羊水染色體核型分析聯合基因芯片在高危孕婦產前染色體畸變篩查中的應用

易巧蘭 陳小東 梁榮坤 鐘羽彤

1 福建醫科大學附屬龍巖第一醫院檢驗科，福建省龍巖市 364000；2 福建省龍巖市疾病預防控制中心檢驗科

染色體畸形是威脅人類生育質量的先天性遺傳性疾病，目前醫學界尚無有效的預防手段。因此，產前篩查及診斷染色體疾病，減少出生缺陷越來越受到重視。目前，羊水染色體核型分析是產前診斷染色體畸變的主要方法，可檢測出胎兒染色體數目與結構的異常，但該技術分辨率較低，對<5～10bp的染色體異常較難檢查，存在漏檢染色體微缺失或微重復狀況，且羊水染色體核型分析一般2周時間才可得到結果，不適宜在危重癥產婦中開展[1-2]?；蛐酒墙⒃诨蛱结樅碗s交測序技術上的一種高效快速的核酸序列分析技術，可檢出染色體的微缺失與微重復，彌補羊水染色體核型分析的不足[3-4]。目前，臨床比較兩種技術篩查孕婦產前染色體畸變的對比研究較多，而聯合篩查的研究相對較少。鑒于此，本研究旨在分析羊水染色體核型分析聯合基因芯片在高危孕婦產前染色體畸變篩查中的價值，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究經醫學倫理委員會審核批準，選取2021年2—10月于福建醫科大學附屬龍巖第一醫院門診進行產前染色體畸變篩查的125例疑似高危產婦為研究對象，產婦及家屬均簽署知情同意書。納入標準：(1)單胎妊娠、活胎；(2)于醫院建立產檢卡，且定期進行產檢；(3)于醫院接受羊水染色體核型、基因芯片檢查。排除標準：(1)具有先兆流產傾向；(2)有出血傾向(血小板≤70×109/L，凝血功能檢查異常)；(3)伴有盆腔或宮腔感染；(4)非自然妊娠；(5)體溫>37.2℃。125例孕婦年齡24～46歲，中位年齡[35.00(31.00，38.00)]歲；篩查時孕周16～28周，中位孕周[22.00(21.00，22.00)]周；孕次1～3次，中位孕次[2.00(2.00，3.00)]次；B超檢查異常21例，不良孕產史8例，血清篩查高危20例，頸部透明層(Nuchal translucency，NT)增厚14例，高齡孕婦62例。

1.2 方法

1.2.1 標本取材：孕婦及家屬均簽署羊水穿刺知情同意書，于孕16～28周在超聲(GE Ultrasound Korea, Ltd，國械注進20152232990，型號：LOGIQ P9)引導下抽取羊水30ml左右，具體方法：孕婦排空膀胱，取仰臥位，通過B超觀察胎盤位置、羊水量，確定穿刺點(需避開胎盤，尋找最大又緊貼腹壁的羊水池)；腹部消毒鋪巾，在無菌操作下，采用一次性腰穿針抽取羊水30ml，放入3個無菌管中。

1.2.2 羊水染色體核型分析：將2支無菌管，以1 500r/min速率離心10min，吸去上層清液，取下層沉淀，分別接種于5ml的羊水培養基中并混勻；分別放置在37℃、5%CO2的培養箱內，第7天后通過奧林巴斯YMPUS CKX4倒置顯微鏡觀察羊水細胞生長情況，若出現多個細胞集落生長進行換液再次培養；第9天時再次觀察生長情況，若細胞背景層出現折光性較強的圓形細胞>8個則表示生長狀況理想，加入100μg/ml秋水仙素2滴，4h后行細胞收獲、制片，并行常規染色體G顯帶，掃片后分析5個，計數20，參照《染色體核型檢驗診斷報告模式專家共識》[5]對染色體核型進行分析。

1.2.3 基因芯片：將基因芯片送至北京貝康醫學檢驗所進行檢查，具體方法：將另1個10ml的羊水標本以1 700r/min速率離心10min，棄上清，取沉淀物，采用核酸提取試劑盒提取羊水基因組DNA，保存于-20℃環境中，采用核酸蛋白分析儀(貝克曼庫爾特，IMMAGE 800型)測定DNA的濃度與純度，要求基因組DNA濃度>25μg/μl。(1)消化：將5μl全基因組DNA采用NspⅠ酶隨機消化為短片段；(2)連接：將消化后產物末端補齊后連接上共同引物；(3)PCR擴增：將上述處理后樣本擴增至150～2 000bp片段；(4)PCR產物純化：將擴增的產物采用磁珠法進行純化；(5)片段化：通過片段化酶片段化為25～125bp片段：(6)標記：連接上生物素標記；(7)雜交：將標記后產物與雜交液混合均勻并變性，加載于750 K芯片置于雜交箱子中，在50℃、60r/min條件下雜交16～18h；(8)沖洗、染色：將雜交后的芯片洗滌并染色；(9)掃描：將芯片放置于微陣列芯片掃描儀(博奧生物有限公司，LuxScan10K-B型)中獲取相關數據；(10)分析：參照《染色體基因組芯片在兒科遺傳病的臨床應用專家共識》[6]對相關軟件處理結果進行判讀。

