馬波沙星原料質量標準的建立

董玲玲，張 璐，楊 星，龔旭昊，趙富華

(中國獸醫藥品監察所，北京100081)

馬波沙星(Marbofloxacin)，又叫麻保沙星，最早由瑞士羅氏公司研制，并于1995年先后在英法等國上市[1]，國內獸藥生產企業自2014年起陸續申報馬波沙星原料及其制劑。馬波沙星是獸醫專用的第三代喹諾酮類抗菌藥物，具有抗菌譜廣，消除半衰期長，生物利用度高的特點，獸藥市場發展前景良好，但是國內缺乏統一的質控標準。為進一步加強對獸藥安全性和有效性的控制，提高獸藥產品質量，將研究制定馬波沙星原料質量標準納入《中國獸藥典》2020年版科研任務。國內能查到馬波沙星原料相關質量標準5個，為申報企業的注冊標準[2-6]，歐洲藥典(EP 9.0)和英國藥典(BP 2017)也收載了馬波沙星原料質量標準[7]，對各質量標準進行比較，歐洲藥典和英國藥典收載的質量標準相同，所有標準中吸光度、干燥失重、熾灼殘渣、重金屬、含量測定方法相同，其余項目存在差異。在文獻查閱的基礎上，著重研究有關物質、殘留溶劑檢查和含量測定方法。最終建立的馬波沙星原料質量標準收載入《中國獸藥典》2020年版一部[8]，內容包括：性狀、鑒別(紫外光譜法和紅外光譜法)、吸光度、有關物質、干燥失重、熾灼殘渣、重金屬、含量測定等項目。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀(Waters e2489)配二極管陣列檢測器(2996)；瑞士萬通全自動滴定儀Titrando 809; AT201分析天平(Mettler Toledo); 色譜柱: Waters XTERRA RP18(4.6×150 mm,5 μm); Waters XBridge C18(4.6×150 mm, 5 μm); GRACE C18(4.6×150 mm,3 μm)。甲醇為色譜純，購自Merck公司。辛烷磺酸鈉、磷酸二氫鈉均為分析純，購自TCI公司。其余試劑均為分析純。馬波沙星原料6批，分別購自浙江國邦藥業股份有限公司(批號：160919；161011；170306)和海門慧聚藥業有限公司(批號：171101；171201；171202)。馬波沙星對照品，中國獸醫藥品監察所，批號：H0801511；馬波沙星雜質峰鑒別對照品，EP，批號：Y0002317-1。

2 方法與結果

2.1 有關物質檢查方法

2.1.1 方法的建立過程

2.1.1.1 色譜柱的選擇 現有標準方法流動相基本一致，僅比例略有不同，因此，選用EP方法中的流動相條件，并在此基礎上進行色譜柱的選擇?，F有標準方法中色譜柱填料類型均為十八烷基硅烷鍵合硅膠。研究過程中發現使用不同品牌C18色譜柱，馬波沙星主峰及各雜質峰保留時間差別較大，且各雜質相對于主峰的保留時間會發生變化，試驗三種不同品牌色譜柱，主峰保留時間及各雜質相對主峰保留時間結果見表1。由表1可知，不同品牌粒徑的C18色譜柱對馬波沙星主峰及各雜質峰的保留時間有影響。為保證主峰時間不至于過長，且有穩定的相對保留時間，因此在質量標準中提供色譜柱品牌型號信息作為參考，擬定色譜柱條件為“用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(XTERRA C18，4.6×150 mm，5 μm或其他效能相當的色譜柱)”。

表1 不同品牌色譜柱馬波沙星主峰保留時間及各雜質相對主峰保留時間結果表

2.1.1.2 各雜質的相對保留時間的確定 雜質鑒別對照品是一支混合對照品，溶解進樣后發現在主峰之前有四個色譜峰，相對主峰的保留時間分別為0.5，0.7，0.8和0.9，給雜質A和C的定位造成干擾。只能單獨進樣雜質A和C的定位溶液，確定了雜質A和C相對于馬波沙星主峰的保留時間分別為0.7和0.9(圖1)。取雜質鑒別對照品適量，加甲醇-水(23∶77)稀釋制成每1 mL中約含1 mg的溶液作為系統適用性溶液，精密量取10 μL，按擬定液相色譜條件(2.1.2項)連續進樣6針，主峰及各雜質峰的保留時間略有漂移，但各雜質峰相對馬波沙星峰的保留時間不變，其結果見表2。綜上，擬定雜質B、A、C、D、E的相對保留時間分別為0.5，0.7，0.9，1.3，1.5。

圖1 馬波沙星系統適用性溶液圖

表2 相對保留時間結果表

2.1.1.3 雜質限度規定 馬波沙星的6個雜質中，雜質C和D為合成中間體，雜質F主要在長期貯存過程產生。國內外各質量標準中各雜質限度及總雜質限度均相同，僅忽略限有不同。結合6批馬波沙星原料的有關物質檢查結果，各雜質限度直接參考EP的設定。目前未對雜質F作特別的規定，計入總雜質達到控制的目的，在積累穩定性數據之后，再考慮對其限度進行規定。EP標準中將雜質忽略限設定為0.1%，與雜質A、B的限度一致，雜質A、B只能是未檢出和不符合規定兩種結果，欠合理。結合方法檢測限和靈敏度考察結果，將忽略限定為0.05%。

