腹主動脈瘤病人血清和組織中Notch1和T細胞激活分泌調節因子的表達及其意義

李光澤 張濟 林昌儉 俞慎林 包平倩

腹主動脈瘤(abdominal aortic aneurysm，AAA)定義為腹主動脈局部擴張超過正常直徑的1.5倍，是一種老年人群的慢性退行性疾病，與炎性反應密切相關[1]。AAA早期無明顯癥狀，早期診斷指標有限，在發現時病人出現破裂和血栓的風險大大提高[2]。Notch通路是細胞內調控細胞免疫和炎性反應的關鍵通路，Notch被激活后可通過促進細胞中泌白細胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-6以及凋亡蛋白的分泌，從而引起血管重塑[3]。T細胞激活分泌調節因子(reduced upon activation mormal T expression and secreted，RANTES)是一種由血管細胞分泌的趨化因子配體，具有促進炎癥影響血管結構和功能的作用，參與血壓引起血管病變以及動脈粥樣硬化等[4]。本文分析Notch1和RANTES在AAA病人血清和組織中的表達及其意義。

對象與方法

一、對象

2019年1月～2021年1月于我院接受手術治療的AAA病人41例作為AAA組，年齡45～80歲，平均年齡(59.4±4.4)歲，男23例，女17例，吸煙史15例，高血壓18例，糖尿病8例。所有病人均保存外周血液標本，在手術過程中收集AAA組織和AAA旁距病灶3 cm以上的正常腹主動脈組織。同時選擇在我院進行體檢的健康志愿者41例作為健康組，年齡44～78歲，平均(58.7±4.5)歲，男22例，女18例，吸煙11例，高血壓12例，糖尿病5例。兩組一般資料比較差異無統計學意義。本研究經我院倫理委員會批準。納入標準：年齡45～80歲；CT血管造影符合AAA的診斷標準[5]；首次發??；病人均簽署知情同意書。排除標準：合并全身性感染；合并精神異常、意識障礙；合并惡性腫瘤、自身免疫性疾病、血液學疾??；資料不全。

二、方法

1.RT-qPCR檢測：提取外周血中總RNA，逆轉錄，條件：37 ℃/15分鐘；98 ℃/5分鐘。使用BestarTMqPCR試劑盒(DBI Bioscience公司，德國)進行qPCR實驗，條件如下：95 ℃ 2分鐘， 94 ℃ 20秒，58 ℃ 20秒，72 ℃ 20秒，40個循環，72 ℃下延伸4分鐘。使用Agilent Stratagene Mx3000P序列檢測系統進行RT-qPCR分析。通過比較循環閾值并以GAPDH作為內參計算Notch1 mRNA的相對表達水平。Notch1上游引物：5'-TCAGCGGGATCCACTGTGAG-3'，下游引物：5'-ACACAGGCAGGTGAACGAGTTG-3'，GAPDH上游引物：5'-TGAGGCTGGAAGTGGAAG-3'，下游引物：5'-CTTTAGGGTAGTGGTAGAAG-3' 。

2.ELISA檢測：外周血離心(2 000 rpm，20分鐘)收集血清。根據試劑盒說明書加入抗體和顯色劑進行反應，利用酶標儀檢測450 nm吸光度，根據標準曲線計算RANTES的濃度。

3.Western blot檢測：組織裂解后4 ℃，12 000 rpm離心5分鐘，收集總蛋白。8% SDS-PAGE分離樣品中等量(50 μg)的蛋白質，并轉移到硝酸纖維素膜上。室溫下將膜浸入5%脫脂牛奶中2小時封閉非特異性抗原。將膜分別與anti-Notch1和anti-RANTES在4 ℃下孵育過夜，將膜與相應的二抗室溫下孵育1小時。使用化學發光試劑盒進行顯色，使用Quantum One軟件分析灰度計算蛋白相對于GAPDH的表達量。

