無償獻血人群HBV-DNA混樣反應性孔位拆分2次結果分析

王 歡，陳 雪，趙 欣，季茂勝，張藍江，董玉芳，魏彩冰，李 文

成都市血液中心血液篩查實驗室，四川成都610041

自2010年我國實行獻血者標本核酸檢測試點工作以來，輸血安全問題在很大程度上得到了改善[1]。核酸檢測能縮短檢測窗口期，降低經輸血傳播疾病的發病率[2-3]。2015年血站實行核酸檢測全覆蓋，我國所有血站的血液標本均需進行核酸檢測，更大程度保障了輸血安全[4]。

目前，血站核酸檢測原理主要基于轉錄介導的擴增(TMA)和實時熒光定量聚合酶鏈式反應(PCR)兩種方法[5]。后者的檢測模式是先將標本進行混樣檢測，結果為非反應性的孔位中所含標本視為檢測合格；結果為反應性的孔位進行拆分，拆分結果為反應性的標本被判定為核酸檢測不合格。

本中心自2010年參加血站核酸檢測試點工作以來，對COBAS s 201核酸系統混樣檢測呈反應性的孔位，在按照既定程序進行拆分的同時，均加做一次拆分，以達到雙孔復試的目的。上述拆分模式在全國范圍內少見。2次拆分的結果可能出現2次均未拆出、2次均拆出、僅第1次拆出、僅第2次拆出，以及同一孔位拆出不止1例反應性標本等幾種情況。本研究統計近6年來該核酸系統的檢測結果，回顧性分析2次拆分結果，分析混樣和拆分CT值的相關性，并探討對反應性孔位進行2次拆分的必要性。

1 資料與方法

1.1一般資料 將2015—2020年COBAS s 201核酸系統上混樣檢測呈反應性的725 孔位及拆分出的543例乙型肝炎病毒(HBV)-DNA反應性標本作為研究對象。獻血者中男365例，女100例；年齡18～60歲，平均(46.61±8.50)歲。所有標本均來自經體檢合格的無償獻血者。

1.2儀器與試劑 酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測采用全自動酶聯免疫分析系統(Microlab FAME，瑞士Hamilton公司)，血型檢測采用全自動加樣儀(深圳市愛康生物科技股份有限公司)，轉氨酶檢測采用全自動生化分析儀(日本奧林巴斯公司)。轉氨酶試劑(美國貝克曼庫爾特公司)，乙型肝炎表面抗原(HBsAg)試劑(意大利索靈診斷和上海科華生物工程股份有限公司)，抗-丙型肝炎病毒(HCV)(美國奧森多醫療和上海科華生物工程股份有限公司)，抗-人類免疫缺陷病毒(HIV)1/2(美國伯樂公司和北京萬泰生物藥業股份有限公司)，抗-梅毒螺旋體(TP)(北京華大吉比愛生物技術有限公司和北京萬泰生物藥業股份有限公司)。核酸檢測為羅氏COBAS s 201核酸檢測系統及配套試劑盒。

1.3方法 標本采集前，對獻血者進行乙型肝炎表面抗原(膠體金法)和轉氨酶初篩檢測。體檢和初篩檢測結果合格的獻血者再進行采血并留樣。2管留樣標本，1管是乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝的真空采血管(科華)，用于ELISA、轉氨酶和血型檢測。1管是無DNA酶，RNA酶帶分離膠的EDTA-K2抗凝的BD試管，用于核酸檢測。標本處理方法符合國家要求。

在完成轉氨酶、血型和ELISA檢測后，篩選合格標本進行核酸檢測。對所有在COBAS s 201系統混樣(6混1)檢測呈反應性孔位，均采取2次拆分的檢測模式。第1次拆分選用系統上“load secondary”的加樣模式，儀器根據混樣結果識別樣本條碼，自動進行拆分加樣。第2次拆分選擇“pool of 1”的加樣模式。系統不能識別重復條碼，在第2次拆分錄入條碼時，采取“原條碼”+“=”的輸入方式。

1.4統計學處理 采用Excel 2017處理數據及繪制圖表。用SPSS23.0數據分析軟件進行數據處理及統計分析。計數資料采用頻數或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。相關性分析采用Spearman相關分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.12015—2020年混樣反應性孔位 2次拆分結果 對725孔混樣反應性孔位進行2次拆分，共有543例HBV-DNA反應性標本，拆出反應性率為74.90%。拆分結果見表1。340孔(46.90%)在2次拆分中均拆出同一HBV-DNA反應性標本；210孔(28.90%)2次拆分結果均為非反應性；108孔(14.90%)只在第1次拆分出1例HBV-DNA反應性標本；41孔(5.67%)僅第2次拆分出1例HBV-DNA反應性標本。26 孔(3.59%)拆出2例以上反應性標本，其中19 孔(CT值35.2～44.6)在2次拆分均有相同反應性標本拆出(表2中第1～4類)，7孔(CT值36.7～39.6)雖然拆出不止1例反應性標本，但2次拆分的結果不相同(表2第5～6類)，見表2。

表1 2015—2020年混樣反應性孔位 2次拆分結果[n(%)]

