基于高通量測(cè)序的拷貝數(shù)變異檢測(cè)技術(shù)在產(chǎn)前診斷中的臨床應(yīng)用*

呂康琪，陳大洋，闞麗娟，熊 丹 綜述,張秀明△ 審校

1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453000；2.深圳市羅湖醫(yī)院集團(tuán)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室/深圳大學(xué)第三附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東深圳 518001

我國(guó)是出生缺陷高發(fā)國(guó)家之一，出生缺陷發(fā)生率高達(dá)5.6%，每年新增出生缺陷患兒約900 000例，出生時(shí)臨床可見缺陷患兒數(shù)高達(dá)250 000例，這一嚴(yán)重現(xiàn)象給家庭和社會(huì)都帶來(lái)了巨大壓力[1]。其中80%以上的出生缺陷由染色體畸變引起，在染色體結(jié)構(gòu)變異中最主要的變異類型是拷貝數(shù)變異(CNV)[2]。CNV是指染色體上DNA片段大小范圍從1 kb到幾個(gè)Mb的亞顯微水平的基因組變異，包括缺失和重復(fù)兩種類型[3]。由CNV導(dǎo)致的疾病目前沒有有效的治療方法，及時(shí)進(jìn)行產(chǎn)前診斷是防治出生缺陷的重要手段。傳統(tǒng)的產(chǎn)前診斷方法，如染色體核型分析、超聲檢查等因通量低、分辨率低、檢測(cè)周期長(zhǎng)等原因無(wú)法滿足臨床需求[4]。近幾年，基于下一代測(cè)序(NGS)技術(shù)的CNV-seq為CNV的檢測(cè)提供了新手段，美國(guó)婦產(chǎn)科醫(yī)師學(xué)會(huì)(ACOG)已推薦CNV-seq作為胎兒結(jié)構(gòu)異常時(shí)診斷評(píng)估的一線檢測(cè)方法[5]。

1 檢測(cè)方法

CNV-seq采用NGS技術(shù)對(duì)標(biāo)本DNA進(jìn)行低深度全基因組測(cè)序，再通過生物信息分析受檢標(biāo)本中是否存在CNV[6]。目前，序列深度法檢測(cè)CNV是臨床上廣泛使用的檢測(cè)手段，該方法根據(jù)CNV重復(fù)或缺失變異產(chǎn)生的測(cè)序深度信號(hào)來(lái)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，若拷貝數(shù)發(fā)生重復(fù)變異，會(huì)顯示較高的讀取深度，若發(fā)生缺失，則出現(xiàn)較低的讀取深度[7]，見圖1。序列深度法的檢測(cè)流程主要有5步，(1)數(shù)據(jù)比對(duì)：將質(zhì)量合格的下機(jī)序列映射到人類參考基因組上進(jìn)行比對(duì)；(2)窗口劃分：為基因組測(cè)序統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)設(shè)定統(tǒng)計(jì)單位[8]；(3)GC含量矯正：在DNA雙鏈結(jié)構(gòu)中，GC堿基對(duì)含3個(gè)氫鍵，高GC區(qū)域結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，DNA不容易被打斷，此穩(wěn)定結(jié)構(gòu)會(huì)影響測(cè)序片段深度變化而造成結(jié)果假陽(yáng)性，為了使窗口深度更均一，需要對(duì)GC含量進(jìn)行矯正[8]；(4)斷點(diǎn)分割：通過統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析序列深度，發(fā)現(xiàn)異常序列深度的窗口，對(duì)變異斷點(diǎn)進(jìn)行合并，找出變異區(qū)域；(5)可視化：通過展示條帶分布與染色體核型標(biāo)準(zhǔn)圖對(duì)全基因組的序列分布進(jìn)行可視化。

圖1 序列深度法檢測(cè)CNV時(shí)缺失和重復(fù)的深度信號(hào)

