Janus石墨烯量子點在生物膜中的輸運行為：分子動力學模擬

劉洪超，陳蘇航，段先力，吳凡，徐小飛，宋先雨，趙雙良，劉洪來

（1 重慶三峽學院環境與化學工程學院，三峽 庫區水環境演變與污染防治重慶市重點實驗室，重慶 404020；2 華東理工大學化工學院，化學 工程聯合國家重點實驗室，上海 200237；3 廣西大學化學化工學院，廣西 石化資源加工與過程強化技術重點實驗室，廣西 南寧 530004；4 華東理工大學化學與分子工程學院，化學 工程聯合國家重點實驗室，上海 200237）

引 言

石墨烯量子點（graphene quantum dots, GQDs）是一種同時具有石墨烯和碳量子點特性的零維材料，由單層或多層石墨烯組成，尺寸小于100 nm[1]。因其可調的光致發光特性、獨特的物理化學性質、良好的生物相容性和微納尺寸等特點[2-3]，被廣泛用于生物醫學、化工新材料、能源器件等前沿領域。在生物醫藥領域，石墨烯量子點作為納米載體可以將藥物定點遞送至腫瘤細胞，進而實現靶向治療。在此過程中，跨膜輸運是實現藥物遞送的重要環節，也是提高納米載體靶向輸運效率、減少生物積累、降低細胞毒性的關鍵[4]。

近年來，國內外學者分別從納米材料的尺寸、形狀、化學組成、親/疏水性等方面，探索了石墨烯量子點物理化學性質對跨膜輸運行為的影響[4-6]。其中，在石墨烯量子點與細胞膜相互作用機制研究方面，岳華等[7]綜述了納米石墨烯與細胞膜間的生物刺激響應機制，枚舉了不同結構的納米石墨烯在細胞膜表面發生的多種復雜內化形式，包括水平摩擦式、豎直嵌入式、三明治超級組裝、選擇性胞吞、胞內限域折疊等。周夢迪等[8]綜述了近年來石墨烯與細胞膜、蛋白質和DNA 等生物大分子相互作用的研究進展，為石墨烯的生物醫藥應用及安全性評價提供了重要參考。目前，調控石墨烯量子點的物理化學性質已成為研究熱點，其核心在于強化界面處的分子傳遞、能量轉化機制[9]。在跨膜輸運過程中，石墨烯量子點與細胞膜及其周圍特異性環境接觸，形成異質性空間分布，即構成“納米-生物”微界面，通過界面處的動態物理化學作用以及能量交換實現跨膜輸運[10]。因此，認識和理解由石墨烯量子點構成的“納米-生物”微界面熱力學行為至關重要[11]。目前，對“納米-生物”微界面開展的研究初步表明，微界面處的各種分子會產生不同形式的能量和分子間作用（包括靜電作用、范德華作用、溶劑化作用等），進而主導著整個跨膜輸運過程[12]。

分子模擬技術在研究非平衡態界面熱力學方面發揮了關鍵作用[13-14]，它不僅能從分子尺度詮釋實驗結果，還能為微納界面處的各種物理化學過程提供新的見解[15-18]，已被廣泛用于納米載體與細胞膜相互作用機制研究[8,19-20]。例如，Shen 等采用全原子分子動力學報道了石墨烯量子點跨膜輸運行為，發現石墨烯量子點的尺寸越大跨膜輸運能壘越高[21]；較小尺寸的石墨烯量子點作為納米載體可以顯著降低阿霉素、脫氧腺苷藥物的跨膜輸運能壘[22]。Li 等[6]利用耗散粒子動力學模擬研究了錐形石墨烯跨膜輸運行為，發現尖端形狀、尺寸和表面疏水特性都會影響其跨膜能壘，而石墨烯的彎曲剛度對其滲透過程的影響卻很小。最新研究發現增加石墨烯的氧化程度有助于提高其藥物輸送效率，降低細胞毒性[5,19,23]。與氧化官能團均勻分布的傳統石墨烯不同，Janus石墨烯量子點在石墨烯片兩端呈現空間不對稱結構及表面化學性質，類似于表面活性劑的結構特性[24]。因此，Janus 石墨烯量子點跨膜輸運行為同時受到氧化位點空間異質分布、氧化程度（親水-親油平衡）共同影響，進而可能誘導產生特殊的跨膜輸運行為。盡管氧化官能團的空間異質分布對其跨膜輸運有較大影響，但這方面的研究較少。

