植物天然產物氧化與微生物制造

張昕哲，孫文濤，呂波，李春，

（1 北京理工大學化學與化工學院生物化工研究所，北京 100081； 2 清華大學化學工程系生物化工研究所/工業生物催化教育部重點實驗室，北京 100084）

引 言

植物天然產物主要包括萜類、黃酮類、醌類、生物堿類等物質，具有豐富的生理藥理活性[1-2]。在生成植物天然產物的過程中，氧化反應占重要地位，一般來說，氧化反應引入的羥基、環氧等官能團是天然產物后續進行糖基化、酰基化等許多其他修飾反應的前提，也是某些植物天然產物起關鍵藥理活性的關鍵基團。如齊墩果烷型的三萜類物質β-香樹脂醇，植物中的氧化酶可以在其28號碳位進行氧化生成抗菌藥物齊墩果酸[3]，也可以在11 號位和30 號位分別進行羰基化和羧基化，生成具有消炎和保護肝臟作用的甘草次酸[4]，并可以通過后續的糖基化生成比蔗糖甜度高1000 倍的甜味劑單葡萄糖醛酸基甘草次酸和水溶性高于甘草次酸的甘草酸[5]；黃酮類物質柚皮素碳骨架不同部位的氧化，可以生成圣草酚、花旗松素等具有不同藥理活性的黃酮類物質[6]。此外，一些植物天然產物的氧化，還可以有效降低其細胞毒性。例如，來自喜樹的具有抗癌活性但具有較高細胞毒性的生物堿類化合物喜樹堿，在其10位進行羥化后得到10-羥基喜樹堿，在提高抗癌活性的同時成功降低了喜樹堿對細胞的毒性[7]，成為目前廣泛使用的一種抗癌藥。

植物天然產物的氧化反應大多是通過生物體內的氧化酶催化進行的。氧化酶的種類豐富多樣，包括黃素依賴的氧化酶、酪氨酸酶、漆酶、P450 酶等[8-10]。為實現氧化反應的進行，氧化酶大多需要輔基參與，如黃素、金屬離子、血紅素等，這些輔基參與電子、質子等物質的傳遞。此外，在氧化反應發生過程中需要質子與電子供體。參與氧化反應的電子來源較為多樣，可來源于輔酶、輔基或底物本身[11]。參與催化氧化的輔因子成本往往較為高昂，而生物體中富含氧化反應所需的輔因子，因此目前合成生物學領域利用氧化酶催化氧化反應常以生物體作為依托進行[12]。

合成生物學為微生物利用氧化酶催化植物天然產物氧化提供了有效方法[13]。將植物天然產物合成途徑包括氧化酶轉入微生物體內，可實現植物天然產物的合成。由于植物生長較慢需要長時間占用耕地，并且植物天然產物往往結構復雜，所以相比于傳統獲取植物天然產物的植物提取法和化學全合成法，微生物酶催化合成植物天然產物具有高效性、高立體選擇性和高區域選擇性的優勢[14]。

由于氧化反應對生產植物天然產物的重要性，本文首先將介紹具有代表性的萜類、生物堿、黃酮等植物天然產物的氧化。按照氧化酶中所含輔基的差異，分類介紹催化植物天然產物發生氧化作用的氧化酶，并介紹不同輔基催化氧化反應進行的反應機理。此外，本文還將介紹目前在合成生物學領域氧化酶在萜類、生物堿、黃酮等植物天然產物合成中的應用和促進氧化酶高效行使氧化功能的方法。最后，對未來氧化酶在微生物合成植物天然產物領域的前景進行展望。

1 植物天然產物形成中的氧化反應

按照化學結構，植物天然產物主要分為萜類、甾體、糖苷、黃酮、生物堿、醌類。本節著重對萜、黃酮和生物堿類化合物碳骨架的氧化作舉例說明。

1.1 萜烯化合物骨架的氧化

萜烯物質是目前在生物體中合成途徑較清晰且廣受關注的一類重要天然化合物。天然的萜烯物質主要由甲羥戊酸途徑(MVA)和2-甲基-D-赤蘚醇-4-磷酸途徑(MEP)生成的五碳單元進一步反應生成[15-16]。

在萜類物質碳骨架的氧化反應中，引入的含氧官能團主要有羥基、羰基和羧基等。氧化是生成萜類物質的重要反應，如單萜物質檸檬烯經過一步氧化形成薄荷烯醇和香芹醇，進一步將其羥基氧化分別形成薄荷烯酮和香芹酮[17]；在倍半萜物質青蒿酸的合成過程中，紫穗槐-4, 11-二烯的C-12 需經過第一步氧化反應生成青蒿醇，隨后經過第二步氧化反應生成青蒿酮，并經過最后一步氧化反應生成青蒿酸[18]；二萜物質松香二烯經過生成醇、醛、酸的三步連續氧化反應，最終生成松香酸[19]。

