核因子κB受體活化因子配體和腫瘤壞死因子α經炎性牙周膜干細胞外泌體促進破骨細胞分化

戴振寧 鄭蔚晗 利時雨，

1.廣東省第二中醫院口腔科，廣州 510095；2.南方醫科大學第三附屬醫院，廣東省醫學3D打印應用轉化創新平臺，廣州510630

慢性牙周炎（chronic periodontitis，CP）是常見的口腔疾病，通常由牙菌斑生物膜作為始動因子，造成牙周組織的破壞，牙周炎晚期牙齒周圍軟組織和骨組織嚴重破壞吸收，引起牙齒的松動和脫落[1]。在生理狀態下，由成骨細胞介導的骨基質分泌，與由破骨細胞介導的骨基質分解，往往處于動態平衡；而在病理性骨吸收狀態下，主要表現為破骨細胞的過度激活[2-3]。以往研究[4-6]顯示，在細菌引起的炎性環境中，牙周組織細胞和免疫細胞對炎性因子產生應答，如M1型巨噬細胞加速牙周炎病程，CD4+T 細胞通過分泌白細胞介素（interleukin，IL）-2、腫瘤壞死因子α（tumor ne‐crosis factor-α，TNF-α）激活破骨細胞導致牙槽骨吸收，B 淋巴細胞通過分泌核因子κB 受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor-κB li‐gand，RANKL）誘導破骨細胞進行骨吸收等。然而，對于牙周組織中的牙周膜干細胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）在CP 的病理性骨吸收中扮演何種角色，目前缺乏相關研究。

干細胞可通過旁分泌機制調控細胞本身和周圍細胞的生物學功能，外泌體（exosomes，Exo）是干細胞進行細胞間通訊、信號轉導的重要媒介[7]。Exo是一種由細胞分泌的微小的細胞外囊泡，粒徑通常在30～150 nm，其中含有豐富的蛋白、核酸、脂質等物質[8]。在不同的生理、病理環境下，Exo中的成分會隨來源細胞蛋白、核酸表達譜改變而發生同步變化[9]。因此，CP 病程中，炎性牙周膜干細胞（PDLSCs-CP）可能經其分泌的Exo，實現抑制骨形成或促進骨吸收的功能。

本研究提取了健康牙周膜組織、炎性牙周膜組織中PDLSCs 的Exo，通過對Exo 蛋白組分的分析，初步研究PDLSCs-CP 中Exo 對RAW264.7 破骨細胞分化的影響，為CP 的病理性骨吸收發展機制提供新的視角。

1 材料和方法

1.1 細胞株、試劑、儀器

1.1.1 細胞株 細胞原代提取已獲患者知情同意，本研究實驗已通過醫院倫理委員會審核批準。正常表型PDLSCs（PDLSCs-WT）來源于3例正畸治療前拔除的健康牙的牙周膜組織，病例納入標準：牙周健康、因正畸需要拔牙。PDLSCs-CP來源于3例CP 拔牙患者的炎性牙周膜組織，病例納入標準：重度牙周炎、患牙Ⅲ度松動、牙槽骨吸收至根1/3、牙周袋>5 mm、有反復發作的牙周溢膿、腫痛史。RAW264.7細胞株為實驗室保藏。

