NSUN2對腎嫌色細胞癌患者預后的影響及潛在機制探討

連 佳 曹 娜 崔旭鋒

山西醫科大學，山西省太原市 030000

在全球范圍內，腎細胞癌(Renal cell carcinoma,RCC)在男、女性最常見的癌癥中排名分別為第六和第十[1]，在全球最常見癌癥死亡原因中排名第十六[2]。KICH是RCC中第三種最常見的亞型，占RCC的5%～7%[3]，其在臨床病理常規診斷中由于形態學差異大，容易與良性腫瘤混淆，導致診斷較為困難，進而影響治療和預后。提高診斷率、改善預后對于降低KICH的疾病負擔具有重要意義。

RCC的進展和預后與m5C甲基化修飾有關[4]。m5C是指RNA胞嘧啶上第5位的碳原子被甲基取代，是第二常見的RNA甲基化修飾。NSUN2蛋白是主要的m5C甲基轉移酶之一。近些年來對于NSUN2的研究主要集中胚胎發育和腫瘤發生發展過程[5-6]，而基于其分子結構、理化性質與KICH發生發展之間的關系尚未見相關報道。本研究利用生物信息學的方法對NSUN2基因及蛋白進行了結構和功能相關分析，并通過探討NSUN2在KICH中的表達及其與KICH預后的關系，進一步分析其相互作用蛋白和與腫瘤相關免疫分子，以期為后續深入研究NSUN2的功能并揭示KICH發生、發展和預后等問題提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 NSUN2的基因和蛋白序列獲取 均來自于美國國立生物技術中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)網站中對應的數據庫。

1.2 NSUN2的基本理化性質分析 利用ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)，Protscale(https://web.expasy.org/protscale/)在線網站分析其理化性質和親疏水性，通過SignalP-5.0(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0)在線網站進行信號肽結構分析，利用TMHMM Server 2.0(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0)網站進行跨膜區域分析。

1.3 NSUN2的亞細胞定位分析 通過PSORTⅡ(https://psort.hgc.jp/form2.html)網站預測完成NSUN2的亞細胞定位分析。

1.4 NSUN2的組織表達特異性 通過NCBI網站上的Nucleotide數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore)分析完成，TIMER2.0數據庫(http://timer.cistrome.org)包含33種TCGA的癌癥標本，用于分析NSUN2 mRNA在不同腫瘤中的表達情況，主要考察NSUN2 mRNA在腎嫌色細胞癌中的表達。

1.5 NSUN2與腎嫌色細胞癌預后的關系 利用Sangerbox 3.0(http://vip.sangerbox.com/home.html)提取NSUN2在TCGA數據庫里多種癌癥樣本中的表達數據，分析基因表達與每種癌癥的預后關系，主要考察NSUN2 mRNA與腎嫌色細胞癌預后的關系。

1.6 NSUN2的相互作用蛋白預測 通過STRING數據庫(https://www.string-db.org)預測與NSUN2有相互作用的蛋白，以此構建PPI網絡，并進行GO功能注釋和KEGG通路富集分析。

1.7 NSUN2與腫瘤免疫浸潤、腫瘤微環境、免疫檢查點分子的關系 利用Sangerbox 3.0(http://vip.sangerbox.com/home.html)在線分析軟件中泛癌分析相關模塊完成。

2 結果

2.1 NSUN2基本理化性質分析結果 NSUN2在NCBI基因庫中的Gene ID為54888，該基因位于人的第5號染色體5p15.31位點，共有19個外顯子。NSUN2蛋白的分子式為C3830H6048N1066O1145S35，總原子數達到12 124，相對分子質量為86 471。該蛋白含有767個氨基酸殘基，其中共含有74個亮氨酸，為9.65%，占比重最大，色氨酸為1.72%，占比重最小。NSUN2蛋白中帶負電荷殘基(天冬氨酸殘基+谷氨酸殘基)的總數為106，帶正電荷殘基(精氨酸殘基+賴氨酸殘基)的總數為99，理論等電點為6.33，呈弱酸性。用ProtParam軟件對NSUN2的半衰期、穩定性、脂肪系數、親疏水性等性質進行預測，結果顯示由于NSUN2蛋白在N端的氨基酸為蛋氨酸，因此其在哺乳動物網織紅細胞中半衰期可達30h；NSUN2的不穩定指數(Ⅱ)為52.11，判定該蛋白屬于不穩定蛋白；此外該蛋白脂溶指數為77.04，親水性總平均值為-0.57，說明該蛋白質為親水性蛋白質。隨后利用Protscale軟件對NSUN2蛋白進行親疏水性預測，結果顯示最低點位于555號的甘氨酸殘基，得分為-2.84，最高點位于424號的纈氨酸殘基，得分為2.56。NSUN2蛋白的氨基酸殘基多數位于零點以下的負性親水區域，且相對值較大，因此蛋白親水性蛋白，與上述ProtParam軟件預測結果一致。利用SignalP 5.0 Server對NSUN2蛋白信號肽切割位點進行分析，結果顯示該蛋白中存在信號肽的可能性為1.5×10-3，說明NSUN2不含信號肽結構，屬于非分泌蛋白。通過TMHMM Server 2.0預測提示該蛋白不具有跨膜螺旋結構。