三萜物質的碳骨架更加復雜，按照碳骨架的區別可將三萜物質細分為齊墩果烷型、烏蘇烷型、羽扇豆烷型等。值得注意的是，這些環狀三萜都是以角鯊烯為起始物，經過角鯊烯環氧化酶的環氧化作用形成2,3-環氧角鯊烯，再被環化酶環化而形成，2,3-環氧角鯊烯中的2,3-環氧基團最終形成環狀三萜C-3 的羥基。齊墩果烷型三萜的代表性物質β-香樹脂醇C-28可依次進行羥基化、醛基化、羧基化，最終形成具有消炎作用的齊墩果酸[3]；除此之外，β-香樹脂醇的C-11 經歷羥基化、羰基化后生成11-羰基-β-香樹脂醇，隨后在其C-30 發生羥基化、醛基化以及羧基化，最終生成具有保護肝臟作用的甘草次酸[5]；烏蘇烷型的三萜物質α-香樹脂醇，在其C-28 先后發生羥基化、醛基化以及羧基化后，生成具有抗癌作用的熊果酸[20]；羽扇豆烷型的三萜物質羽扇豆醇，經過C-28的三步連續氧化后生成具有顯著抗癌功效的白樺脂酸[21]。萜類物質的氧化不僅提高了萜類物質的水溶性使之更容易在生物體中進行代謝和轉運，同時也為后續的糖基化、酰基化修飾提供了條件，例如甘草次酸在C-3 羥基的基礎上進行糖基化修飾生成單葡萄糖醛酸基甘草次酸、甘草酸[22]等。

具有代表性的萜類物質氧化過程如圖1所示。

圖1 具有代表性的萜類物質氧化過程Fig.1 Oxidation process of representative terpenes

1.2 黃酮類化合物骨架的氧化

黃酮化合物廣泛存在于自然界中，莽草酸途徑是其主要的生物合成途徑[23]。黃酮類物質的基本母核是2-苯基色原酮。按照結構來劃分，黃酮類天然產物主要包含黃酮、異黃酮和查爾酮等。目前，生成黃酮和異黃酮類化合物的氧化反應報道較多。

2-苯基色原酮母核氧化會產生豐富的黃酮類物質。例如，在2-苯基色原酮的5,7,4′位羥化得到芹菜素，繼續在3′位發生氧化生成具有抑制癌細胞增殖作用的木犀草素[24]；或在芹菜素的基礎上在3 號碳位繼續發生氧化生成具有抗癌、抗癲癇、抗炎作用的山奈酚，進一步在3′位發生氧化生成低毒性、抗氧化、抗腫瘤的槲皮素[25]；在5,7-二羥基黃酮基礎上，6 號碳位進行氧化生成能夠治療心腦血管疾病的黃芩素；以二氫黃酮代表性物質柚皮素為骨架，在3,5′進行氧化可生成有清除自由基作用的二氫槲皮素[26]。異黃酮類物質，具有抗氧化作用的大豆素，需要在異黃酮母核的7,4′發生羥基化；若繼續在大豆素的基礎上進行C-6 羥化以及轉甲基化，生成能夠改善人體糖、脂代謝的鳶尾素。根皮素需要在異查爾酮母核2′,4′,6′,4 位發生羥基化并還原中央三碳原子的不飽和雙鍵[27]。

黃酮化合物碳骨架氧化引入的羥基也為后續的糖基化、甲基化等反應提供了條件。如在槲皮素的C-3羥基引入葡萄糖基和鼠李糖基可生成具有抗炎、抗氧化、抗過敏、抗病毒等功效的蘆丁；在鳶尾素C-7 羥基引入葡萄糖基可獲得水溶性更好、生物利用度更高的鳶尾苷；在根皮素C-6′羥基引入葡萄糖基后獲得能有效治療糖尿病的根皮苷[28]。

具有代表性的黃酮物質骨架的氧化如圖2所示。

圖2 具有代表性的黃酮物質骨架的氧化Fig.2 Oxidation process of representative flavonoids

1.3 生物堿類化合物骨架的氧化

生物堿是一類分布廣泛的天然化合物，現指存在于生物體中的含氮環狀化合物。此類化合物因普遍含有負氧化態的氮原子而往往呈堿性。由于結構的多樣性，生物堿在生物體中具有更加復雜多樣的合成途徑[29]。