從熱力學角度分析Janus 石墨烯量子點空間異質分布及氧化程度對跨膜輸運的影響，有助于總結其跨膜輸運規律，闡明相關構-效關系，指導結構設計。本文從空間異質結構設計出發，構建了一系列不同氧化程度與空間異質分布的Janus 石墨烯量子點，并利用全原子拉伸分子動力學（steered molecular dynamics，SMD）模擬研究了其跨膜輸運過程中的能量特征，重點考察Janus 石墨烯量子點親水-親油平衡、外力牽引對其跨膜輸運行為的影響規律，為Janus 石墨烯量子點的設計及生物醫藥應用提供指導。

1 分子動力學模擬

1.1 分子模型與力場

本文以二棕櫚酰磷脂酰膽堿（dipalmitoylphosphatidylcholine，DPPC）為細胞膜磷脂雙分子層主要成分，利用Packmol 軟件構建雙層細胞膜結構，膜厚度約4.5 nm。為構建不同氧化程度與空間分布的Janus石墨烯量子點，本文采用東京大學開發的網頁版PolyParGen 力場工具（http://polypargen.com/）構建相關分子結構及力場參數。該工具能為聚合物或大分子提供OPLS-aa 和Amber 力場參數，包括分子動力學模擬需要的非鍵相互作用參數、鍵合相互作用參數。本文采用OPLS-aa 力場描述分子間相互作用，其中，非鍵相互作用由Lennard-Jones 12-6勢函數及庫侖作用勢函數加和得到，計算方程如下：

式中，σij、εij為原子間的Lennard-Jones 勢函數參數，不同原子間的Lennard-Jones 參數依據Lorentz-Berthelot 混合規則計算可得；rij為原子間的距離，nm；qi、qj分別為i原子、j原子所帶電荷，C；ε0為介電常數，F/m。此外，一般分子內1，4 交互作用系數fij為0.5，其他均取為1.0[25]。

鍵合相互作用參數分別由鍵長、鍵角、扭轉角勢能項構成，計算公式分別如下：

式中，Kr、Kθ、Vn分別為鍵長、鍵角、扭轉角勢能項中的系數；req為平衡時鍵長距離，nm；θeq為平衡時鍵角，(°)；φn為扭轉角多項式的平衡角度，(°)。

本文采用PolyParGen 力場工具為DPPC 分子及Janus石墨烯量子點構建的相關OPLS-aa力場參數。該工具已廣泛應用于各種有機物的物理化學、熱力學性質計算，其結果與實驗結果良好吻合[26-29]。溶劑水分子設置為擴展簡單點電荷SPC/E 模型[30]。圖1 為構建的模擬系統和不同空間異質分布、不同氧化程度的Janus 石墨烯量子點結構示意圖。如圖1（a）所示，細胞膜由312 個DPPC 分子構成，添加近5.3×104個溶劑分子，進而組成尺寸為10.0 nm×10.0 nm×20.0 nm 的模擬系統。在初始構型中，溶劑密度接近1.0 g/cm3，Janus 石墨烯量子點以親水端垂直放置于細胞膜表面0.5 nm處。事實上，Janus石墨烯量子點的制備與運用已被報道。例如，Zhang等[24]結合插層氧化和強超聲剝離技術制備了一系列Janus 石墨烯量子點，其結構表征如圖1（b）所示[24]。為模仿該結構，同時也為探究氧化官能團空間異質分布對跨膜輸運的影響，本文分別構建三角形、方形空間異質分布的Janus 石墨烯量子點，如圖1（c）、（d）所示。構建的Janus 石墨烯量子點的尺寸為2.0 nm×4.6 nm，具體的Janus 石墨烯量子點氧化特性參數如表1 所示，氧化程度為7.213%～15.29%。本文石墨烯氧化程度定義為：NO/（NC+NO），其中，NO為氧原子數目，NC為碳原子數目。構建的氧化石墨烯C∶O約為2.88，高于實驗制備的1.4～2.2[31]，這主要因為Janus 石墨烯量子點一端未被氧化造成的。此外，氧化官能團中的羥基（R—OH）、羧基（R—COOH）、環氧基（R—O—R′）官能團比例為1.0∶0.86∶1.0～1.0∶1.75∶1.0，接近實驗制備的1.05∶0.9∶1.0～1.0∶1.2∶0.96[31-32]，其中羧基比例較實驗結果高，這主要是由于氧化官能團異質分布導致的邊際碳原子比例增加造成的。