1.1.2 主要試劑 無Exo 胎牛血清（EXO-FBS-50A-1，SBI 公司，美國），DMEM 培養基（1196-5092）、雙抗（15140122）、0.25% 胰蛋白酶（25200072）、杜氏磷酸鹽緩沖液（Dulbecco’s phosphate buffered saline，DPBS）（14190144）、Ⅰ型膠原酶（171018029）（Gibco 公司，美國），蛋白濃度檢測（bicinchoninic acid assay，BCA）試劑盒（23227，Thermo 公司，美國），抗體：CD63（ab134045）、Alix（ab-275377）、CD9（ab2366-30）、CD44（ab243894）、CD45（ab40763）、CD-105（ab2529）、腫瘤壞死因子受體相關因子2（TNF receptor associated factor 2，TRAF2）（ab-126758）、kappa B 抑制因子激酶β（inhibitor of kappa B kinase beta，IKKβ）（ab1249-57）、核轉錄因子κB（nuclear transcription factor κB，NF-κB）-p65（ab16502）、整合素β3（Integrin β3）（ab17-9473）、Goat anti-Rabbit IgG H&L（HRP）（Abcam公司，英國）；TNF-α 酶聯免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（DG-12110H，北京Dogesce 公司），RAN-KL ELISA 試劑盒（EK5377）、IL-1α ELISA 試劑盒（EK-8147）、骨形態發生蛋白2（bone morphogenetic protein 2，BMP-2）ELISA 試劑盒（EK5130）（SAB 公司，美國），轉化生長因子β1（transforming growth factor β1，TGF-β1）ELISA試劑盒（H0287，上海信裕生物科技有限公司），RANKL蛋白、巨噬細胞集落刺激因子（macrophage colony-stimulating factor，MCSF）（蘇州Novoprotein 公司），總RNA 提取試劑盒（Axygen公司，美國），逆轉錄試劑盒（TaKaRa公司，日本），實時熒光定量聚合酶鏈反應（real time quantitative polymerase chain reaction，RTqPCR）試劑盒（Roche 公司，瑞士），抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRAP）染色試劑盒（上海貝博生物科技有限公司）。

1.1.3 主要設備 流式細胞儀（FACSAria Ⅲ，BD公司，美國），多功能高效離心機、智能超高速離心機（Beckman Coulter公司，美國），低速冷凍離心機（Sigma-Aldrich 公司，美國），Nano Sight 納米粒徑儀（Malvern 公司，英國），倒置激光共聚焦顯微鏡（Zeiss 公司，德國），凝膠成像系統（Bio-Rad 公司，美國），熒光聚合酶鏈反應（poly‐merase chain reaction，PCR）儀（ABI公司，美國），多功能酶標儀（BioTek 公司，美國），超高效液相色譜系統、蛋白質譜儀（Thermo公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 原代提取及細胞培養 刮下根中1/3 牙周膜組織，用含1%雙抗、3%慶大霉素的DPBS溶液洗滌1 min。將牙周膜組織加入含3 g·L?1Ⅰ型膠原酶的DPBS 中，于37 ℃水浴中消化1 h。消化后過70 μm 濾膜過濾獲得分散均勻的細胞，100g離心5 min后，用完全培養基（含10%無Exo血清、1%雙抗的DMEM 培養基）重懸沉淀，調整細胞密度為每毫升1×104個，接種于T25 細胞培養瓶中，置于37 ℃、5%CO2細胞培養箱。1 d后全換液去除未貼壁細胞，后續2～3 d 全換液1 次，于細胞密度達80%時進行傳代。

1.2.2 流式細胞檢測 分別將1 名正畸患者和1 名CP患者的第2代PDLSCs-WT和PDLSCs-CP去掉培養液，用0.25%的胰蛋白酶消化1 min，用PBS洗滌后制成每毫升含有1×106個細胞的單細胞懸液。分入4 組試管，每管20 μL，分別檢測CD44、CD45、CD105，滴加10 μL 一抗，冰上放置30 min。每管加入100 μL PBS重懸細胞，每管加入二抗4 μL，室溫下避光反應30 min，PBS 洗滌3 次，上機進行流式細胞儀觀察和檢測，每次計數10 000個細胞。

1.2.3 差速離心法提取Exo 分別將2 名正畸患者和2 名CP 患者 的PDLSCs-WT 和PDLSCs-CP 細 胞分別接種至10 個T75 細胞培養瓶中，當細胞生長約80%融合，用PBS 洗滌2 次，每次1 min。用含10%無Exo 血清、1%雙抗的完全培養基進行全換液，每瓶加入培養基50 mL。3 d 后收集細胞培養液（共500 mL）用作Exo 提?。? ℃條件下，依次離心300g10 min，2 000g10 min，10 000g30 min，每次離心后取上清繼續離心。繼續4 ℃100 000g離心70 min，棄上清，每支離心管用2 mL DPBS 重懸沉淀。進而100 000g離心70 min，棄上清，每支離心管用200 μL DPBS重懸沉淀。用0.22 μm 孔徑濾網過濾除菌，用EP 管分裝置于?80 ℃保藏用于后續實驗，取用時避免反復凍融。PDLSCs-WT 和PDLSCs-CP 細 胞的Exo 分別記為Exo-WT、Exo-CP。