生物堿的氧化賦予其豐富的藥效。例如來自顛茄的托品烷類莨菪堿，在其托品烷的C-6、C-7 發生環氧化反應會形成東莨菪堿；若只在莨菪堿C-7發生羥基化反應則形成山莨菪堿，東莨菪堿和山莨菪堿均可起到胃腸道解痙、抑制唾液分泌、鎮靜和擴瞳的作用；若在阿托品的α碳發生羥基化則生成樟柳堿，具有抗震顫、解痙、平喘、散瞳、抑制唾液分泌及解毒的功能。喹諾里西啶類生物堿苦參堿，在其N-1發生氧化形成氧化苦參堿，相比于苦參堿，氧化苦參堿具有更好的抗乙肝病毒的作用。來自藍果樹科植物喜樹的喜樹堿是一種被廣泛用于治療胃腸道癌的喹啉類生物堿，在起到抑癌活性的同時也會引起高度毒性的藥物不良反應，在其10號碳位發生氧化引入羥基可以有效地減輕這種副作用，同時提升其抑癌功效[7]。苯菲啶類生物堿二氫血根堿和二氫白屈菜紅堿，在其氮雜環氧化脫氫會分別生成血根堿和白屈菜紅堿，均具有抗真菌增殖的功能。

生物堿碳骨架的氧化會為后續的生物堿修飾提供更多契機。如阿撲嗎啡C-11 發生羥化后進而轉移甲基生成木蘭堿；C-9 羥化后向C-9 羥基轉移甲基生成氧化海罌粟堿。

具有代表性的生物堿骨架與其氧化產物如圖3所示。

圖3 具有代表性的生物堿骨架與其氧化產物Fig.3 Oxidation process of representative alkaloids

2 氧化酶的種類及其催化機理

植物天然產物骨架的氧化，離不開生物體中結構和功能多樣的氧化酶。氧化酶包括黃素依賴的單加氧酶、單胺氧化酶、過氧化物酶、P450 酶等種類，因為氧化酶在行使氧化作用的同時涉及氧氣、電子以及質子的傳遞，因此往往需要輔酶和輔基等輔因子的參與。同種輔基催化氧化反應機理相似，因此本節按照氧化酶中所含輔基的種類對其進行分類，并對氧化反應的催化機理進行闡釋。

2.1 輔因子為黃素的氧化酶

輔因子為黃素的黃素依賴型單加氧酶（FMOs）可參與氧化結構復雜的天然產物[11]，這些反應源于其催化中心黃素異咯嗪環體系多樣的化學特性[30-31]。除此之外，蛋白質在調節黃素輔因子的催化潛力方面也起著重要作用，因為游離黃素本身并不能執行這些反應[32-33]。了解和預測黃素輔因子活性如何受到蛋白質環境的調節仍然是一個熱門的研究話題[32]。

目前已經用實驗和計算相結合的方法研究了FMOs 的黃素動力學、反應物種的形成和穩定以及FMOs 的羥基化機理（圖4）：首先，處于還原狀態下的黃素被氧氣激活，并將一個電子從還原的黃素轉移到氧中，在黃素半醌和超氧陰離子之間形成籠狀自由基對，隨后超氧陰離子與黃素結合，并伴隨著質子的傳遞，形成黃素C4a-(氫)氧加合物[34]；根據中間體質子化狀態不同，這種過氧基團與底物反應使氧-氧鍵斷裂，同時異咯嗪遠端的氧插入底物的C—H鍵，而另一個黃素近端的氧原子被還原為水，有研究表明異咯嗪C-8 位被親電取代基取代會加速氧-氧鍵斷裂[35]，且目前已經利用羥基鄰位具有高電負性的對羥基苯甲酸進行了實驗和理論計算，證明底物中若有高電負性區域的碳會更容易進攻C4a-(氫)氧加合物（過氧黃素）的氧-氧鍵，從而實現底物中此碳位的羥基化[36-37]；隨后黃素形成氧化狀態的黃素，需要NADPH 等輔因子提供的還原力以及質子將氧化態的黃素還原為還原狀態下的黃素，催化下一輪氧化反應[38]，

圖4 黃素單加氧酶催化氧化機理Fig.4 Mechanism of flavin-dependent monooxygenase catalytic oxidation

黃素依賴型單加氧酶基于其結構特征、氨基酸序列、電子供體和氧化反應類型進行分類[9]。目前已報道的具有代表性的黃素單加氧酶共有八類[11]，其依賴的輔因子、電子供體以及催化的反應各不相同。表1對黃素依賴的單加氧酶分類進行了概述。

