痰液宏基因組測序在肺部感染中的診斷價值*

韓心遠，高小娟，韋潔宏，熊 丹，張秀明

深圳市羅湖醫院集團醫學檢驗實驗室，廣東深圳 518001

肺部感染是指由多種病原體引起的終末氣道、肺泡腔和肺間質感染，常表現為呼吸困難、發熱、咳嗽、咳痰等癥狀[1]。臨床上針對器官移植、癌癥治療等通常會使用大劑量的免疫抑制劑，導致患者抵抗力下降，極易引發肺部感染。在重癥監護病房，患者術后護理不當，機械侵入性檢查或治療同樣極大地增加了肺部感染的可能性。此類患者往往病情發展快，預后差，且多為混合感染，快速精準的病原學診斷直接決定了患者的預后[2-4]。目前，臨床常規開展的傳統微生物鑒定手段(培養、涂片等)時間長且精度不夠，對臨床指導價值非常有限。近年來，無偏倚、通量高的宏基因組測序(mNGS)技術有效地助力了肺部疑難感染的病原學診斷。本研究采用mNGS檢測肺部感染患者痰液中的病原微生物，探討痰液宏基因組測序在肺部感染中的診斷價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 以2020年7月至2021年7月深圳市羅湖醫院集團重癥醫學科、兒科、呼吸內科重癥肺部感染患者為研究對象。納入標準：(1)出現胸痛、咳嗽、咳痰等癥狀；(2)體溫超過38 ℃；(3)經血常規檢查，白細胞計數明顯上升；(4)肺部有濕啰音；(5)胸部X線檢查顯示有肺部炎性改變。本研究符合《赫爾辛基宣言》原則。共納入22例患者，其中男10例(45.5%)，女12例(54.5%)；年齡0～86歲；重癥醫學科患者11例，兒科患者3例，呼吸內科患者8例。所有患者均行微生物培養及mNGS檢測。

1.2痰液標本的收集 可自主咳痰患者清晨清水漱口3次后,用力咳出1～2口痰(勿將唾液和鼻后分泌物當作痰送檢)于無菌痰杯內。無痰或咳嗽少痰患者,先刷牙(口腔黏膜、舌頭和牙齦)，勿用牙膏，后用3～5 mL 3%NaCl超聲霧化后留痰。嬰幼兒患者，清洗口腔后，拍背或刺激咳嗽，用一次性無菌吸痰管，在嚴格無菌操作下，負壓吸取下呼吸道痰液。每一份標本的留取量應>1 mL，標本收集后立即分裝至無菌、干燥、潔凈的痰杯內，并于2 h內室溫送檢。

1.3方法 所有標本同時進行mNGS和微生物培養檢測。微生物培養方法參照《全國臨床檢驗操作規程》第4版[5]對痰液進行質量篩查。合格的標本分區劃線接種于血瓊脂平板、巧克力瓊脂平板、麥康凱平板。置5%～10% CO2環境中，(35±2)℃培養18～24 h。所獲菌株經人工及microflex LT/SH全自動快速生物質譜檢測系統(德國布魯克公司)鑒定。mNGS檢測包括DNA和RNA兩部分的檢測。RNA檢測部分需將宿主細胞核糖體RNA去除，以提高RNA病毒的檢測靈敏度。總核酸提取后，利用隨機引物建庫，PCR擴增出標本中的所有微生物，最后對擴增片段的序列進行測定和比對，鑒定出具體的微生物種類，隨后去宿主化以消除正常的人類微生物群落背景，從而找到所檢測臨床標本中可能致病的微生物。mNGS技術主要檢測指標為從微生物中讀取到的特異核酸read數目，read數目與該病原體含量呈正相關。若是定植微生物，read數目含量不會太高。兩種檢測方法結果一致性比較：當微生物培養與mNGS檢測出完全相同的病原體，認為結果完全一致；檢測結果部分相同，認為結果部分一致；檢測結果完全不同，認為結果不一致。

1.4統計學處理 采用SPSS23.0軟件對數據進行數據處理及統計分析。計數資料采用頻數或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1mNGS與微生物培養結果比較 兩種檢測方法結果顯示，15例mNGS與微生物培養均為陽性，陽性符合率為93.8%；2例mNGS與微生物培養均為陰性，陰性符合率為33.3%；總符合率為77.3%。見表1。

表1 mNGS和微生物培養結果比較

2.2兩種檢測方法檢出不同種類病原體結果比較 在22例肺部感染患者中，兩種檢測方法病毒檢出率比較，差異有統計學意義(P<0.05)，mNGS檢測出4種病毒，分別是呼吸道合胞病毒B型、人皰疹病毒1型、人皰疹病毒4型及人皰疹病毒6B型。微生物培養常見鮑曼不動桿菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌，mNGS檢測結果中常見肺炎鏈球菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、白假絲酵母菌及人皰疹病毒，兩種檢測方法對細菌和真菌檢出率比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 兩種檢測方法檢出不同種類病原體結果比較 [n(%)]

2.3兩種檢測方法病原體檢出種類數比較 在22例肺部感染患者中，傳統的微生物培養在多數情況下只能培養出1種病原菌。兩種檢測方法對1種及>2種病原體的檢出率比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 兩種檢測方法病原體檢出種類數比較[n(%)]

