個(gè)與先前報(bào)道的抗性基因或QTLs重合；此外，Li等[34]利用3個(gè)中國(guó)菌株對(duì)RDP I進(jìn)行了稻瘟病抗性的GWAS分析，鑒定到56個(gè)QTLs，其中1個(gè)對(duì)所有3個(gè)菌株都具有抗性，并被確定含有一個(gè)新的Pik等位基因；而Liu等[35]利用3個(gè)稻瘟病菌株對(duì)RDP II做了抗性鑒定，確定了27個(gè)與稻瘟病抗性相關(guān)的位點(diǎn)，其中22個(gè)為未報(bào)道的基因，并確定了1個(gè)新的抗性基因，該基因可對(duì)稻瘟病產(chǎn)生部分抗性。以上這些研究成果表明，GWAS技術(shù)是鑒定水稻稻瘟病新抗原的強(qiáng)有力工具。本課題組利用過(guò)去50年來(lái)積累的120份南方稻區(qū)主栽品種的測(cè)序數(shù)據(jù)，通過(guò)關(guān)聯(lián)室內(nèi)外稻瘟病抗性鑒定，獲得了多個(gè)顯著的區(qū)間，其中包括3個(gè)已克隆的稻瘟病抗性基因和1個(gè)新的位點(diǎn)(圖1A)。

圖1 利用多組學(xué)技術(shù)挖掘稻瘟病抗性基因和解析Piz-t抗性機(jī)制

2 水稻稻瘟病抗性基因與稻瘟病菌無(wú)毒基因的互作

在已確定的稻瘟病抗性基因與對(duì)應(yīng)無(wú)毒基因的配對(duì)中，如Pi-ta/AVR-Pita、Piz-t/AVR-Piz-t、Pik/AVR-Pik、Pia/AVR-Pia、Pi33/ACE1、Pi-CO39/AVR1-CO39、Pi54/AVR-Pi54、Pii/AVR-Pii、Pi9/AVRPi9和Pib/AVRPib[36]。其中Pi-ta/AVR-Pita和Piz-t/AVR-Piz-t是單個(gè)抗性基因識(shí)別單個(gè)AVR基因[37]，而在Pik、Pi5和Pia/Pi-Co39介導(dǎo)的識(shí)別相應(yīng)AVR基因的過(guò)程中，分別需要Pik-1和Pik-2、Pi5-1和Pi5-2以及由RGA4和RGA5組成的兩個(gè)R基因共同參與。近來(lái)，Cesari等根據(jù)水稻NLRs Pikp-1和RGA5蛋白利用HMA (重金屬相關(guān)的)物理結(jié)合稻瘟病菌無(wú)毒蛋白Avr-PikD、Avr-Pia和Avr1-CO39集成誘餌結(jié)構(gòu)域IDs以識(shí)別稻瘟菌效應(yīng)子的特性，在抗病蛋白R(shí)GA5_HMA中引入Pikp-1_HMA與Avr-PikD結(jié)合殘基，為RGA5_HMA創(chuàng)建了高親和力的結(jié)合表面。攜帶這種結(jié)合表面的RGA5變異體不僅能感知Avr-Pia和Avr1-CO39，還能識(shí)別Avr-PikD[38-39]。

值得注意的是，在CC型NLR蛋白ZAR1的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究中，ZAR1識(shí)別并被病原菌蛋白AvrAC激活后，組裝成含3個(gè)亞基共15個(gè)蛋白的環(huán)狀五聚體蛋白機(jī)器“抗病小體”，抗病小體形成后直接在細(xì)胞質(zhì)膜上發(fā)出自殺指令，很可能是植物細(xì)胞死亡和免疫執(zhí)行者[40-41]。另外，結(jié)構(gòu)分析表明TIR-NBS-LRR蛋白通過(guò)代謝分解輔助因子煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)，介導(dǎo)細(xì)胞死亡信號(hào)通路和誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性[42-43]。上述結(jié)果說(shuō)明了R蛋白通過(guò)多種機(jī)制介導(dǎo)植物的免疫反應(yīng)。因此，基于結(jié)構(gòu)的水稻抗稻瘟病相關(guān)蛋白的分析，可能有助于了解植物的免疫機(jī)制。例如，Zhou等[44]報(bào)道了水稻NPR1的高分辨率的三維結(jié)構(gòu)，從分子水平上闡述了水稻NPR1調(diào)控抗病的基因轉(zhuǎn)錄機(jī)制，反映了NPR1如何與同源或異源轉(zhuǎn)錄子結(jié)合來(lái)調(diào)控抵抗病原菌的基因轉(zhuǎn)錄模型。