由于CNV-seq技術(shù)局限、基因組自身特征、遺傳復(fù)雜性等因素可能會(huì)造成CNV測(cè)序結(jié)果的假陽(yáng)性，因此需要對(duì)檢測(cè)出的CNV片段進(jìn)行過濾[9]。過濾的具體原因包括以下幾點(diǎn)，(1)染色體N區(qū)：技術(shù)局限導(dǎo)致染色體N區(qū)遺傳信息無(wú)法檢測(cè)，造成序列深度較低，可能引起假陽(yáng)性；(2)染色體著絲粒附近：染色體著絲粒由高度重復(fù)DNA序列組成，影響序列深度異常變化，可能引起假陽(yáng)性[10]；(3)低于檢測(cè)閾值數(shù)據(jù)：CNV-seq主要針對(duì)100 kb以上CNV造成的疾病，而對(duì)于<100 kb的CNV需要過濾?；诘蜕疃葴y(cè)序技術(shù)原理，CNV-seq檢測(cè)不能排除多倍體、單親二倍體、染色體平衡易位、倒位、環(huán)狀、低比例嵌合體等原因造成的疾病，但其具有通量高，成本低，DNA需求量低，操作簡(jiǎn)便，可檢測(cè)低至5%的染色體非整倍體嵌合等優(yōu)點(diǎn)，提高了變異檢出率和臨床適用性[2]。

2 致病性CNV解讀考慮因素

需要注意的是檢出的CNV并不都意味著異?；蛴信R床意義。目前臨床基因組資源中心(ClinGen)數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的具有明確致病性的CNV共有2 817個(gè)，僅占據(jù)全基因組CNV的一小部分。應(yīng)用CNV-seq技術(shù)可以檢測(cè)到大量變異，但真正具有致病性的十分罕見，大部分變異因解讀信息有限，只能被定義為臨床意義未明，因此需要更多的研究確定其臨床意義。為了明確實(shí)驗(yàn)室對(duì)CNV結(jié)果的評(píng)價(jià)分類并促進(jìn)解讀結(jié)果的一致性，國(guó)際上2019年美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)(ACMG)和ClinGin聯(lián)合發(fā)表了CNV解讀和報(bào)告指南[11]，國(guó)內(nèi)專家在2020年發(fā)表了《產(chǎn)前遺傳學(xué)診斷拷貝數(shù)變異和純合區(qū)域的數(shù)據(jù)分析解讀及報(bào)告規(guī)范化共識(shí)》[12]。ACMG指南實(shí)現(xiàn)了CNV致病性的量化分類，將CNV分為5類：致病性、可能致病、臨床意義未明、可能良性、良性?！懂a(chǎn)前遺傳學(xué)診斷拷貝數(shù)變異和純合區(qū)域的數(shù)據(jù)分析解讀及報(bào)告規(guī)范化共識(shí)》對(duì)CNV的數(shù)據(jù)分析流程、報(bào)告標(biāo)準(zhǔn)和報(bào)告內(nèi)容進(jìn)行了規(guī)范[12]。盡管國(guó)內(nèi)外都出臺(tái)了相關(guān)指南和專家共識(shí)，但具體細(xì)節(jié)仍存在差異，特別是在解讀報(bào)告的透明性、一致性上，各個(gè)臨床實(shí)驗(yàn)室間差別較大。因此，對(duì)CNV的解讀需考慮以下幾個(gè)因素。

2.1CNV包含的基因 分析CNV涉及區(qū)域內(nèi)的基因是解讀CNV最?？紤]的因素。首先應(yīng)對(duì)CNV涉及的基因組構(gòu)成進(jìn)行討論。考慮CNV中是否包含獨(dú)特的、富含基因的序列或重復(fù)元件，分析CNV的重復(fù)或缺失片段是否包含蛋白質(zhì)編碼基因或其他已知功能的重要元件，若包含則CNV會(huì)對(duì)蛋白編碼產(chǎn)生影響，造成臨床表型異常，引起致病性[13]；若僅涉及部分基因的拷貝數(shù)增加或缺失，則會(huì)造成基因斷裂或編碼序列改變，而涉及內(nèi)含子序列的變異會(huì)對(duì)基因功能產(chǎn)生影響，使致病風(fēng)險(xiǎn)增加[14]。然而，若檢測(cè)到的CNV未包含明確致病性基因而無(wú)法判斷其臨床意義時(shí)，應(yīng)查詢數(shù)據(jù)庫(kù)或檢索PubMed對(duì)基因進(jìn)行評(píng)估。其次，應(yīng)對(duì)CNV涉及的基因數(shù)量進(jìn)行討論，若包含的基因數(shù)量過多，則致病風(fēng)險(xiǎn)增加，如當(dāng)拷貝數(shù)缺失區(qū)域包含35個(gè)及以上蛋白編碼基因時(shí)，該CNV定義為可能致病；若包含基因數(shù)量少，則致病風(fēng)險(xiǎn)降低；需要明確的是，如果該變異區(qū)域包含的基因數(shù)量很少，但含有明確致病性基因，此CNV則被定義為致病性[15]。