表1 黃素依賴的單加氧酶主要類別［11］Table 1 Main classes of flavin-dependent monooxygenases［11］

作為一種具有代表性的黃素依賴的氧化酶，依賴FAD 的單胺氧化酶(MAOs)因具有高選擇性和活性，以及酶促合成所固有的環境優勢，廣受生物催化方面的關注和報道[56]。MAOs 以氧氣分子為氧化劑，將胺氧化脫氫形成亞胺[57]。配合單胺氧化酶的氧化脫氫作用可以利用后續的化學反應將亞胺進行加成反應，形成伯胺的對映異構體，也可以利用亞胺進行繼續脫氫形成叔胺[58]，因此MAOs 是可以用于氧化多種不同胺并進行手性胺拆分的高性能生物催化劑。

2.2 輔因子為銅離子的氧化酶

一些氧化酶活性中心含金屬離子，這些金屬離子是酶的關鍵輔因子，對整個催化過程起控制作用，這類酶被稱為金屬酶。在氧化酶中，以銅離子為輔因子的氧化酶較為常見，包括銅藍蛋白、酪氨酸酶、漆酶、抗壞血酸氧化酶等。

隸屬于多銅氧化酶家族的銅藍蛋白是一種以銅離子為輔基的氧化酶。銅藍蛋白在發揮催化氧化過程中銅離子中心會接受來自底物提供的電子，隨后進一步將電子傳遞給氧分子，使之還原為水或過氧化氫[59]。另外銅藍蛋白對機體內的苯二胺還能發揮胺氧化酶作用[60]。

具有雙核銅離子結構的多亞基氧化酶酪氨酸酶(Tyr)，對酪氨酸等苯酚類化合物具有催化鄰位氧化的功能。酪氨酸酶的雙核銅離子Cu(A)Cu(B)和與兩銅離子配位的六個組氨酸殘基構成了酪氨酸酶的活性中心。在酪氨酸催化的整個氧化過程中，銅離子、氧分子、酪氨酸三者會形成多種反應中間體與過渡態(圖5)。這些中間體過渡態主要被分為氧化態(Eoxy)、還原態(Emet)、脫氧態(Edeoxy)和失活態(Edeact)四種。

圖5 來自巨型芽孢桿菌的酪氨酸酶及其活性位點組氨酸與銅離子的配位（PDB：3NM8）Fig.5 Tyrosinase from Bacillus megaterium and coordination of its active site histidine with copper ion（PDB：3NM8）

酪氨酸酶催化苯酚類化合物鄰位氧化的整個循環過程如圖6 所示：首先酚羥基氧負離子靠近活性中心并與一個銅離子配位，同時酚羥基鄰位碳靠近與銅離子配位的一個氧；與此同時，Cu(A)配位的一個組氨酸咪唑氮接受由酚羥基解離出質子[10,61-63]從而使Cu(A)與組氨酸解離；Cu(A)和與其配位的過氧橋一起靠近苯酚的鄰位碳原子，利于苯酚鄰位碳原子進攻過氧橋；隨后活性中心的[O—O]鍵斷裂，靠近苯酚鄰位的氧與高電負性的苯酚鄰位結合，使氧與苯酚鄰位成鍵從而形成復合物E；復合物E 再接受兩個質子，與活性中心解離生成鄰苯二酚；鄰苯二酚可以為下一步氧化反應提供電子，自身被進一步氧化為鄰苯二醌，與此同時處于還原態的酪氨酸酶(Met)被還原成脫氧態的酪氨酸酶(Deoxy)；脫氧態的酪氨酸酶在接下來的反應中可以直接與氧分子結合，使氧化態的酪氨酸酶(Oxy)重新生成，催化下一輪的氧化反應的進行。目前酪氨酸酶已被用于生物合成多種化合物，其反應過程的動力學也被廣泛研究[64]。

圖6 酪氨酸酶催化酚類物質氧化機理[61]Fig.6 Mechanism of phenolic oxidation catalyzed by tyrosinase[61]

2.3 含血紅素的氧化酶

過氧化物酶和P450 酶是兩種典型的利用血紅素作為輔基催化氧化反應進行的氧化酶。

過氧化物酶可以催化底物的氧化反應，同時將電子傳遞給過氧化氫，使之還原為水。過氧化物酶可以通過上述過程清除生物體內的過氧化氫以及胺類和酚類化合物，從而減輕它們對細胞造成的毒性。近年來，過氧化物酶在氧化催化中的應用得到了廣泛的綜述[65-67]。

細胞色素P450 酶也是一個含血紅素的蛋白家族，血紅素鐵通過軸向保守的半胱氨酸與蛋白質相連[8,68]。P450 在天然產物的生物合成途徑、外源物質的降解、類固醇激素的生物合成和藥物代謝中發揮重要作用。P450 被認為是自然界中用途最廣泛的生物催化劑，參與20 多種不同類型的化學氧化反應[69-71]。