1.2.4 Exo 鑒定 1）Western blot 檢測Exo 標志物：Western blot 根據常規方法依次對細胞和Exo 的蛋白樣品進行BCA 蛋白濃度測定、配制15%的分離膠和5%的濃縮膠、上樣、電泳、轉模、孵育一抗、孵育HRP 標記二抗、電化學發光（electroche‐miluminescence，ECL）檢測。2）納米粒徑檢測：將1 mL外泌體樣品緩慢注入Nanosight納米粒徑儀樣品池中，將溫度計探頭放入激光模塊的銅孔內，調整焦距后，在標準操作程序中選擇對樣品進行粒徑觀測和計算。3）透射電子顯微鏡（transmis‐sion electron microscope，TEM）檢測：將10 μL 外泌體樣品滴加在銅網上，靜置3 min，用無塵紙吸去浮液。在銅網上滴加10 μL 磷鎢酸，靜置1 min，無塵紙吸去浮液。室溫干燥5 min，使用TEM 進行成像，操作電壓為90～120 kV。

1.2.5 Exo蛋白質譜檢測 通過常規步驟對Exo-WT和Exo-CP進行BCA 濃度測定、烷基化、酶解。酶解后肽段用液相色譜流動相A 溶解后使用EASYnLC 1200 超高效液相系統進行分離。流動相A 為含0.1%甲酸和2%乙腈的水溶液；流動相B 為含0.1%甲酸和90%乙腈的水溶液。液相梯度設置：0～96 min，4%～19%B；96～115 min，19%～32%B；115～118 min，32%～80%B；118～120 min，80%B，流速維持在500.00 nL·min?1。肽段經由超高效液相系統分離后被注入NSI 離子源中進行電離然后進Exploris 480質譜分析。所得二級質譜數據使用PD 2.4進行檢索，將半胱氨酸烷基化Carbamidomethyl（C）設置為固定修飾，可變修飾為［‘Acetyl（Protein N-term）’，‘Oxidation（M）’，‘Deamidation（NQ）’］。

1.2.6 ELISA 檢測 將Exo-WT、Exo-CP 稀釋為1 mg·mL?1，采用TNF-α、RANKL、IL-1α、TGFβ1、BMP-2 的ELISA 試劑盒進行檢測：根據試劑盒說明配置梯度濃度的標準樣品和工作液，Exo與工作液反應后于酶標儀中檢測光密度（optical den‐sity，OD）值。于Origin 8 軟件中生成標準樣品曲線，根據樣品OD值計算蛋白濃度。

1.2.7 RT-qPCR檢測 將RAW264.7以細胞密度為每毫升1×105個接種于12孔板中，待細胞生長約80%融合，分別給予5 種條件進行培養：完全培養基、無血清培養基（分別含10、100、1 000 μg·mL?1Exo-WT 或Exo-CP）、無血清培養基（含50 ng·mL?1RANKL 和25 ng·mL?1M-CSF）于5 d 時間點進行逆轉錄聚合酶鏈式反應（reverse transcription-poly‐merase chain reaction，RT-PCR）檢測破骨分化相關基因TRAP、人組織蛋白酶K（cathepsin-K，Cath-K）、降鈣素受體（caltitonin receptor，CTR）表達水平：將12 孔板中的培養基去除，用DPBS 洗滌2 次，每次3 min。用細胞刮轉移RAW264.7 細胞至EP 管中，液氮冷凍后將樣品磨碎成粉末，用總RNA 提取試劑盒提取RNA，使用逆轉錄試劑盒進行cDNA合成。逆轉錄完成后加入引物，引物序列如下。TRAP 上游引物序列：CTGGAGTGCAC‐GATGCCA，下游引物序列：TCCGTGCTCGGC‐GATGGA；Cath-K 上游引物序列：ATGTCTGTC‐TAAGTTTCTG，下游引物序列：CGCTCCTGG‐TATGGGCAGA；CTR 上游引物序列：CGACTATCCACTGCTACCG，下游引物序列：GTTGCTGATTGGAGGATTC；磷酸甘油醛脫氫酶（glyceralde‐hyde phosphate dehydrogenase，GAPDH）上游引物序列：ACCCAGAAGTGTGGATCC，下游引物序列：CACATTGGGGGTAGGAACAC。于RT-qPCR分析儀中，利用2?ΔΔCT法計算相關基因的表達。