表1 Janus石墨烯量子點氧化特性參數Table 1 Oxidation characteristics of Janus graphene quantum dots

圖1 模擬系統示意圖及模擬與實驗的Janus石墨烯量子點結構比較(圖1(b)經文獻[24]復制許可，版權所有為2020 Elsevier Ltd.)Fig.1 Schematics of mimicked system and structure comparison of Janus graphene quantum dots derived from simulation and experiment(Fig.1(b)is reproduced with permission from Ref.[24],copyright 2020 Elsevier Ltd.)

1.2 模擬細節

在進行分子動力學模擬之前，系統先通過最速下降法降低體系總能量，使得系統松弛。當體系勢能小于1000.0 kJ/(mol·nm)時結束計算，以避免初始構型因原子重疊而造成的局部能量過高，提高體系的穩定性；進而在NVT（constant-temperature,constant-volume）系綜條件下進行0.05 ns 分子動力學模擬，最后在NPT（constant-temperature,constantpressure）系綜條件下執行200.0 ns 動力學平衡計算。該計算過程采用Berendsen溫度耦合算法控溫，溫度保持在300 K，采用Parrinello-Rahman 壓力耦合算法控壓，耦合類型為Semi-isotropic，壓力耦合時間常數為2.0 ps，且系統壓力保持在1.0 bar（1 bar=105Pa）[30]。所有鍵長采用LINCS 算法約束，長程靜電相互作用采用PME 算法，截斷半徑為12.5 ?(1?=0.1 nm)[33]。采用周期性邊界條件，計算步長設置為2.0 fs，每100.0 ps輸出一幀結果文件，用于計算系統的各種能量和結構變化。動力學模擬由高性能分子模擬計算軟件包Gromacs 2019.6 執行完成，計算任務在配備為256 GB 內存的雙路Intel(R)Xeon(R)Gold 6130 CPU@2.10GHz 多節點計算平臺運行，為加速動力學計算，長程靜電相互作用部分采用CPU 計算，Lennard-Jones 及鍵合作用部分采用NVIDIA GeForce RTX 3090 加速顯卡計算。計算得到的模擬結果利用Visual Molecular Dynamics（VMD）可視化軟件作圖，動力學軌跡性質分析由Gromacs 軟件后處理工具和實驗室編寫腳本完成。本文計算的分子間范德華、靜電相互能量曲線是基于Gromacs軟件中的rerun與energy命令實現的。首先提取兩組分軌跡文件，再使用rerun命令重新計算軌跡，最后使用energy 命令計算該軌跡產生的各個能量項。

2 結果與討論

2.1 外力依賴的跨膜行為

為加快Janus 石墨烯量子點跨膜輸運過程，采用拉伸分子動力學模擬[20]探究不同拉伸強度條件下Janus 石墨烯量子點跨膜輸運行為。使用彈簧勢線性恒力拉動量子點的質心向細胞膜逐漸靠近，拉伸強度為200.0～1600.0 kJ/(mol·nm)。其中，拉伸強度為800.0 kJ/(mol·nm)時，中等氧化強度(12.27%)的Janus 石墨烯量子點跨膜輸運路徑俯視圖如圖2（a）所示。可以觀察到，在初始階段，為了避免高的跨膜能壘，Janus石墨烯量子點首先利用其親水頭部選擇性地吸附在細胞膜表面。在隨后的50.0 ns 內，拖拽自身疏水尾部滲透至細胞膜內。隨著模擬的時間增加，在200.0 ns 時，觀測到穩定的跨膜內化構型，其中親水頭部朝向溶劑，而疏水尾部嵌入至細胞膜內。Janus石墨烯量子點與報道的石墨烯、氧化石墨烯量子點的跨膜輸運行為有較大差異。例如，Li 等[4]基于分子模擬與實驗結果，觀測到疏水的石墨烯刺穿滲透至細胞膜是由石墨烯材料的不規則邊緣或凹凸結構誘導發生的。而對于傳統的氧化石墨烯量子點，Dallavalle等[23]發現，氧化官能團隨機分布在石墨烯表面有利于其實現縱向跨膜。本文觀測到的Janus 石墨烯量子點跨膜輸運是由其氧化的親水頭部與疏水尾部協同完成的。