1.2.4 病理或隨訪：染色體核型分析、基因芯片單獨及聯合檢查提示產前染色體畸變的孕婦在多學科聯合會診中心進行全面產前咨詢，并根據孕婦意愿選擇終止妊娠或繼續妊娠至正常分娩；選擇終止妊娠者，其引產胎兒由新生兒醫生進行臨床檢查；未引產者根據胎兒出生后的癥狀、體征及染色體檢查確診。

1.3 觀察指標 記錄病理及隨訪結果；記錄染色體核型分析、基因芯片單獨及聯合檢查的異常情況。其中單項檢查中任何一項異常則聯合檢查異常。

2 結果

2.1 病理及隨訪結果 經病理或隨訪確診，125例疑似高危產婦中胎兒染色體畸變為22例。其中B超檢查異常產婦中3例，不良孕產史產婦中2例，血清篩查高危產婦中5例，NT增厚產婦中10例，高齡孕婦中2例。

2.2 羊水染色體核型分析、基因芯片單獨及聯合篩查疑似高危孕婦產前染色體畸變情況 125例產婦羊水培養均成功，基因芯片均成功提取基因DNA。羊水染色體核型分析篩查中15例異常，檢出率為68.18%(15/22)；基因芯片中15例異常，檢出率為68.18%(15/22)；聯合篩查檢出22例，檢出率為100.00%(22/22)，羊水染色體核型分析聯合基因芯片聯合篩查產前染色體畸變檢出率高于單獨技術篩查，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.3 羊水染色體核型分析、基因芯片篩查高危孕婦產前染色體畸變類型 羊水染色體核型分析、基因芯片篩查對染色體非整倍數、嵌合染色體檢出率均為100.00%；羊水染色體核型分析對染色易位、倒拉檢出率為100.00%，對微小片段缺失或重復檢出率為0.00%；基因芯片對染色易位、倒拉的檢查率為0.00%，對微小片段缺失或重復的檢出率為100.00%。見表1。

表1 羊水染色體核型分析、基因芯片篩查高危孕婦產前染色體畸變類型[n(%)]

3 討論

染色體是基因的載體，染色體異?？蓪е禄蛟黾踊蛉笔?，從而導致胎兒發育異常、多器官或多組織畸形、多發自然流產或死胎等，是造成新生兒出生缺陷的重要原因之一。目前，羊水染色體核型分析是細胞遺傳學中較為成熟的技術，通過提取高危孕婦羊膜腔內羊水，進行一系列脫落細胞培養等，可分析出染色體數目異常和較大片段的染色體缺失、重復、易位、插入、倒拉等，是降低出生缺陷的有效手段，且對孕婦再次生育時的再發風險評估與遺傳咨詢均具有指導性意義[7]。但臨床多項研究發現，常規G顯帶核型分析無法檢測微小片段缺失或重復，且樣本污染或培養失敗，無法得出分析結果[8-9]。因此，快速產前診斷技術的開發與應用研究得到了廣泛的關注。

基因芯片即DNA芯片，其實質是Southern技術的反向應用，利用原位合成或已合成好的一系列寡核苷酸固定于介質上，制備呈高密度的寡核苷酸陣列，促使基因樣本與探針在載體表面上雜交，可用于基因多態性、DNA測序、基因突變分析等[10]。該技術可檢測出>1kb的染色體不平衡畸變，且無須制備中期染色體，只需1μg的DNA量就可檢測出全基因組DNA拷貝數的變化，且全程由儀器操作，可減少人為主觀因素的干擾，對提高產前染色體畸變篩查的準確率具有一定的作用[11]。但由于染色體的平衡性變異，不涉及遺傳物質的丟失或增加，基因芯片無法檢出染色易位、倒拉等情況[12]。因而，從理論上來說，羊水染色體核型分析聯合基因芯片篩查產前染色體畸變可發揮各自的優勢，可進一步發現染色體畸變情況。本研究結果顯示，在125例疑似高危產婦中，羊水染色體核型分析聯合基因芯片篩查出的產前染色體畸變檢出率高于單項技術篩查，證實了上述推測，且分析兩種方法檢查的染色體畸變類型，發現羊水染色體核型分析可精確檢測出易位、倒拉等大片段的染色體結構異常情況，而基因芯片可檢測出微小染色體的缺失、重復情況，因而，二種檢查方法可優勢互補，可提高檢查的準確率。

綜上所述，高危孕婦產前染色體畸變篩查中運用羊水染色體核型分析聯合基因芯片檢查可減少單獨檢測的漏檢率，提高檢出率，對降低胎兒出生缺陷具有重要的指導作用。