多肽類抗生素的環境安全性評價研究進展

王 磊，徐向月，馬文瑾，霍美霞，孫 磊，侯旖璇，劉海燕，林旭東，黃玲利*

(1.華中農業大學農業部畜禽產品質量安全風險評估實驗室，武漢430070；2.華中農業大學國家獸藥殘留基準實驗室(HZAU)，農業部食品殘留檢測重點實驗室，武漢430070)

多肽類抗生素(ABPs)是一類具有復雜多肽結構的化學物質，主要有桿菌肽、黏菌素和達托霉素等(圖1)。其中黏菌素主要是通過影響敏感細菌的外膜，發生靜電相互作用以破壞外膜的完整性，導致細菌功能障礙直至死亡，其對革蘭氏陰性桿菌如大腸桿菌、銅綠假單胞菌等的抗菌活性強。桿菌肽的作用機理主要是抑制細菌細胞壁的合成，而萬古霉素則是通過阻斷細胞壁蛋白質的合成，進而使細菌死亡，二者均對革蘭氏陽性菌如金黃色葡萄球菌、鏈球菌等有良好的抗菌活性。多肽類藥物擁有廣泛的靶標生物，在人類醫學和動物醫學中被廣泛使用，自20世紀60年代以來，桿菌肽和黏菌素一直被廣泛用作原料行業的抗生素和促生長劑[1]。據我國農業農村部統計，2019年我國ABPs的使用量達3500.70 t，占全部抗菌藥物使用量的11.33%，按獸用抗生素類別計使用量排第二，僅次于四環素類。目前上市的多肽類產品多是口服制劑，因其在經口給藥后不能被完全吸收，大部分多肽類產品以母體或代謝物的形式隨糞便排出體外[2,3]，導致其耐藥菌逐漸增多，因此，ABPs作為對抗多重耐藥細菌的最后手段變得越來越重要。

圖1 多肽類抗生素達托霉素、多黏菌素變體(B1、B2、E1和E2)和桿菌肽變體(A1、B1和C1)的化學結構

獸用抗生素在環境中的安全性評價主要包括抗生素的暴露風險評估和對環境的效應評估。目前，Davis等[4]在2020年研究調查了三種常用多肽類抗生素：桿菌肽、達托霉素和多黏菌素B和E(硫酸黏菌素)的環境歸宿。Yen等[5]在2021年檢測了黏菌素對斑馬魚胚胎的潛在毒性。考慮到ABPs的生物活性和抗生素耐藥性的潛在風險，對ABPs進行環境安全性評價是極其重要的[6]。

系統總結了ABPs在環境中安全性評價研究進展，解釋了ABPs在環境中的暴露現狀，闡明了ABPs在環境中的動力學行為特征和生態毒性效應，分析了ABPs耐藥菌及抗性基因形成特征及去除技術，為全面評估ABPs的環境安全性及有效避免或降低該類抗生素耐藥性及抗性基因(ARGs)的傳播提供科學依據。

1 多肽類抗生素在環境中的檢測方法及暴露現狀

1.1 多肽類抗生素在環境樣本中的檢測方法 目前，環境樣本中抗生素的檢測方法主要是采用超聲萃取-固相萃取、加速溶劑萃取-固相萃取、微波輔助萃取-固相萃取或QuEChERS前處理技術，使用液相色譜或液相色譜串聯質譜法進行定量測定，液相色譜串聯質譜法，是現階段最為常用的檢測方法[7]。液相色譜與高選擇性、髙靈敏度的質譜結合可以克服背景干擾，對復雜樣品達到很高的靈敏度[8]。