P450 催化系統主要包含底物、P450 酶、起電子傳遞作用的P450 還原酶以及提供還原力的輔因子NAD(P)H 四個部分[8,72]。這四個部分使P450 酶催化氧化反應順利進行。以P450 催化的羥基化反應為例(圖7)，P450中包含靜息狀態鐵的活性中心首先接受底物，底物取代活性中心的水分子，但底物并不直接與鐵結合。然后，高自旋狀態的鐵(FeⅢ)接受來自其氧化還原伴侶的電子被還原為亞鐵(FeⅡ)。隨后，氧氣進入酶的活性位點并與FeⅡ結合形成[FeⅡO2]配合物。配合物[FeⅡO2]被來自氧化還原伴侶的第二電子還原形成配合物[FeⅢO22-]，它利用溶劑中的質子生成過氧鐵配合物[FeⅢ-OOH]，被稱為化合物0。伴隨第二個質子進入活性位點，[FeⅢ-OOH]的O—O 鍵斷裂，釋放出一個水分子，生成高價卟啉自由基陽離子四價鐵[FeⅣ=O](即化合物Ⅰ)。這種高活性的配合物易從底物中爭奪一個氫原子，形成鐵基羥基化合物[FeⅣ-OH](即化合物Ⅱ)。隨后，伴隨底物自由基與化合物Ⅱ的羥基反應生成羥基化產物(R-OH)，鐵也由化合物Ⅰ中的四價被還原為三價。最后，一分子水返回活性位點與FeⅢ配位并將底物置換，使FeⅢ恢復靜息狀態。當底物分子再次進入P450 活性口袋并將水分子置換，使FeⅢ變為高自旋狀態時，相同的催化循環被再一次啟動。值得注意的是，一些P450能夠直接利用H2O2作為電子供體，直接使高自旋狀態的FeⅢ形成化合物0，并利用過氧化物分流途徑行使催化功能(圖7，虛線箭頭)。然而，除了P450 過氧化物酶(如CYP152 亞家族)[73]外，大多數P450的低效和低H2O2耐受性極大地限制了這種分流途徑的應用。

圖7 P450羥化機理Fig.7 Hydroxylation mechanism of P450

值得一提的是，P450 催化循環的維持依賴于氧化還原伴侶向血紅素鐵的持續電子傳遞，這是個復雜的電子傳遞系統。根據氧化還原伴侶的類型和P450與氧化還原伴侶的相互作用關系，P450氧化還原系統可以分為五個主要類別[74-76]（圖8）。大多數細菌和線粒體P450 中存在的第Ⅰ類P450 系統具有一個雙組分的氧化還原伴侶系統，這種系統由一個含FAD 的鐵氧還蛋白還原酶(FDR)和一個含鐵硫的鐵還蛋白(FDX)[77]組成。真核生物使用的Ⅱ類P450系統有一個單組分的氧化還原伴侶，這種氧化還原伴侶是一種膜結合蛋白，其含有的FAD和FMN將來自NADPH 的電子傳遞給血紅素，被稱為細胞色素P450還原酶(CPR)。Ⅲ類P450系統有一個真核細胞樣的CPR，并通過一個柔性連接子融合在P450血紅素結構域的C 末端。Ⅳ類P450 系統以FMN/Fe2S2還原酶結構域為電子供體，FMN/Fe2S2還原酶結構域與P450結構域通過連接子連接。除此之外，一些P450可以直接與它們的電子供體相互作用，并且不依賴于額外的氧化還原伙伴蛋白來完成催化反應，被劃分為第Ⅴ類P450。Ⅲ～Ⅴ類P450 不依賴于氧化還原伴侶蛋白，通常被稱為自給自足的P450。

圖8 五個主要類別的P450氧化還原系統[76]Fig.8 Five main categories of P450 REDOX systems[76]

3 微生物制造植物天然產物的氧化過程

氧化酶在天然產物合成過程中起著至關重要的作用。且酶催化反應的高效性、高立體選擇性和區域選擇性賦予了酶高效合成手性藥物的能力[78]，因此利用氧化酶催化合成天然產物有著植物提取、化學全合成無法替代的優勢。

