先天性心臟病新生兒血漿circRNAs芯片數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析*

潘秋亞,趙 靜#,崔 玥,張雯婷,惲 琪,鄭愛斌,姚圣連,張 偉,陳 云,顧 猛▲

1.常州市兒童醫(yī)院兒科，江蘇常州 213003；2.高郵市中醫(yī)醫(yī)院兒科，江蘇揚(yáng)州 225699

先天性心臟病(CHD)指出生時即存在的心血管結(jié)構(gòu)或功能異常,其發(fā)病率在各類出生缺陷疾病中占首位,是中國大城市5歲以下兒童的首要死因。出生后嚴(yán)重CHD易導(dǎo)致新生兒因呼吸或循環(huán)衰竭而死亡,存活者常繼發(fā)心、肺及腦等重要器官損傷而導(dǎo)致生長發(fā)育及智力發(fā)展障礙[1-2]。該病嚴(yán)重威脅嬰幼兒生命和健康,給社會和家庭帶來了沉重負(fù)擔(dān),是一類急待解決的優(yōu)生優(yōu)育難題。環(huán)狀RNA(circRNAs)是一種在哺乳動物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的新型非編碼RNA,具有疾病特異性、組織特異性和時序特異性,隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展,其調(diào)控功能越來越被人們重視[3]。circRNAs在CHD發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用,有望成為一種新的潛在的CHD診療生物標(biāo)志物或治療靶點[4]。本研究通過人類circRNA基因芯片檢測CHD新生兒和健康體檢新生兒血漿中的circRNAs表達(dá)譜,分析差異表達(dá)的circRNAs,利用生物信息學(xué)方法構(gòu)建新生兒CHD的circRNA-miRNA-mRNA的調(diào)控網(wǎng)絡(luò),揭示miRNA表達(dá)調(diào)控機(jī)制,探討新生兒CHD的可能發(fā)病機(jī)制,為預(yù)防新生兒CHD發(fā)生、發(fā)展提供新的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 本研究采用病例對照研究設(shè)計來進(jìn)行CHD新生兒血漿中circRNA芯片數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析。經(jīng)常州市兒童醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)和簽署知情同意書，本研究收集2020年在常州市兒童醫(yī)院新生兒科收治的經(jīng)超聲心動圖確診的CHD患兒及同期健康新生兒血漿標(biāo)本各13例，為去除非研究目的相關(guān)因素干擾，13例CHD新生兒均經(jīng)遺傳學(xué)基因篩查排除遺傳性疾病。 其中3例CHD患兒標(biāo)本和3例健康新生兒標(biāo)本送上海康成生物工程有限公司進(jìn)行血漿中的circRNA進(jìn)行檢測，剩余標(biāo)本用于驗證芯片結(jié)果的可靠性。

1.2方法

1.2.1芯片分析 應(yīng)用Arraystar circRNA基因芯片(上海康成生物工程有限公司)對3例CHD新生兒及3例健康新生兒血漿標(biāo)本中的circRNA進(jìn)行檢測。

1.2.2circRNA的鑒定及注釋 根據(jù)已有研究關(guān)于circRNA結(jié)構(gòu)特征及剪接序列特征，采取以下措施進(jìn)行circRNA鑒定：(1)splice sites兩端是GU/AG；mismatch≤2；(2)Back-spliced junctions reads≥2；(3)two splice sites≤100 kb。基于circRNA在基因組中的位置關(guān)系及與蛋白編碼基因的關(guān)系，對篩選獲得的circRNA進(jìn)行注釋，主要分為兩個部分，circRNA位置關(guān)系分類及circRNA功能注釋。circRNA分類注釋主要依據(jù)circRNA在基因組中基因位點關(guān)系進(jìn)行注釋，分為5類，即intronic circRNA、exonic circRNA、antisense circRNA、senseoverlaping circRNA及intergenic circRNA。circRNA功能注釋是基于circRNA形成機(jī)制，主要依據(jù)circRNA對應(yīng)的circRNA-hosting gene功能進(jìn)行circRNA的GO注釋及KEGG注釋。