目前，多肽類抗生素在不同環境樣本中的檢測方法已有相關研究，如表1所示。Davis等[4]采用高效液相色譜-高分辨串聯質譜(HPLC/HRMS/MS)對土壤樣品中的多肽類抗生素進行分析，樣品經淋洗液A(0.1%甲酸)和淋洗液B(0.1%甲酸乙腈)梯度洗脫，在全掃描模式下采集數據。結果表明多肽類抗生素定量限分別為0.01～4.7 mg/L(達托霉素)，0.5～9.4 mg/L(多黏菌素B)，0.9～11.7 mg/L(多黏菌素ES)，0.6～9.7 mg/L(黏桿菌素A1)，0.3～5.6 mg/L(黏桿菌素B1)，0.07～1.3 mg/L(黏桿菌素C1)。Van等[9]建立了一種可同時檢測和定量豬糞中包括黏菌素在內的五種常見抗生素的超高效液相色譜-串聯質譜(UHPLC-MS/MS)方法，用乙腈和6%三氯乙酸的混合溶液提取后將上清液蒸發，最后使用1 mL 20%乙腈和0.1%甲酸的混合溶液復溶，UHPLC-MS/MS進行過濾，在C18色譜柱上進行梯度洗脫，所有化合物的回收率均在94%～106%之間，重復性百分比在1.7%～9.2%之間，室內重復性在2.8%～9.3%之間，該方法檢出限為1.1～20.2 mg/kg，定量限為3.5～67.3 mg/kg。Xia[10]等采用UHPLC-MS/MS方法測定了豬糞中黏菌素的濃度，使用10%三氯乙酸和乙腈的混合溶液進行提取，經WCX小柱凈化，黏菌素A和B的回收率在81～102%之間，定量限為10 mg/L。環境樣品基質復雜，前處理工作繁瑣，近年來固相萃取技術逐步應用到土壤、糞肥等抗生素檢測技術中，將萃取、富集等集于一體，提高前處理效率，保障方法的重復性[10]。

表1 幾種多肽類抗生素在不同環境樣本中的檢測方法

1.2 多肽類抗生素在環境中的暴露現狀 臨床醫療和畜禽養殖是環境中ABPs污染的主要來源，多肽類抗生素在不同環境基質中的暴露情況如表2所示。Menz等[12]采用基于使用模式的暴露篩選模型預測獸用抗生素平均和最壞情況下環境濃度。預測結果表明，在混有雞糞、豬糞和牛糞的土壤中，黏菌素平均濃度約為100 μg/kg。2017年，歐洲藥品管理局報告了達托霉素第一階段環境風險評估，考慮到成人和兒童給藥劑量不同，預測地表水中達托霉素的濃度為3.6～0.48 μg/L。Zhou等[13]對我國南方6個典型豬場和奶牛場11類50種抗生素的排泄量和環境發生情況進行評價，發現每頭豬和牛的標準化日排泄量分別為18.2 mg/d和4.24 mg/d，桿菌肽(3.81 mg/d)是每頭豬抗生素標準化日排泄量的主要貢獻者。Joy等[14]探討了不同施肥方式對施肥后土壤及徑流中桿菌肽及其ARGs的遷移的影響，采集含桿菌肽的新鮮豬糞，通過廣播、合并和注射方法進行土地施用，在處理組和對照組的土地上進行了三次降雨模擬試驗。結果表明，在新鮮豬糞中桿菌肽的濃度為320 mg/kg，經處理后，在任何徑流樣本中都沒有檢測到桿菌肽，但檢測出桿菌肽的降解產物桿菌肽F，用PCR方法在糞便樣品中未檢測到抗桿菌肽基因，可能是由于降雨條件下使桿菌肽加速降解為無活性的桿菌肽F，因此并未有充足的時間產生抗桿菌肽基因。

表2 幾種多肽類抗生素在不同環境基質中的暴露濃度

2 多肽類抗生素環境行為研究進展

2.1 多肽類抗生素在土壤中的吸附 獸藥進入環境后，會與土壤、黏土礦物、沉積物等環境介質發生吸附作用，這一過程對抗生素的遷移、降解以及生物可利用性都有重要的影響, 是決定抗生素在土壤中環境行為的關鍵過程之一[15]。Sarmah等[16]總結了四種獸用抗生素在環境中的暴露途徑及命運，其中桿菌肽在堿性粘土中不穩定，蛭石和伊利石對桿菌肽的吸附較低，這是由于在pH值為7.9～8.2的條件下，粘土的堿度引起的陰離子行為所致。桿菌肽是一種中性物質，也是一種多肽，與許多其他氨基酸一樣，可能以偶極分子的形式存在，在酸性溶液中，它以陽離子起作用，而在堿性溶液中，它以陰離子起作用，因此其在非堿性蒙脫石粘土的吸附量大。Davis等[4]研究調查了桿菌肽、達托霉素和多黏菌素B和E(硫酸黏菌素)的環境歸宿，結果表明桿菌肽在砂土中的吸附系數為5.8～8，僅有輕微吸附作用，在粘質土中的吸附系數為169～250，有顯著吸附作用；而硫酸黏菌素對砂土的吸附作用較強(Kd=111～256)，在粘質土中沒有表現出明顯的吸附作用。在GUS評價法中，有機污染物的GUS 值越大，表示其淋溶遷移性越高，污染地下水的可能性也越大。當GUS>2.8時，有機污染物具有高淋溶遷移性。呂穎等[17]在總結歸類環境中抗生素的基礎上，計算多種抗生素的地下水污染指數GUS值并估算各類抗生素的淋溶遷移性，其中黏菌素21.97，多黏霉素4.267，桿菌肽素6.41，三種多肽類抗生素均具有高淋溶遷移性，對地下水環境以及生態健康具有極大威脅。