2.2 NSUN2組織表達特異性、亞細胞定位 NCBI中的Nucleotide數據庫可以確定所有蛋白質編碼基因的組織特異性。本研究對來自95個樣本的27種不同組織的RNA-seq結果進行分析，結果顯示NSUN2在淋巴結中的表達最為廣泛，其用于估計基因表達量的RPKM (Reads Per Kilobase per Million mapped reads)值為14.21±4.57，在胰腺中的表達最低。利用PSORT Ⅱ對NSUN2的亞細胞定位預測結果顯示，60.90% NSUN2蛋白位于細胞核內，21.70%位于線粒體，17.40%位于細胞質中。

2.3 NSUN2在腎嫌色細胞癌中的相對表達水平 癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas, TCGA)是由美國國家癌癥研究所和國家人類基因組研究所合作建立的癌癥研究項目，目前共收錄了33種癌癥類型。本研究利用TIMER2.0數據庫分析33種腫瘤類型中NSUN2 mRNA的表達情況，結果提示在腎嫌色細胞癌(KICH)中NSUN2 的表達顯著高于正常腎組織 (P<0.05)，見圖1。利用Sangerbox 3.0分析NSUN2表達與TCGA數據庫中每種癌癥的預后關系，結果顯示KICH中NSUN2高表達預后差[P<0.05,HR=12.23(1.64, 91.08)]。見圖2。綜上可見NSUN2可能是KICH潛在的預后因素。

圖1 TIMER2.0分析TCGA數據庫中NSUN2在腎嫌色細胞癌組織和正常腎組織中的相對表達水平

圖2 Sangerbox 3.0分析TCGA數據庫中NSUN2表達與KICH預后的關系

2.4 NSUN2的蛋白相互作用關系預測結果 蛋白質的相互作用在機體的眾多生物學進程中發揮著重要作用，為鑒定與NSUN2相互作用的可能蛋白，本研究利用STRING軟件對NSUN2相關蛋白進行了蛋白質互作網絡的構建，選擇最高置信度0.90，互作蛋白數量不超過10個，做出PPI網絡圖。預測結果顯示，符合條件的NSUN2互作蛋白分別為：核仁核酸蛋白1(Nucleophosmin 1，NPM1，分值：0.99)，甲基轉移酶1(Methyltransferase 1，METTL1，分值：0.99)，極光酶B(Aurora kinase B，AURKB，分值：0.97)，tRNA甲基轉移酶1(tRNA methyltransferase 1，TRMT1，分值：0.96)，核仁素(Nucleolin，NCL，分值：0.95)，FtsJ RNA 2’-o-甲基轉移酶3(FtsJ RNA 2’-O-methyltransferase 3，FTSJ3，分值：0.95)，纖維蛋白(Fibrillarin，FBL，分值：0.94)，核糖體生物發生因子1(Pescadillo ribosomal biogenesis factor 1，PES1，分值：0.93)，天門冬氨酸甲基轉移酶1(tRNA aspartic acid methyltransferase 1，TRDMT1，分值：0.93)，假尿苷合酶7(Pseudouridine synthase 7，PUS7，分值：0.93)。交互網絡共包括11個節點，35條邊，平均節點度為6.36，該PPI網絡的聚類P值<0.01。同時利用STRING數據庫進行NSUN2基因GO功能注釋和KEGG通路分析，結果顯示NSUN2主要涉及RNA的修飾和裝配等一系列相關生物過程；細胞組分主要集中在細胞核內；參與的KEGG信號通路主要有RNA代謝，rRNA和tRNA修飾加工等(見表1)。上述結果可能有助于我們探索NSUN2在體內的相關作用機制和通路。

表1 NSUN2和相關基因的GO功能注釋和KEGG通路分析

2.5 NSUN2與KICH中免疫浸潤、腫瘤微環境、免疫檢查點分子的關系 為進一步探討NSUN2與免疫之間的潛在關系，利用Sangerbox 3.0在線分析軟件從腫瘤免疫浸潤、腫瘤微環境和免疫檢查點三個方面對其進行分析。結果顯示，在KICH中，NSUN2表達與M1型巨噬細胞、M2型巨噬細胞、中性粒細胞、自然殺傷細胞和調節性T細胞的免疫浸潤顯著相關。在腫瘤微環境方面，NSUN2與StromalScore、ImmuneScore和ESTIMATEScore無相關性(P>0.05)。免疫檢查點分子和NSUN2之間的共表達分析提示，在TCGA數據庫的KICH中，NSUN2與CD276、VEGFA、TNFB1及TLR4等顯著相關(均P<0.05)。