圖2 不同外力條件下Janus石墨烯量子點的生物膜內化過程Fig.2 Membrane internalization of Janus graphene quantum dots under different external forces

為了探究不同拉伸強度條件下的Janus石墨烯量子點跨膜輸運行為，圖2（b）給出了Janus石墨烯量子點與細胞膜質心距離隨時間演化曲線。Janus石墨烯量子點呈現特殊的外力依賴性跨膜行為：當拉伸強度小于600.0 kJ/(mol·nm)時，質心距離曲線有所下降但不明顯，Janus石墨烯量子點并沒有成功嵌入細胞膜中；當拉伸強度大于800.0 kJ/(mol·nm)，質心距離曲線在5.0 ns的初始階段迅速下降，進而逐漸呈現動態平衡，最終Janus石墨烯量子點成功嵌入細胞膜中。此外，為了分析動力學過程的分子熱力學變化規律，還記錄了Janus石墨烯量子點與細胞膜間的能量變化曲線。圖2（c）為分子間范德華作用能量曲線，該曲線下降趨勢與質心距離曲線呈現相同的外力依賴性變化規律，當拉伸強度大于800.0 kJ/(mol·nm)時，分子間范德華作用能量曲線顯著下降，進而避免了高的跨膜能壘。圖2（d）為分子間的靜電相互作用能量曲線，與范德華作用能量曲線相比，靜電相互作用能量曲線并沒有呈現明顯的外力依賴性變化。當拉伸強度為200.0 kJ/(mol·nm)時，范德華作用能量呈現最低的狀態，而拉伸強度大于200.0 kJ/(mol·nm)時，范德華作用能量下降卻不明顯。這主要是由于在不同拉伸強度條件下Janus 石墨烯量子點在細胞膜表面發生著不同吸附形式，進而誘導不同的跨膜輸運行為造成的，結果如圖3 所示。在低的拉伸強度條件下[≤200.0 kJ/(mol·nm)]，Janus 石墨烯量子點在細胞膜表面呈現平躺式吸附構型，如圖3（a）所示。而當拉伸強度增加[如為1200.0 kJ/(mol·nm)]，Janus 石墨烯量子點嵌入細胞并呈現縱向攝入狀態，如圖3（b）所示。此外，平躺式吸附、縱向攝入均會造成細胞膜呈現異質性結構分布，進而誘導不同程度的細胞毒性。

圖3 Janus石墨烯量子點在生物膜中的結構表征Fig.3 Structural characterizations of Janus graphene quantum dots in biomembrane

2.2 親水-親油平衡調控跨膜行為

圖2 觀測到Janus 石墨烯量子點的跨膜輸運是由其親水頭部與疏水尾部協同控制的，對此進一步探究不同氧化程度對Janus 石墨烯量子點跨膜輸運的影響。拉伸強度為600.0 kJ/(mol·nm)時，不同氧化程度下的Janus石墨烯量子點跨膜輸運結果如圖4所示。盡管拉伸強度由原來的800.0 kJ/(mol·nm)降至600.0 kJ/(mol·nm)，仍能觀察到不同的細胞膜攝取過程。圖4（a）表明，隨著氧化程度的增加，Janus 石墨烯量子點進入細胞膜需要的動力學時間也逐漸增加。傳統的氧化石墨烯氧化程度高，跨膜能壘也高，因此未觀測到傳統的氧化石墨烯成功嵌入細胞膜中。在熱力學分析方面，圖4（b）、（c）表明，隨著氧化程度的增加，分子間范德華相互作用能量也增加，而分子間靜電相互作用能量降低。這是因為隨著氧化程度的增加，Janus 石墨烯量子點的疏水比表面面積降低、親水特性增加，進而導致各項能量變化。比較分子間范德華、靜電相互作用能量可以發現，分子間范德華相互作用能量始終低于靜電相互作用能量，即Janus 石墨烯量子點的跨膜驅動力主要來源于Janus 石墨烯量子點及磷脂雙分子層尾部的疏水締合作用。對于氧化石墨烯，盡管分子間范德華相互作用能量較Janus 石墨烯量子點高，但分子間靜電相互作用能量卻很低，這與其在細胞膜表面的吸附形態有關。如圖4（d）所示，Janus 石墨烯量子點都成功實現跨膜輸運，而氧化石墨烯平躺式吸附在細胞膜表面。特別地，可以觀測到磷脂雙分子層表面的極性部分通過靜電相互作用牢牢地使氧化石墨烯表面的氧化官能團粘黏在細胞膜表面。此外，分析圖4（d）可以發現，Janus 石墨烯量子點以親水頭部朝向溶劑，疏水尾部縱向嵌入細胞膜內部而被細胞膜攝取。因此可以推斷，石墨烯的親水部分可以強化其在細胞膜表面的粘黏，而疏水部分可以降低跨膜能壘增進細胞膜攝取。