1.2.3差異基因的篩選 將原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入SAM軟件分析，采用t檢驗計算P值，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。對芯片原始結(jié)果用R軟件包進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化和數(shù)據(jù)分析。通過P值/FDR篩選組間差異表達(dá)circRNAs(FDR>2.0，P<0.05)。將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Pusamen1.10和Cluster 3.0 軟件進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，軟件輸出聚類圖及火山圖來顯示新生兒CHD血清中差異circRNAs的情況。

1.2.4基因本體分析和信號通路分析 將差異表達(dá)基因?qū)隓AVID和Pathway Studio 5.0分析軟件，計算分類種類、每個種類的基因數(shù)及P值等內(nèi)容，并且根據(jù)P值大小依次輸出。Fisher確切概率法檢驗兩個小數(shù)據(jù)分類的關(guān)聯(lián)，P值表示GO富集差異表達(dá)基因的意義，P值越低，差異性越大(P<0.05)。借助KEGG數(shù)據(jù)庫對CHD差異表達(dá)基因進(jìn)行研究。

1.2.5circRNA/miRNA結(jié)合位點分析 每個FDR>2的circRNA均用美國Arraystar公司的miRNA結(jié)合位點預(yù)測軟件預(yù)測5個高匹配值的miRNA結(jié)合位點。通過部分序列互補(bǔ)分析circRNA結(jié)合的miRNA，形成cirRNA-miRNA關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2.6miRNA靶基因預(yù)測 利用GCBI網(wǎng)站(http://www.targetscan.org)進(jìn)行micRNA的靶基因預(yù)測。

1.2.7應(yīng)用Cytoscape軟件構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖 構(gòu)建每個FDR>2的circRNA與之預(yù)測結(jié)合的前5位高匹配值的miRNA的CircRNA/miRNA網(wǎng)絡(luò)圖；構(gòu)建前5位的miRNA至少有一個是文獻(xiàn)報道與CHD相關(guān)的miRNA的circRNA/miRNA網(wǎng)絡(luò)圖；通過靶基因預(yù)測與參考文獻(xiàn)結(jié)合選取結(jié)合CHD相關(guān)的miRNA數(shù)目最多的hsa_circRNA_091419，來構(gòu)建circRNA/miRNA或 circRNA/miRNA/mRNA 網(wǎng)絡(luò)圖。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 以CircRNA芯片結(jié)果為基礎(chǔ)，采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析，采用t檢驗，篩選出組間FDR>2的基因為表達(dá)顯著上調(diào)基因，所有差異性基因均滿足P<0.05。同時將所有差異性表達(dá)基因?qū)隦 軟件包后，得出GO分析和信號通路分析結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1CHD新生兒血漿標(biāo)本中差異表達(dá)circRNAs譜的表達(dá)特征 將CHD新生兒血清(n=3)與正常健康新生兒血清(n=3)進(jìn)行配對分析，用微陣列探針共檢測得到1 711個circRNAs，其中差異表達(dá)的 circRNAs 375個，在CHD新生兒血清中表達(dá)上調(diào)的circRNAs 115個，下調(diào)的circRNAs 260個(FDR>2，P<0.05)。

2.2差異表達(dá)circRNAs的驗證 為保證芯片結(jié)果的準(zhǔn)確可靠性，從差異表達(dá)前20條circRNAs中隨機(jī)選取5條circRNAs(hsa-circ-091419、hsa-circ-402458、hsa-circ-406494、hsa-circ-016545、hsa-circ-102016)，采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)對10對標(biāo)本(10例CHD新生兒血漿和10例健康新生兒血漿)中的該5條circRNAs水平進(jìn)行檢測，結(jié)果以GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行標(biāo)定。相對表達(dá)量通過擴(kuò)增產(chǎn)物所需的循環(huán)次數(shù)Ct值計算，應(yīng)用2-ΔΔCt法，其中ΔCt=Ct標(biāo)本-CtGAPDH。結(jié)果顯示，PCR的折疊變化與芯片結(jié)果雖有所不同，但其表達(dá)的趨勢與芯片相同，說明兩種方法結(jié)果的一致性良好，表明芯片結(jié)果是可靠的，可以用于后續(xù)的研究，結(jié)果見圖1。

