缺血性腦卒中差異表達基因篩選、功能富集與相關信號通路生物信息學分析

武金燕

天津市靜海區醫院 天津醫科大學靜海臨床學院神經內科 301600

缺血性腦卒中(Ischemic stroke，IS)是臨床最為常見的腦血管病。相關數據顯示，2020年IS是全球第二大最常見的死亡原因，造成約700萬人死亡(約占總死亡人數的11%)[1]。2020年，大約有1 800萬人罹患IS，其中2/3的IS發生在65歲以上的人群中，而南亞人IS的風險尤其高，占全球IS死亡人數的40%[2]。IS發生后，當缺血的腦組織中氧氣或葡萄糖消耗殆盡，高能磷酸化合物(如三磷酸腺苷)將不再產生，進而導致組織細胞生存所必需的能量依賴過程(如離子泵)無法進行[3-4]，導致細胞損傷和死亡。目前認為，IS的發生有一定的遺傳背景因素，多個基因的差異時空表達可能影響IS的發生和預后[5]。本研究采用生物信息大數據分析方法篩選IS相關差異基因并進行可能的信號通路分析。

1 數據與方法

1.1 數據來源及數據庫分析 選取基因表達譜公共數據庫GEO，對GEO數據庫中關于IS患者與正常人群外周血中差異表達基因譜數據進行篩選，并對差異表達基因進行篩選。篩選條件為IS組和正常人群中上調或下調超過2個拷貝的基因。對不同數據集中篩選出的基因進行分析，選取重疊的差異基因(共差異基因)作為研究對象。選擇蛋白—蛋白相互作用數據庫STRING(http://string-db.org/cgi/input.pl)，對公差異表達基因進行蛋白拓撲網絡構建。采用KEGG數據庫對，共差異表達基因信號通路進行分析。

1.2 IS差異表達基因篩選 GEO數據庫中檢索IS基因表達數據集，檢索詞為“Ischemic stroke”，種屬為“human”。進一步對檢索到的結果進行篩選，選取GSE22255[6]、GSE98319和GSE66724[7]三個數據集進行分析。根據數據集中IS患者與健康人群外周血中的基因表達譜情況進行篩選，篩選條件為IS組和正常人群中上調或下調超過2個拷貝的基因，且P<0.05；分別對GSE22255、GSE98319和GSE66724數據集中的差異基因進行重疊分析，選取共差異表達基因，并繪制Venn圖。

1.3 功能富集及信號通路分析 在STRING數據庫中對篩選出的共差異表達基因進行蛋白相互作用拓撲網絡構建，構建條件為：數據來源Textmining、co-expression、gene function和co-occurrence；相互作用關系系數≥0.4；相互作用蛋白不高于20個。

1.4 KEGG信號通路分析 在KEGG數據庫中(https://www.genome.jp/kegg/pathway.html)對STAT3、MMP9和SOCS3相關信號通路進行分析。物種選擇“human”；通路包含：代謝、遺傳信息、環境信息、細胞過程、人類疾病和藥物開發等。

2 結果

2.1 缺血性腦卒中患者差異表達基因篩選 GSE22255、GSE98319和GSE66724數據集中缺血性腦卒中患者和正常對照人群中差異表達基因分別為30個、196個和13個。其中共差異表達基因3個分別為STAT3、MMP9和SOCS3，見圖1。

圖1 缺血性腦卒中患者差異表達基因篩選

2.2 差異表達基因的聚類熱圖 對GSE66724差中差異表達基因進行聚類分析，結果顯示STAT3、MMP9和SOCS3等差異表達基因在缺血性腦卒中組聚類明顯，見圖2。

圖2 STAT3、MMP9和SOCS3等差異表達基因聚類熱圖

2.3 共差異表達基因的圖譜網絡 STAT3、MMP9和SOCS3蛋白網絡中有節點數為20個，節點間相互作用115個，平均聚類指數為0.75，STAT3、MMP9和SOCS3蛋白相互作用網絡蛋白富集明顯(P<0.05)，見圖3。