2.2數(shù)據(jù)庫(kù) 可用于解讀CNV的數(shù)據(jù)庫(kù)主要分為3大類：第1類為疾病人群變異數(shù)據(jù)庫(kù)，主要收集臨床表型、明確致病性基因等，包括ClinGen、DECIPHER、在線人類孟德爾遺傳(OMIM)、HGMD數(shù)據(jù)庫(kù)等；第2類為健康人群變異數(shù)據(jù)庫(kù)，主要收集變異在自然人群中的分布頻率、族群信息等，包括基因組變異體數(shù)據(jù)庫(kù)(DGV)、gnomAD數(shù)據(jù)庫(kù)等；第3類主要收集基因組學(xué)注釋信息，包括基因內(nèi)含子、外顯子、5′端或3′端重要元件等，主要是UCSC、GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)。

2.3文獻(xiàn)查詢 可以通過檢索是否有相似CNV或變異區(qū)域所涉及基因的文獻(xiàn)報(bào)道，幫助臨床分析，為CNV解讀提供新思路。常用的檢索平臺(tái)是PubMed、Web of Science、中國(guó)知網(wǎng)、萬(wàn)方數(shù)據(jù)知識(shí)服務(wù)平臺(tái)等。

2.4家族遺傳 在許多情況下，若檢測(cè)到臨床意義未明的CNV時(shí)，對(duì)父母進(jìn)行基因組測(cè)序是十分必要的。當(dāng)變異來(lái)自表型健康父母時(shí)，該變異致病性可能較低，若變異為新發(fā)，則致病性可能較高。在特殊情況時(shí)，可能還需要其他的家族標(biāo)本(如兄弟姐妹)來(lái)確定特定的CNV是否與家族中的染色體變異相關(guān)。遺傳異質(zhì)性和遺傳外顯率也是影響基因型和表型關(guān)系的重要因素。低外顯率是指外顯率為5%～10%，這種基因組變異的臨床表現(xiàn)很難被精準(zhǔn)預(yù)測(cè)，且外顯率會(huì)受到多種因素的影響，如種族、家族史、額外的CNV等[16]。

3 CNV-seq在產(chǎn)前診斷領(lǐng)域的應(yīng)用現(xiàn)狀

3.1CNV-seq與染色體核型分析的聯(lián)合應(yīng)用 20世紀(jì)70年代以來(lái)，傳統(tǒng)的染色體核型分析是評(píng)估高危孕婦胎兒染色體異常的“金標(biāo)準(zhǔn)”。此技術(shù)可以檢測(cè)胎兒染色體數(shù)目異常、染色體非整倍體、倒位、平衡或非平衡易位等結(jié)構(gòu)異常[17]。染色體核型分析技術(shù)的分辨率為5～10 Mb，<5 Mb的異常很難被準(zhǔn)確檢出，而CNV-seq不能檢出平衡易位、羅氏易位等結(jié)構(gòu)異常，因此染色體核型分析與CNV-seq聯(lián)合檢測(cè)可以克服兩種技術(shù)中存在的缺陷，為產(chǎn)前提供更可靠更全面的遺傳診斷[18]。魏友華等[19]采用以上兩種方法對(duì)905例羊水標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，均發(fā)現(xiàn)70例染色體數(shù)目異常、9例染色體嵌合體異常、7例染色體非平衡性結(jié)構(gòu)異常，染色體核型分析額外檢測(cè)到由羅氏異位引起的染色體數(shù)目異常，CNV-seq額外檢測(cè)到10例明確致病性的染色體微缺失/微重復(fù)，兩者聯(lián)合應(yīng)用將染色體異常陽(yáng)性率從11.27%提升至12.38%。彭亞琴等[20]對(duì)164例孕婦進(jìn)行檢測(cè)，核型分析檢出24例染色體核型異常，CNV-seq檢出29例已知致病性和可疑致病性CNV，使致病性CNV檢出率提高了3.05%，但CNV-seq未能檢出3例染色體核型分析診斷為平衡易位、羅氏異位的異常。上述研究表明，核型分析和CNV-seq聯(lián)合應(yīng)用可以顯著提高染色體異常檢出率，有利于臨床產(chǎn)前咨詢?cè)u(píng)估，可為孕婦是否繼續(xù)妊娠提供更加全面客觀的依據(jù)。