為研究近年來(lái)福建省稻瘟病菌生理小種組成，利用2017-2019年收集自福建省17個(gè)縣市(地區(qū))的中稻稻瘟病穗頸瘟樣本分離單孢，用7個(gè)中國(guó)鑒別品種進(jìn)行分類鑒定，并從中篩選出60個(gè)福建省內(nèi)具有代表性的稻瘟病菌株。其中，稻瘟病菌生理小種ZA群出現(xiàn)頻率為39.48%，為優(yōu)勢(shì)種群；ZB、ZC和ZD群菌株的占比分別為23.68%、13.82%和11.18%，致病力達(dá)到50%以上的生理小種分布在邵武、建陽(yáng)、光澤、寧化、龍巖和松溪。這一結(jié)果說(shuō)明，不同區(qū)域和年份間的稻瘟病菌菌株致病力存在差異[45-46]。

了解水稻AVR基因的分子結(jié)構(gòu)及進(jìn)化，對(duì)于抗病育種中合理利用抗病基因，以及采取更有效的策略來(lái)控制病害發(fā)生具有潛在的意義。通常情況下，在病原菌與植物之間長(zhǎng)期的互作中，植物利用抗病基因來(lái)抵御病原菌，而病原菌也在試圖沖破植物的防御體系，它們之間的共同進(jìn)化在基因組水平上有跡可循[47-48]。稻瘟病菌利用無(wú)毒基因結(jié)構(gòu)突變來(lái)適應(yīng)寄主抗病基因和環(huán)境的變化[8，49-50]，因此，分析稻瘟病菌田間分離株的DNA序列變異，有助于了解水稻抗性基因的有效性和持久性。本課題組利用6個(gè)稻瘟病菌無(wú)毒基因和9個(gè)水稻抗性基因的分子標(biāo)記，分別檢測(cè)上杭縣稻瘟病菌35個(gè)生理小種和117個(gè)近50年來(lái)南方水稻主栽品種，結(jié)合在福建上杭的田間抗性鑒定，發(fā)現(xiàn)AVR-Pita、AVR-Piz-t和AVR-Pik都存在變異類型菌株，它們對(duì)應(yīng)的抗性基因在該地區(qū)也失去抗性；而另一方面Pigm、Pi2和Pi9基因?qū)υ摰氐木暧袕V譜的抗性，并且在這117份水稻中含有較少的Piz基因座的功能基因，說(shuō)明這些功能基因仍可以在當(dāng)前抗性育種中廣泛應(yīng)用。

3 多組學(xué)挖掘涉及水稻Piz-t基因調(diào)控的抗病新基因

水稻受到稻瘟病菌侵染時(shí)，會(huì)通過(guò)體內(nèi)的生化物質(zhì)調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而調(diào)節(jié)其抗病相關(guān)基因的表達(dá)，這是一個(gè)由多種信號(hào)通路所調(diào)節(jié)的復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，單從某一方面研究無(wú)法較為完整地探究其中機(jī)理。得益于日趨發(fā)展的測(cè)序技術(shù)及手段，以高通量、大規(guī)模、高靈敏度為特點(diǎn)的數(shù)據(jù)分析統(tǒng)計(jì)方法開(kāi)始大量應(yīng)用于作物應(yīng)答病原菌侵染的研究。在分子生物學(xué)和數(shù)據(jù)科學(xué)中，組學(xué)指的是研究發(fā)生在生物體內(nèi)特殊的、暫時(shí)的或全面性的變化；它是在一個(gè)單一或一群細(xì)胞、組織或器官中衡量功能和提取相關(guān)的生物信息。水稻全基因組序列的易獲得性，為基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組和代謝組學(xué)等多種組學(xué)研究提供了平臺(tái)[51-60]。

