消毒劑種類及消毒時(shí)間對(duì)牡丹外植體的影響

張偉彬

（商丘職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生物系，河南 商丘 476000）

牡丹（Paeonia suffruticosaAndr.），又名富貴花、百兩金，屬芍藥科、芍藥屬落葉亞灌木，是中國(guó)傳統(tǒng)名花。牡丹栽培種類繁多，花姿艷麗、色澤鮮艷、氣味芳香，自古以來深受人們的喜愛，是園林綠化常選材料。牡丹干燥后的根皮——丹皮，是一味重要的中藥材，具有清熱涼血、活血散瘀的功效。牡丹作為商品進(jìn)行交易，始見于唐代。目前，牡丹的商品化生產(chǎn)取得了長(zhǎng)足的發(fā)展，其產(chǎn)量不僅滿足國(guó)內(nèi)市場(chǎng)，還出口到法國(guó)、日本、美國(guó)、意大利、南非、柬埔寨等國(guó)家和地區(qū)，使中國(guó)牡丹譽(yù)滿天下，取得了較大的經(jīng)濟(jì)效益。

牡丹喜陰，株型小，生長(zhǎng)緩慢，容易在疏松、肥沃、排水良好的中性土壤或砂土壤中生長(zhǎng)，不易在粘重土壤或低溫處栽植。目前牡丹繁殖方式有2 種，即無性繁殖和有性繁殖。有性繁殖存在結(jié)實(shí)能力低下、種子變異性強(qiáng)、無性繁殖系數(shù)低等問題，限制了生產(chǎn)需要。生產(chǎn)牡丹若采用無性繁殖，不僅生長(zhǎng)速度快，能在較短時(shí)期內(nèi)擴(kuò)大繁殖，且能保持母本的優(yōu)良特性。與有性繁殖相比，無性繁殖技術(shù)不受季節(jié)、氣候限制，還能在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生大量植株。牡丹需采用組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行快速繁殖，才能實(shí)現(xiàn)批量化生產(chǎn)，促進(jìn)產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。

組織培養(yǎng)技術(shù)作為一項(xiàng)加快牡丹育種和繁殖步伐的新方法，不僅是促進(jìn)牡丹產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的重要技術(shù)，還是牡丹快速繁殖技術(shù)的最有效手段之一。但目前牡丹組織培養(yǎng)技術(shù)還沒有形成完善的技術(shù)體系，存在試管苗玻璃化、褐化、污染、不易生根等問題。其中組織培養(yǎng)過程中造成污染的原因有很多，如外植體帶菌、培養(yǎng)器皿消毒不徹底、操作時(shí)不規(guī)范等。導(dǎo)致培養(yǎng)污染的病源主要分為細(xì)菌和真菌兩類。真菌性污染在接種7 d 左右出現(xiàn)，常表現(xiàn)為外植體長(zhǎng)白毛。細(xì)菌性污染的主要表現(xiàn)是培養(yǎng)皿周邊有粘液和發(fā)酵泡出現(xiàn)。

為保證培養(yǎng)物的無菌性，對(duì)觀賞牡丹外植體的消毒方法進(jìn)行試驗(yàn)研究，找出最佳消毒方法，以優(yōu)化觀賞牡丹的快速繁殖技術(shù)體系，為觀賞牡丹的批量化生產(chǎn)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

牡丹品種為洛陽國(guó)際牡丹園的觀賞牡丹——洛陽紅（Paeonia.suffruticosaLuoYangHong），屬1年生的中開花品種，株型高、直立，節(jié)間長(zhǎng)，枝條長(zhǎng)、較細(xì)而硬，植株生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)。

試劑：70%酒精，0.1%HgCl2。

1.2 方法

1.2.1 鱗芽的處理 使用牡丹的鱗芽作為外植體材料，研究消毒劑與消毒時(shí)間對(duì)外植體的影響。分別設(shè)置70% 酒精和0.1%HgCl2消毒劑進(jìn)行消毒處理，各消毒劑設(shè)置3 個(gè)不同消毒處理時(shí)間。70%酒精消毒處理時(shí)間分別為8 min、10 min、12 min；0.1%HgCl2消毒處理時(shí)間分別為5 min、8 min、12 min。消毒后的牡丹鱗芽接種到MS 培養(yǎng)基（不含激素）中，各處理鱗芽50 個(gè)，重復(fù)3次，10 d后觀察統(tǒng)計(jì)。

1.2.2 葉片、葉柄的處理 使用牡丹的葉片及葉柄為外植體，以0.1%HgCl2為消毒劑，分別設(shè)置3個(gè)不同消毒時(shí)間處理，研究不同消毒時(shí)間下0.1%HgCl2對(duì)外植體的影響。葉片分別消毒處理1 min、3 min、5 min；葉柄分別消毒處理3 min、5 min、7 min。消毒后的葉片及葉柄切段，接種到MS 培養(yǎng)基（不含激素）中，各處理外植體50 個(gè)，重復(fù)3 次，15 d 后觀察統(tǒng)計(jì)。

1.2.3 指標(biāo)計(jì)算 使用Office Excel 2011、SPSS 3.0 對(duì)存活率、污染率、死亡率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

存活率=存活數(shù)/接種數(shù)×100%

污染率=污染數(shù)/接種數(shù)×100%

死亡率=死亡數(shù)/接種數(shù)×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒劑不同消毒時(shí)間對(duì)鱗芽外植體的消毒效果