3.2CNV-seq與染色體微陣列分析技術(shù)(CMA)的對(duì)比應(yīng)用 CMA是一種已成熟運(yùn)用于臨床的高分辨率全基因組CNV分析技術(shù)，ACMG推薦CMA作為胎兒染色體異常時(shí)診斷評(píng)估的輔助手段[21]，但該技術(shù)存在培養(yǎng)周期長(zhǎng)、成本高、通量低、探針更新停滯等問題[22]。MA等[23]對(duì)67例嵌合體孕婦進(jìn)行CNV-seq和CMA檢測(cè)，CNV-seq的檢出率為6%～92%，CMA的檢出率為20%～72%。WANG等[24]對(duì)1 023例孕婦進(jìn)行檢測(cè)，CMA檢出121例染色體異常(11.8%)，CNV-seq不僅檢測(cè)到了上述所有異常，并且額外檢出了17例染色體異常。以上研究證明，CNV-seq較CMA對(duì)嵌合體有更高的分辨率和靈敏度。據(jù)上述研究分析原因發(fā)現(xiàn)，CMA未檢出異常的原因是平臺(tái)靶區(qū)探針覆蓋不足或探針覆蓋不到。

3.3CNV-seq在不同臨床指征中的應(yīng)用

3.3.1CNV-seq在超聲結(jié)果異常中的應(yīng)用 超聲診斷是臨床應(yīng)用最廣泛、最常見、公認(rèn)無(wú)損傷性、可反復(fù)進(jìn)行的醫(yī)學(xué)成像技術(shù)，也是胎兒生長(zhǎng)發(fā)育情況的重要判定指標(biāo)之一[25]。對(duì)超聲結(jié)果異常的病例進(jìn)行CNV-seq檢測(cè)，不僅可以幫助產(chǎn)前確定變異類型，而且有利于分析遺傳原因。張秀群等[26]對(duì)137例超聲檢查提示胎兒結(jié)構(gòu)異常的孕婦進(jìn)行CNV-seq檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)有15例異常，其中8例為已知致病性CNV，超聲結(jié)果分別是6例提示頸項(xiàng)透明層(NT)增厚或側(cè)腦室增寬，1例提示胎兒尺骨缺如、左腎缺如、心室內(nèi)多發(fā)強(qiáng)光斑，1例提示胎兒生長(zhǎng)發(fā)育受限。CNV-seq不僅可以在超聲結(jié)構(gòu)異常病例中分析遺傳變異，還可以在超聲發(fā)現(xiàn)軟指標(biāo)的病例中探索病因，幫助臨床深入分析病例特征，提升診斷價(jià)值。胎兒超聲軟指標(biāo)多見于NT增厚，針對(duì)NT增厚，已有研究對(duì)臨床病例進(jìn)行了CNV-seq檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在NT增厚的139例病例中檢出45例CNV，除了33例是>5 Mb的染色體異常，余下的12例均是染色體微缺失/微重復(fù)[27]。