對(duì)生物體完整轉(zhuǎn)錄組的破譯始于20世紀(jì)90年代[61]。在過(guò)去30年中，利用深度測(cè)序技術(shù)的RNA-Seq方法在各種作物改良中獲得了巨大的推廣應(yīng)用。綜上所述，轉(zhuǎn)錄組學(xué)有助于破譯未注釋的基因和分析基因表達(dá)模式[62]。前期研究表明，水稻對(duì)稻瘟病菌的抗性是包括轉(zhuǎn)錄因子[MYB、WRKY、乙烯應(yīng)答因子(ERF)等]、信號(hào)激酶、亮氨酸重復(fù)基因、細(xì)胞壁修飾相關(guān)基因等多個(gè)調(diào)節(jié)子的聯(lián)合作用；同時(shí)，參與水稻抗性反應(yīng)的各種防御反應(yīng)基因上調(diào)[63]。但是，這些研究都缺乏水稻與稻瘟病互作的動(dòng)態(tài)變化。本課題組在比較轉(zhuǎn)Piz-t日本晴(NPB-Piz-t)與日本晴在接種稻瘟病菌KJ201的轉(zhuǎn)錄組學(xué)的分析中，確定了接菌后24 h是最特異的時(shí)間點(diǎn)(圖1B)，該時(shí)間點(diǎn)最顯著的蛋白-蛋白互作途徑包含絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路、與DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域相關(guān)的抗病基因。進(jìn)一步利用加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析確定了幾個(gè)與光合作用、重要農(nóng)藝性狀及特異核苷酸結(jié)合域和富亮氨酸重復(fù)(NLR)基因以及與B3 DNA結(jié)合域蛋白相關(guān)的基因在抗感病之間受到差異調(diào)控[64]。

蛋白質(zhì)組學(xué)由Mark Wilkins于1994年提出[65]。蛋白質(zhì)組學(xué)借助于其他組學(xué)技術(shù)，如基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)去認(rèn)識(shí)感興趣蛋白的結(jié)構(gòu)與功能。確切地說(shuō)，蛋白質(zhì)組是指細(xì)胞、組織或有機(jī)體中的一組或全部蛋白質(zhì)，它提供了一個(gè)在特定條件下數(shù)據(jù)豐富的表達(dá)蛋白全景。目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究幾乎涵蓋了正常或脅迫條件下的所有水稻組織和器官[66]。在水稻與稻瘟病菌互作方面，蛋白質(zhì)組學(xué)研究已經(jīng)揭示了DUF26、核苷酸結(jié)合富含亮氨酸重復(fù)序列、病程相關(guān)基因、活性氧產(chǎn)生清除酶、熱休克蛋白(HSPs)、核重組相關(guān)蛋白、轉(zhuǎn)錄因子和植物激素信號(hào)傳導(dǎo)在水稻抗病中的作用；其中對(duì)病原體感知和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的蛋白質(zhì)在病原菌侵染的早期階段發(fā)揮重要的作用。但在丙烯唑誘導(dǎo)蛋白1(PBZ1)和苯丙素在抗病和感病品種中的作用方面，iTRAQ與之前使用2-DE方法的研究結(jié)果相反，這說(shuō)明需要更系統(tǒng)的利用iTRAQ技術(shù)去挖掘和確認(rèn)這種互作中的關(guān)鍵因子[67]。本課題組利用iTRAQ技術(shù)比較NPB-Piz-t與日本晴在接種稻瘟病菌KJ201和RB22(KJ201和RB22分別對(duì)Piz-t表現(xiàn)為不致病和致病，但兩者對(duì)日本晴都是致病的)后的變化[68]，獲得56個(gè)在NPB-Piz-t與日本晴中都存在的差異表達(dá)蛋白，如Bowman-Birk胰蛋白酶抑制劑、C3HC4型RING家族E3泛素化酶、病程相關(guān)蛋白、與激素調(diào)節(jié)和防御及應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)的蛋白質(zhì)、類受體激酶和細(xì)胞色素P450等。有趣的是，NPB-Piz-t接菌KJ201和RB22之間只有少數(shù)不同的差異表達(dá)蛋白，如乙醇脫氫酶I、類受體蛋白激酶、內(nèi)切幾丁質(zhì)酶、類Rubisco大亞基、NADP依賴型蘋果酸酶和兩種假定蛋白，這些蛋白可能是導(dǎo)致抗感性不同結(jié)果的重要因素。如Bowman-Birk胰蛋白酶抑制劑APIP4和C3HC4型RING家族E3泛素化酶APIP10都參與到Piz-t調(diào)控的免疫反應(yīng)，后者不僅可以降解效應(yīng)蛋白Avr-Piz-t，激活PTI[69-70]；還可與維管植物單鋅指蛋白VOZ1/VOZ2互作，調(diào)控NLR蛋白Piz-t介導(dǎo)的ETI[71]。bZIP類型的轉(zhuǎn)錄因子APIP5也參與植物免疫調(diào)控[72-73]。之后，Zhang等[74]在水稻與白葉枯菌的互作研究中也做了類似的探索(圖1C)。