2.2 多肽類抗生素在環境中的降解 降解是影響土壤中抗生素生態行為的重要因素。由于環境條件不同，土壤中抗菌藥可能發生一種或多種降解反應，獸藥在不同環境介質中的降解途徑主要包括微生物降解、化學降解和光降解三個部分。通常情況下，溫度、濕度和土壤類型等因素會影響抗生素在土壤中的降解作用。Sarmah等[16]研究了桿菌肽在土壤中的降解，在每克含有糞便的土壤中添加5.6 mg抗生素，30 ℃條件下培養30天后，23%的桿菌肽仍然存在；在20 ℃條件下培養30天后，33%的桿菌肽仍然存在。譚為軍[18]指出雖然降解過程在一定程度上減少了環境中獸藥的含量，但一些降解產物具有與其母體化合物相似的毒性，且在一定條件下可重新轉變成活性母體藥物。因此，獸藥的代謝及二次合成所引發的環境風險同樣不容忽視。那西肽是具有良好的生長刺激作用的含硫多肽類抗生素，田書音等[19]的研究表明隨動物糞便排出的那西肽仍然有抗菌活性，被排出的那西肽在豬糞和雞糞中的半衰期分別為30 d和20 d，但是在檢測用含有那西肽糞便作為肥料的作物時，在收獲的農產品中并未發現那西肽殘留，表明那西肽對環境的影響較小。Joy等[20]在厭氧條件下，研究了桿菌肽在豬糞中的行為，測定了其半衰期為1.9 d，降解較快，而在含有桿菌肽的豬糞中未檢測到桿菌肽抗性基因。

目前有關土壤中ABPs的吸附/解吸和降解的研究較少，仍處于對相關機理的認識和探索階段。土壤環境條件復雜，現階段環境中所存在的抗生素類型多樣，可結合養殖環境中的常用抗生素、具體的土壤質地以及氣候因素來開展競爭吸附等試驗，同時利用現代分子生物學技術，在分子水平深入探究土壤中的動物體內的累積和降解機理及微生物是否對于ABPs的降解產生影響，以此促進對ABPs在土壤中的吸附/解吸與降解機理的深入了解。

3 多肽類抗生素在環境中的生態效應評估研究進展

抗生素在土壤中的累積會對植物、土壤動物和微生物產生毒性效應，而其在農作物(如蔬菜)可食用部位的累積會導致食物鏈的污染，給人體健康造成潛在的危害。此外，進入土壤的抗生素所帶來的選擇壓力會誘導大量耐藥菌的生長，并且促進抗性基因在微生物間發生水平遷移，增加微生物群落的抗性，從而間接給公眾健康帶來風險。

3.1 陸生生物生態毒性 Guo等[21]研究了黏菌素對蚯蚓的生態毒性，發現黏菌素可上調熱休克蛋白70基因的表達，抑制金屬硫蛋白基因的表達，并且隨著黏菌素暴露時間的延長，蚯蚓腸上皮超微結構受損，尤其是當暴露于100 mg/kg濃度時，線粒體出現內膜損傷和空泡化。馬驛等[22]通過在土壤中添加不同濃度硫酸黏菌素，借助氯仿熏蒸浸提法和磷脂脂肪酸(PLFA)方法，分析土壤微生物生物量碳和微生物群落結構的變化特征，明確土壤微生物群落結構多樣性類型的分異程度，揭示了在硫酸黏菌素的影響下，土壤微生物的數量和活性大大降低，土壤中革蘭氏陰性菌PLFA表征的含量明顯低于革蘭氏陽性菌的含量，這與硫酸黏菌的殺菌機理有關，硫酸黏菌素為窄譜殺菌藥物，對革蘭氏陰性的殺菌活性強。而土壤微生物在改善土壤結構、降解土壤有機質方面有重要作用，氮是生物大分子蛋白質和核酸的關鍵組成元素，生物固氮約占全球植物需氮量的75%(質量分數)，土壤中多種微生物具有固氮能力，固氮微生物主要靠固氮酶來完成固氮，nifH基因負責編碼固氮酶組分鐵蛋白亞基，范葶莉等[23]通過提取土壤總DNA，采用末端限制性片段長度多樣性分析技術對土壤固氮微生物nifH基因進行多樣性分析，研究了硫酸黏菌素殘留對土壤固氮微生物nifH基因多樣性的影響，結果表明硫酸黏菌素影響了土壤固氮微生物nifH基因的多樣性，使土壤固氮微生物的豐富度和均勻度降低。ABPs的生態毒性效應雖有研究，但并未考慮到實際環境介質中ABPs的暴露量與蓄積量，且毒性作用機理尚不明確。