2.1.2 有關物質質量標準 取本品適量，加甲醇-水(23∶77)適量，超聲處理使溶解并稀釋制成每1 mL中約含1 mg的溶液，作為供試品溶液；精密量取適量，加甲醇-水(23∶77)稀釋制成每1 mL中約含1 μg的溶液作為對照溶液。照高效液相色譜法(附錄0512)測定，用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(XTERRA C18，4.6×150 mm，5 μm或效能相當的色譜柱)。以甲醇-冰醋酸-磷酸鹽緩沖液(取磷酸二氫鈉2.7 g、辛烷磺酸鈉3.5 g，加水1000 mL使溶解，用磷酸調節pH值至2.5)(230∶5∶770)為流動相；檢測波長315 nm；流速為1.2 mL/min；柱溫為40 ℃。取馬波沙星雜質峰鑒別對照品(含雜質A、B、C、D、E)10 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇-水(23∶77)稀釋至刻度，搖勻，作為系統適用性溶液，精密量取10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分峰保留時間的2.5倍，馬波沙星峰保留時間約為33 min，雜質B、A、C、D、E峰相對于馬波沙星峰的保留時間分別約為0.5、0.7、0.9、1.3和1.5，雜質C峰和馬波沙星峰的分離度應大于1.5，雜質D峰和馬波沙星峰的分離度應大于4.0。精密量取供試品溶液和對照溶液各10 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分峰保留時間的2.5倍。供試品溶液色譜圖中如有雜質峰，雜質A、B峰面積不得大于對照溶液主峰面積(0.1%)；雜質C、D峰面積不得大于對照溶液主峰面積的2倍(0.2%)；雜質E按校正后峰面積計算(乘以校正因子1.5)不得大于對照溶液主峰面積的2倍(0.2%)；按校正后峰面積計算各雜質峰面積之和不得大于對照溶液主峰面積的5倍(0.5%)。供試品溶液色譜圖中小于對照溶液主峰面積0.5倍(0.05%)的色譜峰忽略不計。

2.1.3方法學驗證

2.1.3.1 專屬性 溶劑空白：以甲醇-水(23∶77)作為溶劑空白。系統適用性溶液：取馬波沙星雜質峰鑒別對照品(含雜質A、B、C、D、E)10 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇-水(23∶77)稀釋至刻度，搖勻，過濾，取續濾液，即得。供試品溶液：取供試品10 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇-水(23∶77)稀釋至刻度，搖勻，過濾，取續濾液，即得。

精密量取上述溶液各10 μL，按照擬定質量標準有關物質色譜條件進行測定，結果顯示在溶劑空白圖譜中(圖2)，馬波沙星主峰及各雜質峰出峰處無干擾；雜質鑒別對照品色譜圖中，馬波沙星主峰及各雜質色譜峰峰純度均小于閾值，均為單一物質峰。

圖2 馬波沙星有關物質溶劑空白色譜圖

2.1.3.2 檢測限 稱取馬波沙星對照品10 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇-水(23∶77)適量，超聲使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，精密量取適量0.1 mL至100 mL量瓶中，得0.1%(1 μg/mL)的溶液，再精密量取適量，加甲醇-水(23∶77)系列稀釋，得0.05%(0.5 μg/mL)、0.02%(0.2 μg/mL)、0.01%(0.1 μg/mL)的溶液，精密量取各溶液10 μL，按照擬定的有關物質檢查的色譜條件進行測定，結果顯示，0.01%溶液主峰信噪比為4.3，故有關物質測定法的檢測限為0.01%。

2.1.3.3 精密度(重復性) 配制濃度為0.1%(1 μg/mL)的馬波沙星對照品溶液和系統適用性溶液，精密量取上述兩種溶液各10 μL，按照擬定標準中有關物質色譜條件進樣測定，平行測定6次。結果：在0.1%的濃度水平下，6次測定馬波沙星峰面積RSD為1.1%；系統適用性溶液6次測定下各雜質相對于馬波沙星主峰的保留時間不變，該方法的精密度良好。

2.1.3.4 耐用性 既定流速為1.2 mL/min，柱溫為40 ℃。調節流速為1.0、1.3 mL/min，調節柱溫為38、42 ℃，以系統適用性溶液按照擬定標準中有關物質色譜條件進樣測定，考察方法的耐用性，結果當流速在1.0～1.3 mL/min的范圍內變化，柱溫在40±2 ℃的范圍內變化，檢出的雜質峰個數未發生改變，各雜質峰之間的分離情況符合規定，該方法的適用性良好。

2.1.3.5 溶液穩定性 取一批供試品溶液，按照擬定色譜條件，分別在第0、4、8、12、24 h進樣測定，考察檢出雜質峰個數和雜質含量，結果在24 h內，檢出的雜質峰個數不變，雜質量及總雜質量未發生改變，供試品溶液穩定。