不同于基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)所揭示的細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)模式，代謝組學(xué)是利用高通量的技術(shù)來(lái)鑒定和定量一個(gè)細(xì)胞、組織或器官中所有小分子或代謝物的生命科學(xué)研究，以提供一個(gè)生物體或生物系統(tǒng)的生化狀態(tài)全貌[75]。最值得注意的是，代謝組學(xué)能提供生物體發(fā)生的證據(jù)，并描述了生化表型[76]。本課題組在NPB-Piz-t與日本晴接種稻瘟病菌KJ201的葉片中，相對(duì)于各自接種緩沖液的對(duì)照來(lái)說(shuō)，分別檢測(cè)到78個(gè)和52個(gè)(含22個(gè)共同的)的差異表達(dá)代謝物。N-順式-芥子酰酪胺和N-順式阿魏酰酪胺是它們中兩個(gè)差異最顯著的物質(zhì)，可作為生物防治稻瘟病害的候選。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，色氨酸代謝途徑和吲哚生物堿生物合成在抗病和感病反應(yīng)中差異顯著[77](圖1D)。多數(shù)吲哚生物堿是由色氨酸衍生而來(lái)的一類植物代謝產(chǎn)物[78]，它們?cè)?95種植物抵御病原菌和食草動(dòng)物侵害的過(guò)程中起著關(guān)鍵作用[79-80]，這使得生物堿在醫(yī)藥中得到廣泛應(yīng)用[81]。除此之外，已有研究報(bào)道如月桂素3-O-纖維二糖甙、脫落酸葡萄糖苷酯、橙黃決明素-6-O-葡萄糖苷、刺苞菊甙和櫻桃素等在抗稻瘟病的水稻品種中特異產(chǎn)生[82]，它們可作為開(kāi)發(fā)稻瘟病菌生物防治藥物的物質(zhì)基礎(chǔ)。

植物根部微生物組與植物免疫密切有關(guān)，加強(qiáng)病原微生物與有益微生物間互作的交叉研究，闡明植物識(shí)別病原菌和有益微生物的分子應(yīng)答和免疫反應(yīng)激發(fā)機(jī)制的差異，可為提高農(nóng)作物產(chǎn)量與抗性提供新的途徑[83]。目前尚缺乏水稻與稻瘟病菌互作對(duì)根部微生物影響相關(guān)的研究。本課題組采用16s rRNA和內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔子1(ITS1)序列分析方法，對(duì)NPB-Piz-t與日本晴在接種稻瘟病菌KJ201的根內(nèi)、根際土壤微生物進(jìn)行了測(cè)序。除根內(nèi)真菌豐富度外，根際土壤的細(xì)菌和真菌的豐富度和多樣性均高于根內(nèi)；接菌后的根內(nèi)細(xì)菌群落豐富度和多樣性有所增加，以日本晴的增加最多，而真菌豐富度和多樣性降低，分別以日本晴的豐富度和NPB-Piz-t的多樣性最低，且NPB-Piz-t與日本晴的根內(nèi)真菌存在顯著差異；共生網(wǎng)絡(luò)分析表明，細(xì)菌和真菌群落分別以藻門變形菌和子囊菌為主[83](圖1E)，該結(jié)果為利用微生物防控稻瘟病菌提供理論參考。