3.1 萜類化合物合成過程中的氧化酶

近些年，植物中的氧化酶，尤其是P450 酶催化的萜烯氧化反應廣為報道。例如，CYP71AV9 可以將倍半萜類物質吉瑪烯A 氧化為吉瑪烯酸，吉瑪烯酸進一步被CYP71BL5 氧化為6-羥基吉瑪烯酸，作為洋薊內酯生物合成途徑的前體物質，為洋薊內酯的生物合成奠定基礎[79]；在紫蘇中挖掘的CYP76AJ1在酵母細胞中被證實具有氧化補身醇形成水蓼二醛的功能，為其生物合成提供借鑒[80]；CYP701A26被鑒定為能夠氧化二萜化合物ent-貝殼杉烯生成赤霉素前體物質ent-貝殼杉烯酸的P450 酶，是赤霉素生物合成過程中的重要一步[81]；CYP716 家族的P450氧化酶絕大多數具有氧化各類三萜化合物C-28 的作用[82]，例如CYP716A179 可以專一地氧化各種三萜化合物的C-28 位：將羽扇豆醇28 號碳位氧化為羧酸生成具有顯著抗腫瘤活性的樺木酸[83]，將β-香樹脂醇28 號碳位氧化為羧酸生成對急性肝損傷有明顯保護作用的齊墩果酸[84]，將α-香樹脂醇的28號碳位氧化為羧酸生成具有對革蘭陽性菌、革蘭陰性菌以及酵母菌有明顯抑制作用的熊果酸[85]，同樣CYP716A44 和CYP716A46 也 具 有 相 同 的 功 能[86]。CYP716 家族的另一種P450 氧化酶CYP716A175 還能氧化日耳曼醇的28 號碳位形成羧酸，生成模繞酸[87]。CYP716 家族的CYP716A141 除了能氧化β-香樹脂醇的C-28，也能氧化其C-16,在其對應位置生成羥基，合成馬尼拉二醇[88]。除此之外，CYP716A1、CYP716A2 也具有相似的氧化功能[89]。來自番茄的CYP716E26 可以特異性氧化β-香樹脂醇C-6 生成曼陀羅萜二醇[86]。CYP716C49 可以氧化齊墩果酸的C-2，生成山楂酸，氧化熊果酸C-2 生成科羅索酸，氧化樺木酸C-2 生成麥珠子酸[90]。CYP714 家族的CYP714E19 可以氧化齊墩果酸的C-23生成絲石竹酸；同時也可以氧化烏蘇烷型的五環三萜C-23 生成相應的羧酸[91]。CYP87 家族的P450氧化酶CYP87D18可以專一性氧化葫蘆二烯醇的11 號碳位，在對應位置生成羥基，隨后繼續催化羥基氧化為羰基[92]。來自甘草的CYP88D6，可以催化β-香樹脂醇C-11 氧化生成甘草次酸的前體物質11-羰基-β-香樹脂醇[93]。來自苜蓿的CYP72A68 和CYP72A67 分別連續地對齊墩果酸的C-2、C-23 進行氧化，分別生成常春藤素和貝萼皂苷元，隨后CYP72A68 還可以繼續對常春藤素C-23 進行連續氧化，生成棉根皂苷元和絲石竹酸[94]。來自苜蓿的CYP72A63 和來自甘草的CYP72A154，可以氧化β-香樹脂醇和11-羰基-β-香樹脂醇的C-30，分別生成11-脫氧甘草次酸和甘草次酸[4]。

3.2 生物堿合成過程中的氧化酶

生物堿的合成途徑的復雜多樣造成了生物堿碳骨架的多樣化，與此同時生物堿的氧化修飾也隨之變得更加豐富，參與生物堿氧化反應的氧化酶種類也更繁多，其氧化反應類型也更加多樣。

Hagel 等[95]鑒定了黃素蛋白氧化酶DBOX 和TPOX，分別能催化二氫血根堿和四氫罌粟堿氧化脫氫，生成血根堿和罌粟堿；Ghislieri等[96]利用來自黑曲霉的單胺氧化酶突變體（MAO-N）催化的去消旋反應，催化(±)-毒芹堿生成(R)-毒芹堿，也可利用突變體催化(±)-胡禿子堿和(±)-細茜花堿分別去消旋化形成(R)-胡禿子堿和(R)-細茜花堿，同樣他們也發現這種單胺氧化酶的突變體能夠催化四氫-β-咔啉環系的去消旋化，得到去消旋化的四氫-β-咔啉環[97]，是帶有四氫-β-咔啉環生物堿微生物合成的關鍵一步；Xu等[98]發現FMN 依賴的氧化酶PhzG 能夠催化吩嗪類化合物碳骨架的氧化脫氫；Meng等[99]鑒定了來自鏈霉菌S.sapporonensis的6 種氧化酶的功能，其中5 種是依賴于酮戊二酸/Fe2+的雙加氧酶（BcmB、BcmC、BcmE、BcmF、BcmG），另一種是細胞色素P450 單加氧酶（BcmD），這六種氧化酶通過羥基化、氧化脫氫、環氧化，將環磷酰胺最終氧化為雙環霉素；Ju等[100]在茄病鐮刀菌Fusarium solani中鑒定了一種D-氨基酸氧化酶FsDAAO，該氧化還原酶可高度特異地將四氫異喹啉類化合物去消旋化，催化其氧化脫氫并進而反應生成(S)-四氫異喹啉類化合物；Couturier等[101]發現契珠哈氏菌Hahella chejuensis中的黃素依賴氧化酶PigB 和HapB，經鑒定這兩種酶可催化2-甲基-3-戊基二氫吡咯生成2-甲基-3-戊基吡咯，作為靈菌紅素的重要前體物質，這兩種氧化酶的發現對靈菌紅素的生物合成具有借鑒意義。

