產前篩查和診斷多技術優化整合在胎兒出生缺陷中的對比研究*

馬海霞，李 春，宋 娟，李 莉

1.上海市長寧區婦幼保健院檢驗科，上海200051；2.銀川市婦幼保健院檢驗科，寧夏銀川 750001;3.銀川市婦幼保健院產科，寧夏銀川 750001

隨著醫療技術的發展，人們對優生優育越來越重視。我國是人口大國，也是出生缺陷和殘疾高發國家[1-2]。2018年《關于印發全國出生缺陷綜合防治方案的通知》[1]中指出，我國每年出生缺陷胎兒高達90萬人，占全年出生人口的5.6%，出生缺陷已成為影響國民素質的重大公共衛生問題。因此，實施出生缺陷臨床產前篩查和診斷存在必要性，其能夠使胎兒畸形盡早診斷出來，進而及時干預，減少出生缺陷的發生，提升人口素質[3-4]。本文通過優化和有效整合多種產前篩查和診斷檢測方法，對比研究孕期產前篩查和診斷多技術優化整合模式在預防胎兒出生缺陷中的應用。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取在銀川市婦幼保健院(以下簡稱本院)產前診斷中心門診就診的孕婦，結合具體臨床情境及本院現有開展技術的實際情況，優化和有效整合多種產前篩查和診斷技術，包括產前超聲檢查、無創產前檢測(NIPT)、血清學篩查、染色體核型分析、染色體微陣列技術等，制訂針對不同孕婦的個體化產前篩查和診斷模式，把就診孕婦分為優化整合組和未優化整合組。所有納入者均簽署知情同意書，本研究經本院醫學倫理委員會批準通過。

1.2分組標準 優化整合組：就診適齡孕婦一般在孕11～13+6周行胎兒頸部透明帶厚度(NT)檢測，NT≥3.0 mm孕婦建議選擇介入性產前診斷；NT檢測(NT<3.0 mm)聯合孕早中期血清學篩查，評估結果為高風險的孕婦建議選擇介入性產前診斷；評估結果為臨界風險的孕婦建議選擇NIPT，而NIPT高風險孕婦建議選擇介入性產前診斷；血清學篩查低風險及NIPT低風險孕婦建議中晚孕期定期產檢及隨訪。高齡、不良孕產史、夫婦一方染色體異常、超聲軟指標異常的孕婦結合具體臨床情境及本院現有開展技術的實際情況可選擇介入性產前診斷。所有孕婦均于孕22～24周進行Ⅲ級超聲檢查。本研究中選取按以上流程進行規范系統產檢的就診孕婦6 845例為優化整合組。

未優化整合組：就診孕婦未進行規范系統產檢而在基層醫院隨機產檢；或在不具備產前診斷資質的醫療機構只做Ⅰ級超聲檢查，未做NT檢測或孕早期血清學篩查；醫生未充分告知以及個人原因錯失檢查時機；而孕中期來本院只進行孕中期血清學篩查或介入性產前診斷或Ⅲ級超聲檢查等。本研究中選取只進行孕中期血清學篩查或羊水染色體核型分析或Ⅲ級超聲檢查就診孕婦6 413例為未優化整合組。

1.2方法

1.2.1孕期超聲檢查 胎兒結構異常的超聲篩查規范采用國際婦產科超聲學會(ISUOG)和英國胎兒醫學基金會(FMF)建議使用的孕早期胎兒解剖結構檢查橫切法及軟指標項目的掃查，包括孕早期NT檢測及孕中期Ⅲ級超聲檢查[5-6]。

1.2.2孕早中期血清學篩查 抽取孕婦空腹狀態下外周靜脈血5 mL，靜置30 min，3 000 r/min離心6 min，取血清，置于-20 ℃環境下保存備用。采用鉑金埃爾默公司生產的全自動時間分辨免疫分析系統進行產前血清學篩查，嚴格按照標準化檢測操作程序執行檢測步驟。篩查方法及判斷標準在Lifecycle軟件中輸入妊娠患者年齡、體質量、孕周等臨床資料信息，計算血清甲胎蛋白(AFP)、游離雌三醇(uE3)及人絨毛膜促性腺激素(β-HCG)等的中位數值(MoM值)[7]。經B超測定胎頭雙頂徑評估孕齡后結合孕婦的年齡及體質量，通過評估軟件計算出21-三體綜合征、18-三體綜合征、開放性神經管缺陷的“危險系數”。

1.2.3NIPT 采集孕婦靜脈血10 mL，離心分離血漿，提取血漿游離DNA、構建文庫、文庫定量、高通量測序機測序及數據分析，計算出13、18、21 3條染色體和其他染色體Z值。利用Z值進行生物學信息分析來評估標本13-三體綜合征、18-三體綜合征、21-三體綜合征及性染色體異常是否為高風險。