從表1可知，70%酒精對(duì)鱗芽外植體消毒處理時(shí)間為8 min、10 min、12 min 時(shí)，污染率均較高，分別為13.6%、10.0%、11.7%，總體呈下降趨勢(shì)；隨著消毒處理時(shí)間增加，存活率呈上升趨勢(shì)，消毒處理時(shí)間為12 min時(shí)，存活率最高，為80.3%；隨著消毒處理時(shí)間增加，死亡率呈下降趨勢(shì)，消毒處理時(shí)間為12 min時(shí)，死亡率最低，為8.0%。

表1 2種消毒劑不同消毒時(shí)間處理鱗芽離體培養(yǎng)的存活率

0.1%HgCl2對(duì)鱗芽外植體消毒處理時(shí)間為8 min 時(shí)，污染率最低，為3.3%，存活率最高，為89.1%，死亡率最低，為7.6%；消毒處理時(shí)間為5 min 時(shí)，污染率較低，為3.5%，存活率次之，為68.7%，死亡率較高，為27.8%；消毒處理時(shí)間為12 min 時(shí)，污染率最高，為6.2%，存活率最低，為50.6%，死亡率最高，為43.2%。

試驗(yàn)表明，不同消毒劑種類的消毒效果不同，且同一消毒劑、不同消毒處理時(shí)間的消毒效果存在差異，消毒劑種類、消毒時(shí)間均會(huì)影響鱗芽的生長(zhǎng)。使用0.1%HgCl2對(duì)鱗芽消毒處理效果最佳，最佳消毒處理時(shí)間為8 min，此時(shí)污染率和死亡率均最低，分別為3.3%、7.6%，存活率最高，為89.1%。

2.2 0.1%HgCl2對(duì)牡丹葉片及葉柄外植體的消毒效果

從表2可知，隨著消毒時(shí)間增加，葉片污染率下降。與其他消毒處理時(shí)間相比，經(jīng)過5 min 的消毒處理，葉片外植體污染率極低，為0%，死亡率最高，為71.8%，存活率最低，為29.2%；經(jīng)過3 min 的消毒處理，污染率較低，為3.9%，存活率最高，為90.1%，死亡率最低，為6.0%；經(jīng)過1 min 的消毒處理，污染率最高，為27.4%，存活率較低，為31.4%，死亡率較高，為41.2%。為保證外植體組織培養(yǎng)快速且有效地繁殖，0.1%HgCl2對(duì)葉片消毒處理3 min的消毒效果最佳。

表2 0.1%HgCl2不同消毒時(shí)間牡丹葉片及葉柄的的存活率

隨著消毒處理時(shí)間增加，葉柄污染率呈下降趨勢(shì)，經(jīng)過5 min 的消毒處理，污染率較低，為4.5%，存活率最高，為82.1%，死亡率最低，為13.4%；經(jīng)過7 min 的消毒處理，污染率最低，為3.3%，存活率較高，為75.6%，死亡率較低，為21.1%；經(jīng)過3 min 的消毒處理，污染率最高，為6.1%，存活率最低，為68.3%，死亡率最高，為25.6%；為保證外植體的組織培養(yǎng)快速且有效繁殖，0.1%HgCl2對(duì)葉柄消毒處理5 min時(shí)的消毒效果最佳。

試驗(yàn)表明，同一消毒劑、不同消毒時(shí)間對(duì)外植體的消毒效果存在差異。使用0.1%HgCl2對(duì)葉片、葉柄的最佳消毒時(shí)間分別為3 min、5 min，此時(shí)葉片、葉柄污染率較低，分別為3.9%、4.5%，存活率最高，分別為90.1%、82.1%，死亡率最低，分別為6.0%、13.4%。

3 討論與結(jié)論

目前，植物組織培養(yǎng)常用的消毒藥品有0.5%～10%NaClO、酒精和HgCl2等。在牡丹離體組織培養(yǎng)快速繁殖的大量生產(chǎn)實(shí)踐中，使用最多的外植體是鱗芽，同時(shí)也是最容易攜帶內(nèi)生菌的組織，其污染率較高。在組織培養(yǎng)過程中，外植體預(yù)處理方法、消毒劑種類、消毒時(shí)間以及操作環(huán)境等因素均對(duì)組織培養(yǎng)產(chǎn)生較大影響。因此，外植體培養(yǎng)之前消毒是控制污染的重要手段之一。牡丹組織培養(yǎng)污染源主要有3個(gè)，一是外植體本身攜帶污染菌；二是在組織培養(yǎng)過程中消毒不徹底，如操作臺(tái)、器具等；三是培養(yǎng)基滅菌不徹底。在牡丹的組織培養(yǎng)過程中，對(duì)外植體進(jìn)行消毒是必須的。不同消毒劑種類的消毒效果不同，且同一消毒劑、不同消毒處理時(shí)間的消毒效果存在差異，消毒劑種類、消毒時(shí)間均會(huì)影響鱗芽的生長(zhǎng)。因此，消毒劑的種類、消毒時(shí)間也是必須要考慮的因素。對(duì)于組織培養(yǎng)使用的消毒劑，既需要有較好的消毒效果，又不能損傷組織材料，同時(shí)還易洗凈，避免影響后續(xù)外植體的生長(zhǎng)與發(fā)育。因此，消毒劑的選用、適宜的消毒劑濃度及處理時(shí)間尤為重要。

試驗(yàn)表明，0.1%HgCl2較酒精適用于鱗芽的消毒，且最佳消毒時(shí)間為8 min，此時(shí)存活率最高，為89.1%，污染率和死亡率均最低，分別為3.3%、7.6%；0.1%HgCl2對(duì)葉片、葉柄消毒處理最佳時(shí)間分別為3 min、5 min，污染率分別為3.9%、4.5%，存活率分別為90.1%、82.1%，死亡率分別為6.0%、13.4%。