3.3 黃酮化合物合成過程中的氧化酶

目前，因氧化是植物類黃酮生物合成的重要步驟，黃酮類天然產物氧化酶的挖掘也成為了熱門話題[102]。黃酮合成過程中的第一個羥基化反應由P450 酶C4H 催化，在C-4 位引入一個羥基從肉桂酸到A環，形成對香豆酸[103]。目前，多種黃酮氧化酶的功能已經被解析。催化黃酮骨架氧化的酶主要是P450 酶，如大豆苷元分別在氧化酶nfa12130 和nfa33880 的氧化作用下，可以分別在苷元A 環的C-6、C-8 位進行氧化生成相應的羥基[104]；大豆苷元也可以在P450 酶CYP107H1 的氧化作用下，在其B 環 的C-3′ 形 成 羥 基[105]；P450 酶SAV2377、SAV5841、SAV4539 對染料木素、白楊素、芹黃素中B環具有較好的氧化活性[106]。

3.4 其他天然產物合成過程中的氧化酶

近些年，醌、糖苷和甾體類天然產物合成途徑的氧化酶也有報道。

Ehrlich 等[107]在黃曲霉素合成基因簇中發現了一個氧化酶HypC，催化降散盤衣酸蒽酮C-10 氧化為降散盤衣酸；Throckmorton 等[108]驗證了煙曲霉中的氧化酶TpcL，催化大黃素蒽酮C-10 氧化為大黃素；Marzorati 等[109]利 用 來 自 毛 栓 菌Trametes pubescens的漆酶氧化葡萄糖及其衍生物生成葡萄糖醛酸，Baratto 等[110]利用同樣的漆酶將硫代秋水仙堿苷、苦杏仁苷、積雪草皂苷和人參皂苷的葡萄糖苷氧化為葡萄糖醛酸；Ncanana 等[111]也利用來自Trametes pubescens的漆酶氧化桃柘酚的酚羥基形成自由基中間體，進一步反應生成二聚桃柘酚；甾體的合成往往也需要氧化酶參與催化氧化脫羧[112]，也需要P450氧化酶對其骨架進行氧化，如Kiss等[113]報道來自巨大芽孢桿菌Bacillus megaterium的CYP106A1可催化強的松醇的C-11羥基和C-15，生成15β-羥基強的松，也可以催化地塞米松C-11 的羥基氧化，生成11-羰基地塞米松。

表2列舉了部分天然產物氧化物催化實例。

表2 天然產物氧化酶催化舉例Table 2 Examples of natural product oxidase catalysis

4 微生物細胞工廠中氧化過程的調控

在天然產物合成中，氧化反應的進行往往會受到一些因素的制約。例如：氧化還原反應伴隨的輔因子消耗、氧化酶在行使催化作用時電子等物質的傳遞耦合性低和傳遞效率低等，使氧化酶經常成為級聯反應中制約物質轉化效率的限速酶，這也是目前微生物合成天然產物面臨的瓶頸問題。如何解決這一瓶頸問題，是實現氧化酶高效催化天然產物氧化的關鍵。微生物制造天然產物的氧化過程調控方法主要可分為酶工程、代謝工程和底物工程等。

通過代謝工程以及酶工程提高氧化酶在生物體內的活性的方法是目前合成生物學中的研究熱點（圖9）。挖掘活性更高的同工酶、氧化還原伴侶適配、增強輔因子的供應、酶的定點突變、定向進化等是目前較為常用且有效的策略[114]。

圖9 氧化酶氧化過程調控的主要方法Fig.9 Main methods for regulating the oxidation process of oxidase