2.1.4 有關物質檢查結果 取6批馬波沙星原料，按擬定色譜條件檢驗，結果見表3。所得結果與生產企業自檢報告中結果一致，方法可行。

表3 馬波沙星原料有關物質檢查結果表

2.2 殘留溶劑檢查方法

2.2.1 殘留溶劑的檢查方法建立與方法學考察 見作者發表的文章：頂空毛細管GC法測定馬波沙星原料藥中6種溶劑的殘留量[9]。

2.2.2 殘留溶劑質量標準 取供試品約0.1 g，精密稱定，置頂空瓶中，精密加入N,N-二甲基甲酰胺1 mL，密封，作為供試品溶液；分別精密稱取甲醇、乙醇、乙腈、二氯甲烷、苯與甲苯適量，加N,N-二甲基甲酰胺定量稀釋制成每1 mL中分別含甲醇0.3 mg、乙醇0.5 mg、乙腈0.041 mg、二氯甲烷0.06 mg、苯0.002 mg和甲苯0.089 mg 的混合溶液，精密量取1 mL，置頂空瓶中，密封，作為對照品溶液。照殘留溶劑測定法(附錄0861第二法)測定。以6%氰丙基苯基-94%二甲基聚硅氧烷(或極性相近)為固定液的毛細管柱為色譜柱；初始溫度為40 ℃，維持10 min后，以每分鐘20 ℃的速率升溫至80 ℃，維持2 min，再以每分鐘30 ℃的速率升溫至200 ℃，維持5 min。以氮氣為載氣，線速為每秒24.1 cm，分流比為5∶1；進樣口溫度為180 ℃；檢測器為火焰離子化檢測器(FID)，檢測器溫度為250 ℃；頂空瓶平衡溫度為105 ℃，平衡時間為20 min。取對照品溶液頂空進樣，記錄色譜圖，出峰順序依次為：乙醇、乙腈、二氯甲烷、苯與甲苯，各色譜峰間的分離度應符合要求。取供試品溶液和對照品溶液分別頂空進樣，記錄色譜圖，按外標法以峰面積計算，均應符合規定。

2.2.3 殘留溶劑檢查結果 取6批馬波沙星原料，按擬定殘留溶劑檢查方法檢驗，結果見表4。所得結果與生產企業自檢報告中結果一致，方法可行。

表4 馬波沙星殘留溶劑結果表

2.3 含量測定方法

2.3.1 含量測定方法的確立 國內外現有質量標準中含量測定方法相同，均為電位滴定法。考慮到原料純度高且不存在輔料的干擾，容量法測定含量專屬性良好。為進一步驗證容量法測定含量的可靠性，參考馬波沙星制劑的含量測定方法(HPLC法，外標法)[2]測定6批馬波沙星原料的含量，與電位滴定法測定結果相比較(表5)，相對偏差不大于0.02%，最終仍以電位滴定法作為馬波沙星含量測定方法。

2.3.2 含量測定方法 取本品約0.3 g，精密稱定，加冰醋酸80 mL使溶解，照電位滴定法(附錄0701)，用高氯酸滴定液(0.1 mol/L)滴定，并將滴定的結果用空白試驗校正，每1 mL鹽酸滴定液(0.1 mol/L)相當于36.24 mg的C17H19FN4O4。

2.3.3 含量測定結果 取6批馬波沙星原料，按擬定含量測定方法檢驗，結果見表5。

表5 馬波沙星原料含量測定結果表

3 討 論

3.1 破壞試驗 為進一步驗證有關物質檢查方法對雜質的檢出能力，研究過程中進行破壞試驗，采用強光照射，酸或堿破壞，氧化破壞及加熱等方式。按照擬定的有關物質色譜條件進行測定，馬波沙星原料在光照、加熱和常規酸堿破壞條件下比較穩定。又采用酸堿破壞同時水浴的辦法，破壞產生雜質，主要為雜質D、E、F，均為方法本身控制的雜質。方法本身控制的雜質種類齊全，已包括合成中間體雜質，說明方法檢出能力強。

3.2 質量標準中未收錄殘留溶劑檢查的原因 因各企業生產工藝不同，殘留溶劑種類也不盡相同，雖然已建立的殘留溶劑質量標準涵蓋了所有可能出現的殘留溶劑種類，但參考各生產企業殘留溶劑檢查結果，僅檢出乙醇和甲苯兩種溶劑殘留，且殘留量均遠低于限量，因此最終建立的質量標準中未收錄殘留溶劑檢查項。

3.3 質量標準中的其他項目 除了對有關物質、殘留溶劑和含量測定項目進行了重點研究之外，其余項目均參照EP質量標準，采用6批馬波沙星原料進行驗證。最終建立的馬波沙星原料質量標準包括性狀、鑒別(紫外光譜法和紅外光譜法)、吸光度、有關物質、干燥失重、熾灼殘渣、重金屬、含量測定等項目，內容完善，可用于馬波沙星原料的質量控制，收載入《中國獸藥典》2020年版一部。