3.2 水生生物生態毒性 Yen等[5]檢測了黏菌素對斑馬魚胚胎的潛在毒性，研究表明黏菌素比之前分析的大多數抗生素毒性更大，致死濃度的黏菌素可以嚴重損傷皮膚角質層細胞，導致胚胎細胞的滲透溶解；亞致死濃度會損害側線毛細胞和機械轉導，這可能對魚類的生存構成威脅。桿菌肽作為飼料添加劑不僅能有效地抑制和殺滅魚體和水體中的病原微生物，還可以促進魚體生長，但近幾年研究發現，桿菌肽鋅對水環境有嚴重的破壞作用，在殺滅病原微生物的同時，還會殺滅水環境中有益微生物，破壞了水體微環境的生態平衡，造成水質惡化[24]，此外桿菌肽在水環境中的殘留也會通過食物鏈蓄積作用進入人體，對人體器官產生蓄積毒性作用。

實際環境中，包括土壤、水和糞肥，一般都是多種抗生素共存的，但現有研究以單一抗生素為考察對象的居多，這并不能充分反映實際環境中抗生素對微生物群落結構和抗性基因的影響。因此，應探討不同類型抗生素的復合污染物在不同濃度水平下對微生物的呼吸作用、多樣性和酶活性的作用機制，從而進一步探究抗生素污染對ARGs豐度的影響。

4 多肽類抗生素耐藥菌及抗性基因研究進展

4.1 多肽類抗生素耐藥菌及抗性基因的發生 由于抗生素在農業和人類醫療行業中的大規模使用，導致抗生素耐藥菌(ARB)和ARGs以及新耐藥機制的出現[25-28]。ARB和ARGs的出現是一個重大的公共衛生問題，在世界范圍內構成了嚴重的治療挑戰[26]。2016年，在上海附近一個集約化養殖場的一頭屠宰的豬中發現了第一例黏菌素耐藥大腸桿菌，且在2011～2014年的15%的檢測零售肉類和1%的回顧性分析樣本中也存在抗性基因mcr-1[29]。自從第一個黏菌素抗性基因被發現以來，近年來又發現了其他抗性基因mcr-2～mcr-9[30]。這些基因已被證實能引起脂多糖(LPS)膜中脂質A的修飾。2018年，不僅在亞洲國家，而且在澳大利亞、歐洲、非洲、北美和南美洲的豬糞、人類和環境樣本中發現了這些抗藥性基因[31]。Klees等[32]評估了肉類生產鏈中四種耐多藥細菌的流行率，在2018和2019年，在德國西北部共收集了來自肉類生產四個階段(屠宰場，肉類加工廠，新鮮食品和城市環境)的505個樣本，并利用PCR技術篩選耐多藥細菌的存在，在9～26%的所有階段樣本中檢測到黏菌素抗性編碼mcr基因，且耐黏菌素腸桿菌(Col-E)存在于所有階段樣品的1～7%，總體結果表明，攜帶Col-E的mcr在屠宰場、肉類加工廠和零售食品中普遍存在。