作為典型的氧化酶，P450 酶的電子傳遞是它的瓶頸問題。研究表明，P450與CPR 的有效適配能夠增強電子傳遞，進而增強其氧化效率。由于烏拉爾甘草根部積累大量甘草次酸，而葉片幾乎沒有甘草次酸積累，因此Zhu 等[115]通過分析烏拉爾甘草轉錄組中甘草根與葉片的轉錄組差異，挖掘到一個P450氧化還原伴侶GuCPR1，酵母細胞體內驗證發現GuCPR1 可與CYP88D6 和CYP72A63 高度適配，使甘草次酸在釀酒酵母內的產量達到(18.9±2.0)mg/L，適配效果遠遠強于來自苜蓿和擬南芥的CPR；Kim 等[116]利用釀酒酵母異源表達原人參二醇的合成途徑，研究P450 酶與CPR 的適配，在表達來自人參的P450氧化還原伴侶PgCPR5后人參二醇產量達到最高，使原人參二醇的產量提高了2.5 倍，證明PgCPR5與人參二醇合成途徑中的P450有著更強的適配性。

融合蛋白的策略也給氧化酶的活性提升提供了參考。Mellor 等[117]利用鐵氧還蛋白與模式植物高粱的CYP79A1 融合，催化蜀黍苷生物合成的第一步。與鐵氧還蛋白的融合使CYP79A1 能夠通過直接與光系統Ⅰ相互作用獲得用于催化的電子。此外，融合的鐵還蛋白部分捕獲的電子被更有效地導向P450催化活性，使融合能夠更好地與耦合到代謝途徑的內源電子匯競爭。P450-鐵氧還蛋白融合酶僅從融合的鐵氧還蛋白獲得還原力，在體內表現優于未融合的CYP79A1，表明電子從光系統Ⅰ到CYP79A1 的轉移大大增強。Wang 等[118]利用融合蛋白的策略融合級聯反應的兩種酶，將1,8-桉葉油素合成酶(CS)和能在1,8-桉葉油素C-6 形成羥基的CYP176A1 兩酶融合，使單萜1,8-桉葉素的羥基化程度提高了5.4倍。

除此之外，對P450血紅素結構域和氧化還原伴侶CPR 的理性改造也是提升P450 氧化能力的一個有效手段。Sun 等[119]采用定點突變的策略，調整CYP72A63 內 部 的 疏 水 環 境，CYP72A63T338S突 變 體提高了CYP72A63 氧化11-羰基-β-香樹脂醇C-30的能力，CYP72A63L509I使CYP72A63 專一氧化11-羰基-β-香樹脂醇C-30 形成羥基，CYP72A63L398I使CYP72A63 專一氧化11-羰基-β-香樹脂醇C-29 生成羥基。

5 總結與展望

氧化反應是天然產物合成過程中普遍存在的反應類型。植物天然產物骨架后修飾中的氧化反應是提高其在生物體內水溶性的重要保障，也是天然產物進行后續的糖基化、酰化等反應的前提。氧化反應使天然產物種類更豐富、藥理活性更多樣。近些年人們對天然產物的氧化反應進行研究實驗，打通了眾多天然產物的生物合成途徑，也開發出許多藥理活性明顯優于天然產物的天然產物衍生物。

氧化酶是催化天然產物進行氧化反應的重要催化劑，它具有高區域選擇性、高立體特異性和高催化活性的特點。目前，氧化酶在微生物細胞工廠中的應用仍受到許多制約，主要包括：（1）氧化還原反應的實質是電子的得失，微生物體主要利用輔因子向氧化酶傳遞電子，因此微生物表達外源氧化酶基因會消耗大量輔因子，若微生物細胞中輔因子供給不足，則會嚴重制約氧化酶催化的氧化反應進行；（2）微生物細胞內環境與植物細胞內環境存在差異，植物中的氧化酶于微生物細胞內異源表達的表達量、氧化酶在異源宿主內表達的穩定性問題，也是制約氧化酶高效、長時間行使其催化功能的因素；（3）許多氧化酶因為自身的雜泛性，催化后所得產物繁多，造成目標產物得率低，進而給目標產物的分離純化帶來一定的困難；（4）有些氧化酶在催化氧化過程中會產生活性氧等對微生物細胞有害的物質，對宿主微生物自身代謝帶來強烈的干擾，嚴重干擾微生物本身的生存和繁殖，制約植物天然產物的微生物制造。利用代謝工程強化輔因子供應、增強宿主微生物的耐受性、利用酶工程的策略改造氧化酶，從而提高其催化特異性、催化活性和熱穩定性是目前的研究熱點，也是解決氧化酶在微生物體內高效發揮氧化作用的重要方法。

酶工程、代謝工程與合成生物學的快速發展，使微生物實現高效氧化反應進而生產天然產物成為可能。將酶工程與微生物代謝工程、發酵工程等手段有機結合，實現天然產物的高效合成，是未來天然藥物合成的發展趨勢。