1.2.8 Western blot檢測 根據1.2.7分組，對TRAF-2、IKKβ、NF-κB-p65、Integrin β3 蛋白表達水平進行檢測，方法如1.2.4（1）。

1.2.9 TRAP 染色 根據1.2.7 分組，采用試劑盒固定RAW264.7細胞5 min，蒸餾水洗滌2次。室溫避光染色1 h，蒸餾水洗滌2次，鏡檢。采用ImageJ軟件計算除破骨細胞外其余RAW264.7細胞的長度。

1.3 統計學分析

采用SPSS 24.0 軟件對實驗數據進行統計學分析，實驗數據均以平均數±標準誤表示，2 組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PDLSCs細胞及其Exo的鑒定

通過流式細胞術對正畸前患者PDLSCs-WT 細胞和CP患者PDLSCs-CP細胞的表面標記物進行檢測，結果見圖1A。PDLSCs-WT 和PDLSCs-CP 均高表達間充質干細胞表面標記物CD44、CD105；幾乎不表達造血干細胞表面標記物CD45，符合PDLSCs的表面標記物特征。

通過差速離心法從PDLSCs-WT和PDLSCs-CP培養液中提取Exo，分別記為Exo-WT 和Exo-CP，Exo 樣品和細胞蛋白樣品經過Western blot 免疫印跡檢測，結果見圖1B。Exo-WT 和Exo-CP 都顯著表達Exo 特征性標志物Alix、CD63、CD9，幾乎不表達細胞內參蛋白β-actin；在相同濃度的蛋白樣品中，細胞樣品的Alix、CD63、CD9 表達水平較低。TEM 結果見圖1C，2 種PDL-SCs 來源的Exo均為典型的“杯口狀”囊泡。經BCA 法檢測Exo-WT 和Exo-CP 的蛋白濃度，結果見圖1D，從細胞培養液中差速離心提取的Exo，經過重懸樣品體積和原細胞培養液體積的換算，每毫升細胞培養液中可分離獲得的Exo 分別為26.45 μg±2.36 μg 和26.92 μg±5.74 μg，二者差異無統計學意義。通過納米粒徑追蹤分析檢測Exo的粒徑尺寸，結果見圖1E，Exo-WT和Exo-CP的粒徑分布主要集中在30～150 nm范圍內，少量囊泡的粒徑可達200 nm。

圖1 PDLSCs細胞及其Exo鑒定結果Fig 1 Characterization of PDLSCs and Exo

2.2 Exo的蛋白組分分析

蛋白質譜共檢測到378個蛋白，可定量的蛋白有246 個。蛋白質亞細胞結構分布結果見圖2A。Exo-WT 與Exo-CP 所鑒定到的蛋白主要富集于細胞外、細胞質、細胞膜、內質網等，符合Exo蛋白分布特征。在這些可定量蛋白中Exo-WT/Exo-CP共篩選出33 個差異表達的蛋白，其中20 個表達下調，13 個表達上調。下調水平顯著的蛋白包括TNFSF11、TNFSF2、IL1A、GLUT1、ODRF、OSCAR、MMP9、C3、MMP14；上調顯著的蛋白包括TGFB1、TGFBR2、TGFBR3、BMP2B1、FG‐FR2、CCL4等（圖2B）。