注：A～E分別為CHD組與對照組hsa-circ-406494、hsa-circ-402458、hsa-circ-102016、hsa-circ-091419、hsa-circ-016545 circ RNAs相對表達(dá)量，*表示P<0.001。

2.3circRNA/miRNA的結(jié)合位點分析 circRNA具有miRNA的分子海綿作用，通過作用于疾病相關(guān)的miRNA，影響疾病的發(fā)生、發(fā)展。通過美國Arraystar公司的miRNA結(jié)合位點預(yù)測軟件，對每個差異表達(dá)的circRNA預(yù)測5個高匹配值的miRNA結(jié)合位點。375個差異表達(dá)的circRNAs預(yù)測結(jié)合了1 546個miRNAs，其中包括14個CHD相關(guān)的miRNAs。

2.4信號通路及circRNA/miRNA相互作用的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 對差異表達(dá)的14個miRNAs的靶基因進(jìn)行信號通路分析，結(jié)果顯示富集總分排名前3位的通路局灶性黏連、肌動蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)、血管平滑肌收縮均與CHD的病理相關(guān)。在這14個CHD相關(guān)的miRNAs中，對應(yīng)結(jié)合了 24個circRNAs，有的miRNA不止結(jié)合一個circRNA，如hsa-miR-208-a-5p；而一個circRNA也結(jié)合了多個miRNA，其中hsa_circRNA_102410結(jié)合了5個miRNA，包括 hsa-miR-92a-1-5p、hsa-miR-92b-5p、hsa-miR-612、hsa-miR-181d-3p、hsa-miR-890。通過hsa_circ_091419/miR-145/mRNA的網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建，預(yù)測的CHD相關(guān)靶基因34個，包括hsa-miR-145-3p的靶基因ITGB8。

3 討 論

CHD是胚胎發(fā)育過程中最為常見的出生缺陷之一,在活產(chǎn)新生兒中發(fā)病率為4‰～5‰,是嬰幼兒期非感染死亡的首位病因[1]。研究人員認(rèn)為CHD的發(fā)生、發(fā)展與基因突變等遺傳因素密切相關(guān),但具體發(fā)病機(jī)制仍不清楚。目前,診斷胎兒CHD沒有金標(biāo)準(zhǔn),只能依賴超聲心動圖,雖然其診斷特異度高,但其漏診率卻相當(dāng)高。

心臟發(fā)育異常是一個涉及多因素共同作用的復(fù)雜過程,其病理機(jī)制至今尚不清楚。從基因水平看,CHD的發(fā)生、發(fā)展與Nkx2-5、GATA4、SRF等基因在不同時空通過Notch、Wnt等信號通路進(jìn)行調(diào)控及相互作用有關(guān)[4-5]。分子生物學(xué)為理解CHD的發(fā)生、發(fā)展提供了線索和依據(jù),目前的研究僅限于發(fā)現(xiàn)CHD差異表達(dá)的基因,但對這些基因差異表達(dá)的上游調(diào)控機(jī)制研究甚少。隨著高通量檢測技術(shù)的成熟和轉(zhuǎn)錄組學(xué)的發(fā)展,有研究表明,微小RNA(miRNA)、長鏈非編碼RNA(lncRNA)和circRNAs等非編碼RNA可參與細(xì)胞生長、分化調(diào)控及細(xì)胞增殖與凋亡等生物學(xué)過程,在心臟發(fā)育中發(fā)揮重要作用[6-8]。

高通量的篩查手段,如circRNAs芯片或測序技術(shù)使研究疾病中circRNAs的差異表達(dá)成為可能,為后續(xù)circRNAs功能研究或生物標(biāo)志物篩選提供了極大的便利,circRNAs及其相關(guān)結(jié)合蛋白的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)、結(jié)構(gòu)和調(diào)控的異常,可能是腫瘤、心血管疾病等多種疾病發(fā)生、發(fā)展的重要原因。

circRNAs主要通過競爭性吸附miRNA、調(diào)控剪接或轉(zhuǎn)錄過程及調(diào)節(jié)RNA結(jié)合蛋白等形式來影響生理過程,如組織發(fā)育、胰島素分泌和衰老,且參與了心血管病變、心臟成纖維細(xì)胞、心肌肥大、神經(jīng)系統(tǒng)疾病及癌癥等病理過程[9]。circRNAs因自身閉合結(jié)構(gòu)對核酸酶不敏感,要比線性RNA更為穩(wěn)定,可作為潛在的診斷心血管疾病和癌癥的生物標(biāo)志物[3,10]。