表2 拆出2例及以上反應性標本的孔位拆分結果(n)

2.2混樣結果與拆分CT值之間的關系 混樣CT值<35的30孔，拆出反應性率為100.00%。且除1孔僅第1次拆分呈反應性結果外，其余29 孔均是2次拆分為同一反應性。見表3。當混樣CT值<40時，兩次拆分均為同一反應性標本的比例隨著混樣CT值降低而增加；當混樣CT值<45時，兩次拆分均為非反應性的比例隨著混樣CT值降低而降低；混樣CT值與拆分結果之間關系的線性趨勢見圖1。

圖1 混樣CT值與拆分結果關系圖

表3 混樣CT值與拆分結果[n(%)]

2.3混樣CT值與拆分CT值的相關性分析 分析4種不同拆分結果對應的混樣CT值(拆出2例及以上反應性標本的26孔因數據少不納入統計分析)，2次拆分為同一反應性、2次拆分均呈非反應性、僅第1次拆分呈反應性、僅第2次拆分呈反應性標本的CT值分別是(37.82±3.38)、(39.55±3.60)、(38.73±3.46)、(38.44±2.14)。混樣CT值與拆分CT值呈正相關(r=0.243，P<0.05)。見表4。

表4 混樣與拆分CT值統計分析

3 討 論

本中心核酸檢測實驗室從建立至今，對在COBAS s 201核酸系統上混樣檢測呈反應性的孔位均進行2次拆分，以達到雙孔復試的目的，為保障輸血安全投入了大量的財力和人力。其中，2016年混樣反應性孔位數量明顯少于其他年份，是因當年在該系統上進行核酸檢測的標本總量較少所致。

2015—2020年該系統725孔反應性孔位進行2次拆分后，共拆分出543例HBV-DNA反應性標本，拆出反應性率為74.90%，高于深圳、無錫和東莞地區(拆出反應性率分別是66.7%、66.67%、61.25%)[6-8]。本研究共有41例HBV-DNA反應性標本來自第2次拆分，拆分CT值最大47.30，最小35.21。姚鳳蘭等[9]對63例隱匿性HBV感染標本的感染狀態分析發現，49例(77.78%)標本HBV-DNA水平低于20 IU/mL。陳少彬等[10]研究發現，在單檢模式下，HBV水平為20 IU/mL時的漏檢率為7.55%，低于混樣模式下的漏檢率81.4%(P<0.05)。低病毒拷貝標本在進行混樣檢測時，漏檢的概率較單檢更高。根據泊松分布原則，低病毒拷貝標本在取樣時，可能會由于病毒顆粒分布不均導致病毒檢測呈非反應性。因此，對于低病毒拷貝標本，2次拆分可以增加反應性標本的檢出率，減少經輸血傳播疾病的發生，更保障了輸血安全。

有研究指出，CT值大小與標本中病毒的原始拷貝數呈線性反比關系[11]。但當標本中病毒拷貝數低或者接近檢測下限時，定性檢測的混檢與拆分CT值相關性較差，定性檢測的CT值分析難以得出準確的趨勢關系[8]。本研究中，混樣CT值較高(>40)時，出現混樣與拆分結果線性關系不強的情況，可能與上述原因有關。

拆出2例及以上反應性標本的26孔中，19孔(CT值35.2～44.6)在2次拆分均有相同反應性標本拆出，說明在上述孔位中，可能同時存在2例病毒拷貝數較高的標本，才能在2次拆分中均呈反應性結果；7孔(CT值36.7～39.6)2次拆分的反應性標本不相同，可能原因是標本僅含有低拷貝數HBV-DNA，根據泊松分布原則，存在病毒分布不均勻的情況，導致2次拆分結果不一致，此外，也存在假陽性的可能[11]。

除同時拆出2例及以上的26孔(未納入分析)，其余4種拆分結果的混樣CT值與拆分CT值呈正相關(r=0.243，P<0.05)，即混樣CT值越小，拆分出的反應性標本CT值越小；混樣CT值越大，拆分出的反應性標本CT值越大，當2次拆分均呈非反應性時，混樣CT值最大。從理論上來講，每經過3.3個熱循環靶模板總量增加一個數量級[12]。混樣CT值<35的30孔，拆出反應性率是100.0%，且除1孔外，其余全是2次拆分均呈反應性。只有第1次拆分呈反應性的108孔(1例除外)和只有第2次拆分呈反應性的41孔，混樣CT值均≥35。因此，筆者認為混樣CT值為35是一個關鍵點。在COBAS s 201核酸系統檢測獻血者標本時，若混樣CT值<35且首次拆分結果呈非反應性，需重點關注，最好進行復查，避免標本漏檢或者假陰性情況的出現，從而導致輸血感染等嚴重后果。

同時，核酸檢測假陽性結果也值得注意。采用標準化的程序檢測獻血者標本，規范工作人員的操作，保持儀器設備良好的運行狀態，加強實驗室的環境監控等措施能有效減少假陽性結果的出現。另外，本研究缺少反應性標本的確認結果，在未來應對可疑標本進行追蹤，確認其真實的感染狀態，從而保障血液安全，減少血液浪費。