2.4兩種檢測方法結果一致性比較 在兩種檢測方法結果完全一致的病原體中，2例微生物培養和mNGS檢測均為陰性，2例微生物培養和mNGS結果均為陽性且一致(鮑曼不動桿菌1例，銅綠假單胞菌1例)。在兩種檢測方法結果不一致的病原體中，3例微生物培養陰性，mNGS檢測陽性(肺炎鏈球菌2例、延長奈瑟菌1例、金黃色葡萄球菌和流感嗜血桿菌混合感染1例)，1例mNGS檢測陰性，微生物培養陽性(鮑曼不動桿菌和嗜麥芽窄食單胞菌混合感染1例)。見表4。

表4 兩種檢測方法結果一致性比較[n(%)]

3 討 論

肺部感染是全球發病率最高的感染性疾病，對全球造成的疾病負擔極其沉重[6-7]。由于該類感染涉及的病原體眾多，多數醫生在無法進行準確的病原學診斷前常采用經驗治療[8]，不明病原體與混合感染往往導致經驗性治療效果不佳。快速、準確找到病原體，給予敏感藥物進行精準治療，提高疾病治療效果，改善不良預后，是臨床醫生迫切需要解決的問題[9-10]。

盡管傳統微生物培養是檢測病原菌的“金標準”，但對于肺部感染其檢出率僅為10%左右[11]，而PCR檢測雖然在特異度、靈敏度和檢測時效上明顯優于微生物培養，但因為PCR檢測是基于已知的病原體基因組進行測序鑒定，所能提供的信息依然不能解決臨床微生物診斷檢出率低的問題。因此，對于未知病原體和混合感染的檢測是傳統檢測方法難以逾越的障礙。無偏倚的mNGS與傳統檢測方法相比，無需培養，病原體覆蓋度廣，靈敏度高，有利于鑒定不明病原體和混合感染[9,12]。研究發現，在肺部感染性疾病中，mNGS檢測的檢出率均高于傳統檢測方法，在細菌檢測方面尤為突出[13-14]。本研究發現，在肺部感染中，mNGS檢測對細菌的檢出率略高于微生物培養，但兩者之間差異無統計學意義(P>0.05)，與近年研究結果不一致[13-14]，可能與本研究納入的檢測例數少有關。在混合感染方面，mNGS對1種及>2種病原體的檢出率明顯高于傳統檢測方法，提示mNGS檢測在混合感染的病原體檢測方面有巨大的優勢。有研究指出，mNGS檢測可以在早期確定重癥肺部感染患者的病原體，幫助臨床醫生對患者進行精準治療，從而降低重癥肺炎患兒28 d和90 d的病死率[15]。本研究中，在mNGS與微生物培養結果不一致的病原體中，微生物培養陰性結果明顯多于mNGS陰性結果，也證明了mNGS檢測的優越性。

mNGS對真菌、病毒等非細菌類病原體的鑒定具有固有的優勢，對于一般病原體，mNGS的檢測閾值為0.01～130.00 CFU/mL，而微生物培養的檢測閾值為100.00～1 000.00 CFU/mL[16]。mNGS基于病原體基因序列進行檢測，無需考慮其活性，對已接受廣譜抗菌藥物治療的患者，仍可借助mNGS技術進行病原學檢測[17]。在本研究的檢測結果中，微生物培養常見鮑曼不動桿菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌，mNGS檢測結果中常見肺炎鏈球菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、白假絲酵母菌及人皰疹病毒。

目前，臨床上傳統的病毒檢測方法主要為基于病毒基因的PCR技術和病毒抗原抗體的血清學檢測。但這些檢測方法需要提前預知病毒的基因序列或蛋白質序列信息，因此對于不明、未知病毒則不能有效檢出，也難以快速進行病毒分型。在本研究的mNGS檢測結果中共檢測出4種病毒，分別是呼吸道合胞病毒B型、人皰疹病毒1型、人皰疹病毒4型及人皰疹病毒6B型，利用mNGS可更加精確地檢測出病毒類型，以便臨床醫生對患者進行精準治療。

在mNGS的實際臨床應用中，仍存在多個需要關注的問題。(1)受制備與純化技術本身的限制，試劑中可能普遍存在外源性核酸序列，且mNGS所檢測到的病原體序列也可能來自于正常的定植微生物群、標本污染，而痰液標本往往會含有部分上呼吸道及口腔微生物，因此需要檢驗人員有效區分出感染微生物[18]。(2)病原體基因組數據庫不完善，目前還沒有囊括所有病原微生物的生物信息數據庫，有可能導致漏檢[19]。(3)mNGS技術已逐漸成熟，但還缺乏公認的質量控制與評價的指南，因此需要臨床醫生以科學嚴謹的態度，并采用合理的方式將mNGS應用于臨床。

本研究也存在一定局限性。首先，痰液作為臨床上常見的檢驗標本，有著取樣方便、操作簡單等優點，但痰液的采樣合格率因人而異，且檢驗結果易受口腔雜菌的影響，因此僅依賴痰液標本行病原體診斷尚缺乏定論；其次，傳統檢測方法中，只利用微生物培養進行病原體檢測，受限于培養基成分及培養環境的限制，難以檢測出苛養菌，亦無法檢測出病毒。

綜上所述，在肺部感染患者的病原學診斷中，痰液mNGS相比傳統檢測方法有更高的檢出率，尤其是對病毒及混合感染的檢測更具有優勢，可為肺部感染患者的臨床診治提供依據，有助于早期精準地進行臨床干預。