Liu等[33]對我國9個省23個市的53個超市或農貿市場的528份蔬菜樣品進行了mcr基因分析，并對mcr陽性的腸桿菌科細菌進行了鑒定，結果表明我國鮮菜中mcr-1的流行率很高，mcr-1的傳播是由類似的IncX4或IncI2質粒介導的，蔬菜中的質粒與臨床分離株中的質粒高度相似，這表明即食蔬菜生產商mcr-1可能會對公眾健康構成巨大威脅，需要采取措施確保食品安全。Yang等[34]利用從SRA獲得的122個水生宏基因組DNA數據集(92個湖水和30個海水)進行了全球調查，通過生物信息學分析，從數據集序列中提取ARGs和金屬抗性基因(MRGs)，結果表明在ARGs中，多藥耐藥基因和桿菌肽耐藥基因在湖泊和海水樣品中的相對豐度較高。由藍藻水華引起的抗生素抗性基因和微囊藻毒素(MCs)的二次污染問題已成為重大的全球問題，這兩種污染物共同存在于飲用水處理廠(DWTPs)中，Xu等[35]為了探究二者之間的關系，在實驗室條件下研究了MCs對ARGs水平轉移的影響，并在細胞和分子水平上探索了機制，結果表明MCs可以促進ARGs的傳播，特別是在相對穩定的環境下如生物膜中，MC-LR是促進接合轉移的最有效的微囊藻毒素亞型，比對照組高25.13倍，MCs通過調節參與接合轉移的一系列基因系統，刺激活性氧(ROS)的形成和增加細胞膜通透性來影響ARGs的水平轉移。

4.2 多肽類抗生素耐藥菌及抗性基因的去除 自從在大腸桿菌中發現黏菌素抗性基因mcr-1以來，質粒介導的黏菌素抗性基因mcr-1的出現和迅速傳播已經成為一個公共衛生問題，畜禽糞便是mcr-1的重要儲存庫，在高溫堆肥過程中，準確量化畜禽糞便中mcr-1的流行率和其中的動態變化的研究還很少，Gao等[36]對從四種畜禽糞便中采集的51份樣品中的mcr-1進行了檢測和定量分析，共有16份糞便樣品檢出mcr-1陽性，51份樣品的檢出率為31%，12份mcr-1陽性糞便樣品的mcr-1基因拷貝數為107～109 copies/g，堆肥過程中，在高溫(44～65 ℃)下，糞便中90%以上的mcr-1在15 d內被去除，22 d后完全檢測不到mcr-1，結果表明高溫堆肥有效地去除了mcr-1，并抑制了其從畜禽糞便向環境的擴散。Le等[37]研究了施用了黏菌素的糞便和堆肥對抗黏菌素大腸桿菌、肺炎克雷伯菌和銅綠假單胞菌的影響，以及糞肥中其ARGs的流行情況，結果表明施用帶有黏菌素的糞便對其耐藥菌沒有明顯的影響，并且堆肥能夠使其抗性基因減少，但即使經過6周的堆肥，攜帶抗性基因的質粒仍然可以向受體轉移，說明堆肥不能完全消除通過雞糞傳播抗生素耐藥性的風險。

堆肥工藝是有效去除ABPs抗性基因的方法，但ABPs在堆肥過程中的降解與遷移研究較少。堆肥工藝可控條件較多，可通過調節溫度、調整通氣量或通氣方式、控制堆肥時間和含水量等有針對性地優化堆肥條件，使ABPs及其耐藥基因得到有效的降解。

5 展 望

ABPs不僅在人類醫療行業中起到至關重要的作用，同時在養殖行業防治動物疾病發揮了巨大的作用，但也帶來了環境污染和公共健康方面的問題與挑戰。保護環境安全和人類健康的前提則是深入了解ABPs的環境行為和生態效應，進行風險評估。在環境樣本檢測方面，采用多種分析技術聯用是檢測土壤等環境樣本中ABPs的主要方法，但近年來對ABPs的遷移和去除方面的研究較少，ABPs在環境中的降解產物行為及毒性研究幾乎空白，為土壤中ABPs的作用機理研究提供新的思考角度。關于ABPs對植物的生態毒性并未進行深入研究，可利用現代分子生物學技術探究ABPs在植物中的積累和降解機理，以此為受污染土壤的作物種植和含抗生素畜禽糞便的施用量提供可靠的參考依據。研究如何能夠降低甚至去除環境中的ABPs及其耐藥基因殘留，是保護環境安全和人類健康的重要途徑之一，現階段對于ABPs的耐藥基因的去除技術僅有堆肥工藝，因此有關ABPs及其耐藥基因的去除技術仍需進一步研究。