三、統計學處理

結果

1.血清中Notch1 mRNA和RANTES水平比較： AAA病人血清中Notch1 mRNA和RANTES水平均高于健康組，兩組比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 血清中Notch1 mRNA和RANTES水平比較

2.Notch1和RANTES蛋白在AAA組織中的表達：AAA組織中的Notch1和RANTES蛋白表達水平高于正常的腹主動脈組織，兩組比較差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1和表2。

圖1 Western blot檢測AAA組織和主動脈組織中Notch1和RANTES蛋白表達水平

表2 AAA組織和主動脈組織中Notch1和RANTES蛋白相對表達水平

3.Notch1和RANTES在血清和組織中的相關性：AAA病人組織Notch1蛋白水平和血清Notch1 mRNA水平正相關(r=0.485,P=0.025)；組織中RANTES蛋白水平與血清RANTES濃度正相關(r=0.506,P=0.016)。見圖2。

圖2 Notch1和RANTES在血清和組織中的相關性

4.AAA中Notch1與RANTES的相關性：在AAA病人組織和血清中，Notch1和RANTES表達均呈正相關(r血清=0.515,P=0.014；r組織=0.537,P=0.008)。見圖3。

圖3 AAA中Notch1與RANTES的相關性

討論

目前，治療AAA的方法仍主要為對癥治療。有研究表明，炎性反應參與AAA的發生和發展進程，且免疫細胞的浸潤和血管凋亡促進AAA疾病進展[6]。

Notch通路是誘導促炎基因轉錄的關鍵通路，在炎性進程中，Notch1蛋白過表達，其剪切下的NICD片段會進入細胞核誘導轉錄的激活，促進IL-6和TNF-α等的表達和分泌[7]。RANTES也稱為CC趨化因子配體5(CCL5)，是炎癥細胞的重要化學引物，與動脈的粥樣硬化發病機制有關[8]。RANTES可以由血管細胞和脂肪組織的常駐細胞產生，體外添加的血管緊張素Ⅱ會增加RANTES在小動脈和小靜脈內皮中的表達，而RANTES在血管周圍炎癥的發生中起關鍵作用，并引起高血壓相關的血管功能障礙[9]。本次研究主要分析Notch通路和RANTES是否參與了AAA的發生和發展，結果表明AAA病人血清中Notch1 mRNA和RANTES的水平顯著高于健康者，且AAA組織中的Notch1和RANTES蛋白水平也顯著高于正常AAA組織。此外，AAA組織中的Notch1和RANTES水平與血清正相關。本次研究結果初步表明，Notch1和RANTES的過表達可能參與了AAA的發生或發展，并且組織中的Notch1和RANTES水平可反應在血清中，提示檢測血清中Notch1和RANTES的水平可能是早期輔助診斷AAA的可行的指標。但是關于Notch1和RANTES在AAA中的臨床意義仍需要擴大樣本分析。

T淋巴細胞和組織中浸潤的巨噬細胞也參與AAA的發生和發展，它們會響應各種環境因素而發生表型變化，從而分泌細胞因子導致血管重塑[10-11]。Notch通路不但會促進T淋巴細胞分泌炎性因子，還會促進巨噬細胞向M1表型轉化，M1表型巨噬細胞會分泌IL-6和TNF-α等引起血管內皮細胞損傷、凋亡[12]。而Notch通路也會促進免疫細胞中RANTES的表達，從而進一步激活炎性反應[13]。本研究中，AAA病人血清和組織中Notch1和RANTES均呈現正相關，初步說明了Notch1和RANTES存在共同促炎的作用。文獻報道提示，Notch1可能通過促進RANTES的表達促進炎性反應，進而參與AAA[14]。然而，Notch1促進RANTES表達的機制仍需要進一步的細胞定位的方法驗證Notch1與RANTES表達在AAA組織中的何種細胞，從而進一步分析Notch1和RANTES參與AAA的機理。

綜上所述，AAA病人血清和組織中的Notch1和RANTES均過表達，且二者正相關。檢測血清Notch1 mRNA和RANTES水平對AAA早期診斷具有重要意義。