圖3 STAT3、MMP9和SOCS3蛋白相互作用拓撲網絡

2.4 STAT3、MMP9和SOCS3功能富集 STAT3、MMP9和SOCS3等基因編碼蛋白主要富集于細胞質、Cul5-RING泛素連接酶復合物等；生物學功能主要富集于蛋白結合、非膜跨越蛋白酪氨酸激酶活性、RNA聚合酶ii特異性DNA結合轉錄因子結合等；分子功能主要富集于細胞表面受體信號通路、白細胞介素-6的細胞反應和細胞對氧化應激的反應等。見表1。

表1 STAT3、MMP9和SOCS3功能富集

2.5 STAT3、MMP9和SOCS3相關信號通路 STAT3、MMP9和SOCS3基因主要涉及蛋白代謝、表達調控信號通路見圖4。信號通路涉及Jak-STAT信號通路、凋亡通路和MAPK等。

圖4 STAT3、MMP9和SOCS3相關信號通路模式圖

3 討論

3.1 IS特征及危險因素 IS是由于供血不足而發生的缺血性梗死，臨床較為常見。缺血會導致大腦的某些部分出現功能異常，包括偏身感覺或運動障礙、語言障礙、感音障礙，甚至昏迷。IS的主要危險因素是高血壓，其他危險因素包括高膽固醇、吸煙、肥胖、糖尿病、既往短暫腦缺血發作、終末期腎病和房顫等[8]。預防措施包括減少危險因素，對有問題的頸動脈狹窄患者進行干預；對房顫患者使用華法林阿司匹林進行抗凝；對存在高血脂的患者應進行有效的降脂治療[9]。

3.2 IS發生的病生理改變 IS目前的發生發展病生理機制并未完全闡明，主要為大腦部分供血不足而引起的缺血性級聯反應，如缺氧超過1 ～ 1.5min，腦組織功能將受到明顯影響，缺血缺氧大約3h后腦發生不可逆的損傷，并導致腦組織死亡，即腦梗死[10]。腦動脈粥樣硬化可導致腦血管管腔狹小，進而導致血流減少，引起血管內血栓的形成，或通過動脈粥樣硬化斑塊的崩解釋放大量小栓子干擾血液供應[11]。當栓子停留在腦血管時，該血管供血區域的腦組織得不到血液和氧氣而發生梗死。

3.3 IS差異表達基因和信號通路 在本研究中，筆者采用生物信息分析方法，探討了IS發生有關的基因并進行了可能的信號通路分析。結果顯示，STAT3、MMP9和SOCS3在IS與正常人群外周血中存在明顯差異表達。同時，STAT3、MMP9和SOCS3基因編碼蛋白拓撲網絡富集明顯(P<0.05)；STAT3、MMP9和SOCS3基因及其涉號通路包括Jak-STAT信號通路、凋亡通路和MAPK等信號通路。信號轉導和轉錄激活因子3 (STAT3)是信號轉導和轉錄激活因子的一種，其作用體現在細胞信號的交流和基因的轉錄等方面。已有文獻報道，STAT3在IS發生中具有重要作用。林建國等人[12]研究認為JAK2/STAT3/HIF-1a信號通路的激活或抑制在IS中所發揮重要作用，IS急性期抑制JA K2/STA T3/HIF-1α信號通路的表達、康復期激動JAK2/STAT3/HIF-1a信號通路的表達、抑制與激動的結合運用可能是今后對JAK2/STA T3/HIF-1α信號通路的研究方向。

3.4 總結與不足 通過生物信息大數據分析不同的IS與健康人群差異表達基因譜，筆者發現STAT3、MMP9和SOCS3可能與IS發生有關，并有望成為IS預防和治療的新靶點。但本研究數據主要基于數據庫生物信息分析，其結論的可靠性有待進一步相關試驗證實。