1.2.4染色體核型分析 嚴格無菌操作B超定位經腹壁行羊膜腔穿刺術，分裝于兩支15 mL離心管中，800 r/min離心10 min后，留取1.0～1.5 mL沉淀，加5 mL培養基混勻后，分別接種于兩瓶25 cm2的羊水培養瓶，培養7 d后換液，當貼壁細胞生長旺盛可見大量克隆時，加入濃度為10 μg/mL的秋水仙素60 μL，作用3.5～4.0 h后收獲細胞進行核型分析，必要時可進行傳代培養收獲細胞。核型分析按照人類細胞遺傳學國際命名體制(ISCN2016)標準進行分析診斷。

1.2.5染色體微陣列(CMA)技術 送10 mL羊水轉運至北京貝康醫學檢驗所，采用美國Thermo公司的Cytoscan 750K芯片掃描，檢測流程包括消化、連接、聚合酶鏈式反應(PCR)產物純化、片段化處理，以及標記、探針雜交、洗染掃描等過程。芯片檢測信息的分析和判讀使用Chromosome Analysis Suite(ChAS)2.1軟件，同時結合目前國際上常用的基因組與表型公共數據庫[加州大學圣克魯茲分校基因組瀏覽器數據庫(UCSC Genome Browser，http:// genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway)、臨床基因組數據庫(ClinGene，http://www.clinicalgenome.org)、基于Ensembl資源建立的人類染色體不平衡和表型數據庫(DECIPHER，https://decipher.sanger.ac.uk)、基因組變異數據庫(DGV，http://dgv.tcag.ca/dgv/app/home)、在線人類孟德爾遺傳數據庫(OMIM，http://www.omim.org)和公共醫學數據庫(PubMed，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed)]進行檢索和判讀。

1.3統計學處理 應用SPSS18.0統計軟件進行數據處理及統計分析。計數資料采用頻數或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1優化整合組與未優化整合組異常檢出率比較 優化整合組異常檢出率高于非優化整合組(χ2=17.554，P<0.05)。見表1。

表1 優化整合組與未優化整合組異常檢出率比較

2.2優化整合組與未優化整合組出生缺陷發生率比較 優化整合組出生缺陷發生率低于非優化整合組(χ2=9.297，P<0.05)。見表2。

表2 優化整合組與未優化整合組出生缺陷發生率比較

2.3優化整合組和未優化整合組出生缺陷胎兒類型和例數比較 優化整合組中，行NT評估5 513例，NT≥3 mm 113例，行孕早中期血清學篩查5 400例，行NIPT 2 194例，經產前診斷確診陽性9例，其中21-三體綜合征8例，性染色體異常1例，異常檢出率為0.41%。羊水染色體核型分析937例，非整倍體及嵌合體和性染色體異常39例，異常檢出率為4.16%；CMA檢測59例，異常12例，異常檢出率20.34%；Ⅲ級超聲檢查6 845例，異常310例，異常檢出率4.53%(神經系統畸形40例、胎兒顏面畸形22例、消化系統畸形17例、胎兒心臟異常66例、胎兒胸腔異常10例、胎兒腹裂畸形3例、泌尿系統異常26例、胎兒腫瘤10例、非免疫性水腫23例、胎兒附屬物13例、肌肉骨骼及肢體異常30例、多發畸形50例。

未優化整合組中，行孕中期血清學篩查5 203例；羊水染色體核型分析659例，非整倍體及嵌合體和性染色體異常25例，異常檢出率為3.79%；Ⅲ級超聲檢查762例，異常216例，異常檢出率為28.35%。優化整合組和未優化整合組出生缺陷胎兒的類型及例數見表3。

表3 優化整合組和未優化整合組出生缺陷胎兒類型和例數比較(n)