4 色氨酸代謝途徑介導(dǎo)水稻廣譜抗性

在上述的多組學(xué)分析Piz-t調(diào)控的抗性途徑中，色氨酸途徑在轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)和代謝物等多層次水平上受到影響，表明這一途徑參與了Piz-t調(diào)控的免疫反應(yīng)。

由色氨酸途徑生成的5-羥色胺是一種次生代謝物，易被活性氧氧化[84-85]。由于5-羥色胺抗氧化活性，其在抗病過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。另外，5-羥色胺也起著物理屏障的作用，使水稻對(duì)褐斑病和稻瘟病產(chǎn)生抗性；并在水稻對(duì)胡麻斑病的抗性反應(yīng)和衰老的過(guò)程中積累[86-89]。此外，水稻植株受到害蟲(chóng)入侵時(shí)，會(huì)誘導(dǎo)5-羥色胺的生物合成；而在5-羥色胺生物合成受到抑制時(shí)，則會(huì)增強(qiáng)水稻植物對(duì)螟蟲(chóng)和稻飛虱的抗性[90]。

SL基因控制5-羥色胺的合成，課題組借助于對(duì)SL基因突變體的研究，確定了sl突變體能提高水稻活性氧爆發(fā)水平，并能通過(guò)調(diào)控水楊酸、茉莉酸、乙烯和脫落酸等物質(zhì)的協(xié)調(diào)作用，增強(qiáng)水稻抗性。另外，sl突變體還廣泛參與對(duì)胡麻斑病、白葉枯病和稻飛虱的抗性[91-95]。與SL互作的泛素化蛋白SLBP可在體內(nèi)降解SL蛋白；不僅如此，在對(duì)比NPB-Piz-t與日本晴接菌KJ201的72 h時(shí)SL表達(dá)的數(shù)據(jù)時(shí)發(fā)現(xiàn)，SL在NPB-Piz-t中受到明顯抑制；進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)SLBP可與稻瘟菌無(wú)毒蛋白AvrPiz-t互作，表明SL可能參與Piz-t調(diào)控的ETI免疫反應(yīng)。

5 Piz和Pik基因座功能標(biāo)記的開(kāi)發(fā)及種質(zhì)資源鑒定

在已克隆的稻瘟病抗性基因中，接近1/3位于Piz和Pik基因座上，這些基因多數(shù)都是廣譜高抗基因；其中位于著絲粒近端的第6號(hào)染色體短臂上的Piz基因座的等位基因，如Pi2、Pi9、Piz-t和Pigm都嵌入在1個(gè)包含多個(gè)序列相關(guān)的同源基因的簇中，它們限定在LRR區(qū)域內(nèi)的有限序列變異決定了它們對(duì)不同稻瘟病菌株的識(shí)別特異性[96-98]。Piz基因座的等位基因間具有高度序列化的復(fù)雜組織結(jié)構(gòu)特征，使得開(kāi)發(fā)區(qū)別于這些基因的分子標(biāo)記十分困難。類似地，位于第11染色體長(zhǎng)壁末端的Pik基因座的抗性基因均由2個(gè)緊密連鎖但轉(zhuǎn)錄方向相反的CC-NBS-LRR類基因(Pik-1和Pik-2)共同決定，且基因序列間高度同源[6,15,99-100](圖2)。

為促進(jìn)Piz和Pik基因座所含功能基因在育種中的應(yīng)用，近年來(lái)出現(xiàn)了多個(gè)關(guān)于這兩個(gè)基因座功能基因的分子標(biāo)記[14, 101-103]，但由于多數(shù)標(biāo)記和基因有一定的遺傳距離或者需要酶切等步驟，因此很難在大規(guī)模種質(zhì)資源篩選或育種中應(yīng)用。本課題組基于Piz和Pik基因座的基因序列，開(kāi)發(fā)出Pi9-Pro、Pi2-LRR、Pigm/2/9InDel、Pikp-Del和Pi1-In等標(biāo)記[104-106](圖2)。利用這些標(biāo)記系統(tǒng)鑒定了我國(guó)南方水稻種植區(qū)的品種及育種材料，確定了Pi2、Pigm和Pik等抗性基因尚未在水稻生產(chǎn)中廣泛使用。這些信息不僅為下一步布局抗性基因提供試驗(yàn)數(shù)據(jù)，也便于利用這兩個(gè)基因座所含的功能基因開(kāi)展分子育種。