圖4 不同氧化程度的方形異質氧化Janus石墨烯量子點的生物膜內化過程Fig.4 Membrane internalization of heterogeneously square-shaped oxidized Janus graphene quantum dots with various oxidation degrees

2.3 異質空間分布對跨膜輸運的影響

進一步對比三角形、方形異質氧化空間分布對Janus 石墨烯量子點的跨膜輸運行為的影響。在施加拉伸強度為600.0 kJ/(mol·nm)條件下，三角形異質氧化的Janus 石墨烯量子點跨膜輸運結果如圖5所示。如圖5（a）所示，中等氧化程度（12.27%）的Janus 石墨烯量子點需要近190.0 ns 的動力學時間才能成功遷移至細胞膜表面與其粘黏；但只有氧化程度高的Janus 石墨烯量子點才能成功被細胞膜攝取。如圖5（b）、（c）所示，氧化程度低的Janus 石墨烯量子點在細胞膜表面發生吸附，并觀測到分子間范德華相互作用能量較高，而分子間靜電相互作用能量較低。雖然氧化程度高的Janus 石墨烯量子點成功嵌入細胞膜中，三角形異質氧化分布導致的能量曲線卻高于方形異質氧化分布。這是因為Janus石墨烯量子點在細胞膜內的嵌入路徑差異導致的，如圖5（d）所示。三角形異質氧化分布使得Janus 石墨烯量子點與細胞膜形成較長的接觸線，進而增加了Janus 石墨烯量子點的溶劑可及面積[圖5（e）]，高的溶劑化效應額外增加了跨膜能壘。與圖2 相比，降低拉伸強度后，三角形異質氧化的Janus 石墨烯量子點由于高的能壘很難實現跨膜。重要的是，對于三角形異質氧化分布的Janus 石墨烯量子點，低的氧化程度有利于細胞膜對其成功攝取，而較高氧化程度的Janus 石墨烯量子點卻呈現半跨膜狀態。與方形異質氧化分布的Janus 石墨烯量子點相比，三角形異質氧化分布更能降低跨膜輸運能壘。

圖5 不同外力條件下三角形異質氧化Janus石墨烯量子點的生物膜內化過程Fig.5 Membrane internalization of heterogeneously triangle-shaped oxidized Janus graphene quantum dots under different external forces

3 結 論

從空間異質結構設計出發，構建了一系列不同氧化程度與空間異質分布的Janus 石墨烯量子點，采用拉伸分子動力學模擬研究了Janus 石墨烯量子點跨膜輸運行為。結果表明Janus 石墨烯量子點跨膜輸運是由其氧化的親水頭部與疏水尾部協同決定的，Janus石墨烯量子點首先利用其極性親水頭部通過靜電相互作用吸附在細胞膜表面，進而借助于疏水尾部與磷脂雙分子尾鏈間的疏水締合作用實現跨膜輸運。由于溶劑化效應，氧化程度的增加會增高其跨膜能壘，與三角形異質氧化分布相比，方形異質氧化分布的Janus 石墨烯量子點可以降低溶劑化效應，更容易被細胞膜攝取。