3 討論

KICH在RCC中占比為5%～7%，相比RCC的其他類型，例如透明細胞樣腎細胞癌(clear cell RCC,ccRCC)和乳頭狀腎細胞癌(papillary RCC),KICH的預后明顯較好[7]，然而KICH容易轉移至肝臟，對預后和患者生存質量不利。因此尋找有效的診斷和預后生物標志物，有助于實現KICH的早期診斷并改善預后。本文通過運用多種生物信息學工具對NSUN2基因及蛋白進行了結構、功能以及生物學功能的預測和分析，并通過對TCGA數據庫進行挖掘揭示了NSUN2表達與KICH患者生存率之間的關聯。研究結果表明，NSUN2蛋白為弱酸性蛋白，具有不穩定性和親水性，不含信號肽結構，屬于非分泌蛋白，主要分布在細胞核內。NSUN2蛋白在人體組織中發布較為廣泛，主要作為RNA甲基轉移酶行使RNA修飾功能，參與基因轉錄后調控。

TCGA數據庫挖掘結果提示，與正常腎組織相比，NSUN2在KICH腫瘤中高表達，并且表達升高與預后相關，說明NSUN2可能作為KICH的潛在預后因素。現有研究表明NSUN2與膀胱尿路上皮癌、胃癌、頭頸鱗狀細胞癌等許多癌癥的發生、增殖、轉移和預后等有關[8-9]，也有研究分析提示在12個m5C有關的調控因子中，有11個與RCC的預后相關，其中包括NSUN2[10]。

蛋白互作網絡分析有助于從系統角度探究疾病分子機制、發現新藥的作用靶點等。為進一步了解NSUN2在KICH中的生物學功能和潛在信號通路，本研究構建蛋白質互作PPI網絡，并進行KEGG分析。STRING互作蛋白分析結果表明NSUN2的互作蛋白包括NPM1、METTL1、AURKB、TRMT1、 NCL、FTSJ3、FBL、PES1、TRDMT1和PUS7等。

NPM1與核糖體生物發生和p53穩定調控有關，有研究表明DDX31可能通過與NPM1的相互作用，調控p53-HDM2通路和rRNA基因轉錄，在腎癌發生中發揮重要作用[11]。METTL1介導m7G甲基化影響mRNA的翻譯和胚胎干細胞的自我更新和分化，同時還與肝癌、結腸癌等癌癥有關。AURKB是細胞有絲分裂的關鍵調控因子，參與染色體凝集、胞質分裂等生理過程，同時AURKB也被證明在腫瘤發生、進展和化療反應中發揮重要作用。此外有研究發現AURKB在RCC組織中表達升高，并與RCC患者組織中的ALKBH5表達呈正相關，ALKBH5可能通過m6A依賴的方式調控AURKB從而促進RCC中的細胞增殖[12]。TRMT1作為tRNA甲基轉移酶可能與腎透明細胞癌的預后有關[13]。FTSJ3可以與NIP7產生相互作用并且參與rRNA的裝配，并且可能對癌細胞的侵襲和遷移具有抑制作用。TRDMT1同樣作為m5C的甲基轉移酶抑制腫瘤的分化和遷移。由此可見，NSUN2可能與PPI網絡的下游蛋白產生相互作用，通過參與mRNA的轉錄后修飾進而調控腫瘤的發生發展。

本研究進一步從腫瘤微環境、腫瘤免疫浸潤和免疫檢查點分子四個方面探討了NSUN2與免疫之間的潛在關系。有研究表明，腫瘤免疫浸潤與RCC臨床預后密切相關[14]，并且發現有些癌癥預后相關基因與免疫細胞途徑和檢查點分子顯著相關[15]。本研究結果提示在腫瘤免疫浸潤方面，NSUN2與M1型巨噬細胞、M2型巨噬細胞、中性粒細胞、自然殺傷細胞和調節性T細胞的免疫浸潤顯著相關;NSUN2和免疫檢查點分子的共表達分析表明，該基因與TCGA數據集中KICH中的CD276、VEGFA、TNFB1及TLR4等顯著相關。上述結果無疑都表明NSUN2與KICH的免疫密切相關。

本研究的特色在于通過生物學在線軟件預測了NSUN2基因和蛋白的理化性質，并進一步挖掘了TCGA數據庫中NSUN2在KICH中的表達，此外還分析了NSUN2相關的蛋白質相互作用網絡、腫瘤微環境、腫瘤免疫浸潤、免疫檢查點分子等。綜上所述，NSUN2可能是KICH的一個潛在預后預測因子，并與免疫密切相關。本文不足之處：首先，從TCGA數據庫中能夠獲得的臨床信息有限，包括潛在慢性病、免疫治療的使用、腎切除術后復發等重要數據不能體現，并且TCGA中正常腎組織樣本的樣本量相對較小，可能會影響預測結果的準確性。其次，生物信息學分析結果提示NSUN2在KICH組織中上調。但是該結果仍需要臨床樣本中驗證，本研究中利用生物信息學的方法預測出的可能的機制后續仍有待進一步的細胞實驗和動物實驗進行驗證。但本研究得出的結論仍可為進一步探討NSUN2在腎嫌色細胞癌中的作用以及可能存在的機制提供理論依據。