注：A.Piz 和Pik基因座功能基因；B.Piz 和Pik基因座功能基因標(biāo)記圖

6 Piz和Pik基因座用于創(chuàng)制水稻稻瘟病抗性新品種

分子標(biāo)記輔助育種是抗病育種的重要途徑，特別是針對(duì)已克隆基因的使用，大大縮短了育種周期和成本[107-110]。在早期利用已克隆稻瘟病抗性基因?qū)Ω＝▋?yōu)勢(shì)菌株的抗性鑒定中，篩選出具有廣譜高抗基因Pi9、Pi2和Pi1。為了加速它們?cè)谒旧a(chǎn)中的應(yīng)用，本課題組設(shè)計(jì)了一個(gè)基于回交轉(zhuǎn)育的策略。以供體親本C750或75-1-127(Pi9)、BL123(Pi1+Pi2)和華占(Pi2)與CBB23(Xa23)和B5(Bph14/Bph15)組合，改良抗性較弱的強(qiáng)優(yōu)勢(shì)恢復(fù)系閩恢6118、閩恢3189、恢316和閩恢3301雜交，在每個(gè)回交世代中選擇攜帶所有目標(biāo)基因的植株進(jìn)行進(jìn)一步回交；在每一代回交選擇中，首先對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行標(biāo)記選擇，然后對(duì)田間農(nóng)藝性狀進(jìn)行選擇；經(jīng)過(guò)5～7代回交后自交，選出目標(biāo)基因純合的植株進(jìn)行抗性和農(nóng)藝性狀評(píng)價(jià)，獲得了Pi9、Pi2和Pi1與其他抗性基因組合的品系[111-113]。經(jīng)稻瘟病抗性鑒定和農(nóng)藝性狀調(diào)查分析，改良系在產(chǎn)量幾乎不受影響的情況下，抗性水平得到了明顯的提高。所獲改良系CNA20110332.2、CNA20110330.4、CNA20110334.0和CNA20110333.1等已在生產(chǎn)中得到應(yīng)用，對(duì)水稻的穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)提供了保障。

7 展望

稻瘟病一直伴隨著水稻的生產(chǎn)，由于病害的復(fù)雜性，本課題組仍在尋找有效的防治措施。經(jīng)過(guò)近15年的深入研究，已經(jīng)對(duì)稻瘟病的發(fā)生規(guī)律和防治方法有了較深入的認(rèn)識(shí)。通過(guò)上述的研究，稻瘟病抗病機(jī)制逐漸顯現(xiàn)。更重要的是，本課題組和其他實(shí)驗(yàn)室培育了一些生產(chǎn)上適用的抗病品種，表明了利用分子標(biāo)記輔助育種將使抗病育種更加便利、快捷、有效。

然而，目前仍有許多問(wèn)題存在。由于對(duì)這些抗病基因的抗性機(jī)制尚不明確，由遺傳背景導(dǎo)致的抗性差異的原因也不清楚；生產(chǎn)中使用的抗病基因數(shù)量有限，并且大多數(shù)已確定的抗性基因的防治效果較小；導(dǎo)致了目前抗病育種中存在著針對(duì)特定水稻種植區(qū)的可用基因數(shù)量有限和基因選擇的盲目性。此外，由于抗病性狀、農(nóng)藝性狀和品質(zhì)性狀均受多基因控制，而且還可能存在選擇上的連鎖累贅，因此如何兼顧所有性狀仍是一個(gè)難題。綜合運(yùn)用基因編輯、合成生物、分子設(shè)計(jì)和全基因組選擇可能是今后進(jìn)行水稻性狀綜合改良的一種可行方法。