3 討 論

孕早期篩查包括超聲測定NT，NT是胎兒頸后皮膚至皮下軟組織之間無回聲的最大厚度，一般在孕11～13+6周進行篩查。NT正常值應小于3 mm，有的醫院選取以小于2.5 mm為界限。孕早期篩查還包括母體血清學篩查，以及胎齡(以胎兒頂臀長計量)聯合妊娠相關血漿蛋白-A(PAPP-A)、總或游離β-hCG等血清學指標的測定。孕早期篩查結果呈高風險的孕婦，可行絨毛膜穿刺術進行產前診斷。孕早期篩查的開展不但可以將異常檢出的孕周提前，還可以獲得更好的篩查檢出效率，在5%假陽性率的水平下，孕早期篩查異常檢出率可達到85%左右[8]。但由于本院絨毛膜穿刺術還未開展，因此NT檢測聯合孕早期血清學篩查高風險的孕婦行羊水穿刺進行產前診斷或者轉診到其他產前診斷中心。孕中期血清學篩查通過測定孕15～20周母親血清中AFP、uE3及β-hCG水平，經超聲測定胎頭雙頂徑評估孕齡后結合孕婦的年齡和體質量計算出“危險系數”。而單純的孕中期血清學篩查存在篩查效率較低、異常檢出孕周較晚的問題[9]。本研究中未優化整合組部分病例即是行單純的孕中期血清學篩查而導致出生缺陷胎兒的漏篩。NIPT是在孕12周后抽取孕婦靜脈血，對血漿中游離DNA片段(包含胎兒游離DNA片段)進行高通量測序，并將測序結果進行生物信息分析，從中得到胎兒的遺傳信息，從而準確檢測21-三體綜合征、18-三體綜合征、13-三體綜合征等。對于胎兒21-三體綜合征和18-三體綜合征來說，異常檢出率大于98%，假陽性率在5‰以下；當假陽性率在5‰以下時，對13-三體綜合征的異常檢出率也達90%以上[10]。雖然該方法對于胎兒常見染色體異常的風險提示較準確，但仍然存在假陽性和假陰性的可能，因此臨床應用定位應為產前篩查而非產前診斷。本研究中優化整合組中行NIPT 2 194例，經染色體核型分析產前診斷異常檢出9例，其中21-三體綜合征8例，性染色體異常1例，提示NIPT對于非整倍體異常篩查效能及異常檢出率均尚可。以上檢測技術屬于產前篩查技術，多技術優化整合應用可以提高出生缺陷檢出率，但是不能代替產前診斷技術。

介入性產前診斷技術包括絨毛膜穿刺術、羊膜腔穿刺術和臍血穿刺術，本院僅開展羊膜腔穿刺術。羊膜腔穿刺術抽取羊水細胞培養做染色體核型分析，用以診斷21-三體綜合征、18-三體綜合征等重大出生缺陷，其準確性高，技術成熟穩定，是染色體病產前診斷的“金標準”，羊水染色體核型分析在制片所能達到的顯帶分辨率(如G帶500條帶范圍內)對染色體異常的診斷是全息性的，除能夠檢測染色體非整倍體外還能夠檢測染色體結構改變。本研究優化整合組中行羊水染色體核型分析937例，非整倍體及嵌合體和性染色體異常39例，異常檢出率為4.16%，而未優化整合組行羊水染色體核型分析659例，非整倍體及嵌合體和性染色體異常25例，異常檢出率為3.79%，異常檢出率低于優化整合組，提示孕期產前篩查和診斷多技術優化整合模式能提高出生缺陷胎兒的檢出率。而CMA技術是以微陣列為技術基礎的基因組拷貝數分析技術，主要包括微陣列比較基因組雜交(aCGH)和單核苷酸多態性技術(SNP)的微陣列。CMA技術具有高靈敏度和高特異度的優勢，其能夠提供大量有臨床價值的信息，大大提高了遺傳異常疾病的檢出率。染色體異常包括染色體數目異常和染色體結構異常，臨床上常見的染色體疾病包括21-三體綜合征、18-三體綜合征、13-三體綜合征、Turner綜合征、克氏綜合征、超雌綜合征、超雄綜合征等[11]。而CMA技術可穩定檢出<10 Mb的小片段拷貝數變異，是羊水染色體核型分析的有效補充，有助于檢出有染色體疾病的胎兒，在明確異常來源的前提下既可以避免出生缺陷的發生，也可以進行再發風險的評估，以便指導生育。本研究優化整合組中CMA技術檢測59例，異常12例，異常檢出率20.33%，有效預防了出生缺陷的發生。本研究中優化整合組出生缺陷發生率低于非優化整合組，提示孕期產前篩查和診斷多技術優化整合模式能明顯降低出生缺陷的發生率。

本研究中優化整合組異常檢出率高于未優化整合組，且出生缺陷發生率低于未優化整合組。由于以往的篩查和診斷策略只是針對不同的研究方法而使其達到最高的陽性率和最低的陰性率，但沒有把各種不同的方法有效整合起來，為患者制訂最有效、最便捷、最具性價比的產前篩查和診斷方案。本研究在現有能開展的產前篩查和診斷技術的條件下，將產前超聲檢查、血清學篩查、NIPT、染色體疾病診斷、細胞遺傳及分子遺傳學檢測及遺傳咨詢在一個平臺下有效優化整合，結合具體臨床情境制訂個體化的最佳診療方案，將傳統優生醫學與基因組學融合，建立更為完善的孕期篩查和診斷的新模式，以實現最大化的臨床服務，并能夠有效減少出生缺陷的發生。