3.3.2CNV-seq在高齡孕婦中的應(yīng)用 隨著三孩政策放開，高齡(≥35歲)孕產(chǎn)婦的數(shù)量明顯增加，研究表明胎兒染色體異常的發(fā)生率與孕婦年齡密切相關(guān)，因此為高齡孕婦提供產(chǎn)前診斷是減少出生缺陷兒的有效手段[28]。王游聲等[29]對(duì)孕婦年齡和染色體異常的相關(guān)性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)在35歲以上的7個(gè)年齡組中，從38歲起隨著孕婦年齡增長(zhǎng)，染色體異常率逐漸升高。一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，31例引產(chǎn)孕婦中單純因高齡而發(fā)現(xiàn)胎兒異常導(dǎo)致引產(chǎn)的病例有10例，占32.26%，因此相對(duì)而言，高齡孕婦更容易生育異常胎兒[30]。以上研究證明，高齡與染色體異常密切相關(guān)，可以通過CNV-seq技術(shù)檢測(cè)染色體異常，從而降低出生缺陷的發(fā)生率，有助于我國(guó)出生缺陷的防治。

3.3.3CNV-seq在無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)(NIPT)高風(fēng)險(xiǎn)中的應(yīng)用 NIPT指通過檢測(cè)母體血漿中游離DNA片段而判斷胎兒是否存在染色體非整倍體異?；蚱渌z傳性疾病，主要用于篩查21、18、13三體綜合征[31]。有研究對(duì)563例NIPT篩查為三體綜合征的孕婦進(jìn)行CNV-seq檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)489例孕婦羊水檢出CNV，分析74例出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果的原因是由于母體CNV的干擾，因此若NIPT提示高風(fēng)險(xiǎn)時(shí)，仍需要進(jìn)行CNV-seq檢測(cè)確認(rèn)，排除母體干擾[32]。另有研究對(duì)45 773例孕婦進(jìn)行NIPT篩查，314例檢出性染色體非整倍體，經(jīng)羊膜穿刺術(shù)驗(yàn)證，58例病例檢出CNV，結(jié)果仍有很高的假陽(yáng)性率[33]。以上研究說(shuō)明，對(duì)于NIPT高風(fēng)險(xiǎn)的孕婦，可以進(jìn)行CNV-seq檢測(cè)驗(yàn)證。NIPT只是一種篩查測(cè)試，因此可能出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性的情況。2016年我國(guó)國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)發(fā)布了《孕婦外周血胎兒游離DNA產(chǎn)前篩查與診斷技術(shù)規(guī)范》，明確指出對(duì)于NIPT高風(fēng)險(xiǎn)人群，應(yīng)轉(zhuǎn)診至產(chǎn)前遺傳咨詢醫(yī)師處進(jìn)行檢測(cè)和咨詢[34]。

4 小 結(jié)

在過去的幾年，我國(guó)有效防治出生缺陷的方法是進(jìn)行產(chǎn)前診斷，而CNV-seq為產(chǎn)前診斷提供了新途徑。在CNV-seq的檢測(cè)原理方面，序列深度法已獲得臨床認(rèn)同；在臨床應(yīng)用方面，該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了與其他傳統(tǒng)技術(shù)的聯(lián)合運(yùn)用，而且也被應(yīng)用到不同指征病例中，實(shí)現(xiàn)了優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，提升了我國(guó)產(chǎn)前診斷領(lǐng)域的檢測(cè)能力，提高了檢測(cè)效率；在解讀方面，從包含的基因、數(shù)據(jù)庫(kù)、文獻(xiàn)查詢和家族遺傳這4個(gè)方面進(jìn)行總結(jié)，然而由于明確致病性的基因或區(qū)域數(shù)量有限，很多檢測(cè)結(jié)果無(wú)法給出具有臨床意義的解釋，且CNV結(jié)果解讀流程復(fù)雜、專業(yè)性強(qiáng)，盡管國(guó)內(nèi)外已出臺(tái)了相關(guān)指南和專家共識(shí)，但具體細(xì)節(jié)仍存在差異，特別是在解讀報(bào)告的透明性、一致性和標(biāo)準(zhǔn)化方面，各個(gè)臨床實(shí)驗(yàn)室之間差別較大。因此，CNV-seq結(jié)果解讀仍存在很多問題，需要進(jìn)一步探索CNV致病性評(píng)估，推動(dòng)CNV-seq在產(chǎn)前診斷領(lǐng)域的發(fā)展。