許多心血管疾病和冠狀動脈疾病都與circRNAs有關(guān)。有研究表明,敲除CIRCDHCR24可以減輕血管平滑肌細(xì)胞的增殖、遷移和表型轉(zhuǎn)換,從而預(yù)防血管阻塞性狹窄[11]。circMGAT1可通過調(diào)節(jié)miR-34a/YAP1軸,抑制細(xì)胞凋亡,促進(jìn)細(xì)胞增殖,為冠心病的治療提供靶點[12]。有研究結(jié)果表明,miR-22-3p的缺失再現(xiàn)了circMap3k5對血管平滑肌細(xì)胞的抗增殖作用[13-14]。在SMC特異性Tet2基因敲除小鼠中,Tet2的缺失消除了circMap3k5介導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞的抗增殖作用。circMAP3K5是TET2介導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞分化的主要調(diào)控因子。靶向circMAP3K5/miR-22-3p/TET2軸可能提供了一個潛在的內(nèi)膜增生相關(guān)疾病的治療策略,包括再狹窄和動脈粥樣硬化[13]。文獻(xiàn)報道,circRNA-miRNA網(wǎng)絡(luò)的作用對冠心病具有重要影響,如心肌肥厚、心肌纖維化和心力衰竭[14]。中藥也具有抗動脈粥樣硬化、抑制凋亡、保護(hù)心肌和心肌細(xì)胞等作用,可通過調(diào)節(jié)miRNAs促進(jìn)細(xì)胞生長和保護(hù)血管系統(tǒng)[15]。

本研究采用Arraystar circRNA基因芯片對CHD新生兒及健康新生兒血清中circRNAs進(jìn)行篩查,旨在尋找眾多基因在表達(dá)上的差異性和相似性規(guī)律,找出在CHD發(fā)病中起重要作用的基因或通路。以circRNAs表達(dá)譜芯片結(jié)果為基礎(chǔ)篩選出表達(dá)顯著上調(diào)和顯著下調(diào)的circRNAs,通過生物信息學(xué)手段進(jìn)一步分析得出差異circRNAs線性基因GO分析,以美國Arraystar公司的miRNA結(jié)合位點預(yù)測軟件,對每個差異表達(dá)的circRNAs預(yù)測5個高匹配值的miRNA結(jié)合位點,375個差異表達(dá)的circRNAs預(yù)測結(jié)合了1 546個miRNAs,其中包括14個CHD相關(guān)的miRNAs,hsa-miR-145-3p、hsa-miR-499-a-3p、hsa-miR-208-a-5p、hsa-miR-199-a-5p等已被證實參與CHD的相關(guān)病理過程[16-19]。應(yīng)用KEGG數(shù)據(jù)庫對差異表達(dá)circRNAs進(jìn)行功能預(yù)測,同時對可能與CHD相關(guān)的miRNAs進(jìn)行生物信號通路分析,最后,以結(jié)合CHD相關(guān)miRNAs數(shù)目最多的hsa-circRNA-091419為例,應(yīng)用Cytoscape軟件構(gòu)建了hsa-circRNA-091419/miR-145/mRNA的網(wǎng)絡(luò)圖。已有文獻(xiàn)報道,miR-145-5p在冠心病患者中低表達(dá),其過度表達(dá)可通過抑制Smad4有效減輕H/R誘導(dǎo)的CMEC損傷[16]。提示hsa-circRNA-091419通過作用海綿吸附miR-145,作用于其靶基因ITGB8來影響心肌標(biāo)志物心鈉素、心肌肌鈣蛋白Ⅰ的表達(dá),從而影響心肌的發(fā)育。

本研究仍有一定的局限性,本研究僅通過生物信息學(xué)預(yù)測hsa_circ_091419可能在心臟發(fā)育過程中發(fā)揮作用,但沒有通過試驗進(jìn)行驗證,其與靶基因ITGB8及吸附標(biāo)靶miR-145之間的關(guān)系也需要進(jìn)一步的驗證。