2.3 蛋白功能注釋富集分析

根據基因本體（gene ontology，GO）富集分析，分別描述Exo-CP/Exo-WT 中差異蛋白的生物過程、細胞組分、分子功能分類，結果見圖2C。差異蛋白的分子功能主要與骨吸收，細胞組分組織或合成和吞噬作用有關；差異表達蛋白所處的亞細胞定位主要集中在細胞質、細胞外空間和細胞膜；差異表達蛋白參與的生物過程主要與趨化因子活性，連接和催化活性有關。

利用KEGG 通路富集分析對Exo-WT/Exo-CP中差異蛋白涉及的信號通路予以描述，結果見圖2D。主要涉及的信號通路包括TNF 信號通路、破骨細胞分化通路、NF-κB信號通路等。

圖2 Exo蛋白質譜分析Fig 2 Analysis of Exo protein profile

2.4 ELISA檢測

利用ELISA 試劑盒對Exo-CP 和Exo-WT 所含TNF 信號通路相關細胞因子進行定量分析，結果見表1。相對于Exo-WT 組，Exo-CP 組TNF-α、RANKL、IL-1α水平均升高，差異有統計意義（P<0.05）；而TGF-β1、BMP-2 水平均降低，差異均具有統計學意義（P<0.05）。

表1 外泌體細胞因子ELISA檢測結果Tab 1 ELISA of exosomal cytokines ng·mL?1

2.5 不同濃度Exo-WT 和Exo-CP 對RAW264.7 破骨細胞分化的影響

利用RT-qPCR 檢測各處理組破骨細胞分化相關基因的表達水平，結果見圖3A。不同濃度Exo-WT 處理組的TRAP、Cath-K、CTR 基因表達水平基本與Control組保持一致。不同濃度Exo-CP處理組的TRAP、Cath-K 和CTR 基因的相對表達均上調，和Control 組間差異具有統計學意義（P<0.05），其 中100、1 000 μg·mL?1濃 度Exo 組 和RANKL+M-CSF 陽性對照組間差異無統計學意義（P>0.05），與10 μg·mL-1Exo 組差異有統計學意義（P<0.05）。

Western blot 檢測破骨細胞分化相關蛋白的表達水平，結果見圖3B。實驗檢測了RANKL、TNFα 的下游蛋白TRAF2，以及NF-κB 信 號通路的IKKβ、NF-κB-p65，破骨細胞特異表達蛋白Integ‐rin β3。在Exo-WT 組中，破骨細胞分化相關蛋白的表達水平基本與Control 組一致，TRAF2 和Inte‐grin β3 表達水平較低，IKKβ、NF-κB-p65 有檢測蛋白表達且與Exo-WT外泌體濃度呈正相關，但顯著低于Exo-CP組各濃度。在Exo-CP組中，上述破骨細胞分化相關蛋白的表達水平均呈陽性表達，與Exo-CP 外泌體濃度呈正相關，且1 000 μg·mL?1Exo-CP與RANKL+M-CSF組表達水平一致。

TRAP 染色后，胞質呈紫紅色。各濃度Exo-CP 組和RANKL+M-CSF 組可見邊界清晰、胞體巨大、胞漿量豐富、圓形、多核的破骨細胞。鏡下視野中Control 組和Exo-WT 組的破骨細胞數量明顯少于Exo-CP組和RANKL+M-CSF組（圖3C）。

對TRAP 染色結果中未分化為破骨細胞的RAW264.7 細胞長度進行測量統計，結果見圖3D?？梢婋S外泌體濃度提高，RAW264.7 的細胞偽足擴張，細胞長度提高，由圓形轉變為多角形，該現象在Exo-WT 組尤為明顯。而對照組Control 組和RANKL+M-CSF組，細胞多呈圓形。

圖3 RAW264.7細胞的破骨細胞分化檢測Fig 3 Osteoclast differentiation detection of RAW264.7 cells

3 討論

CP 是由牙菌斑生物膜的細菌及其產物為始動因子引起的牙周組織慢性炎癥，牙周組織長期炎性浸潤導致其力學緩沖、穩固支持的生理功能喪失，造成牙齒松動、牙槽骨吸收等病癥。本研究關注的PDLSCs 來源于牙周膜，大量研究[10-11]表示利用酶消化法從牙周膜組織中分離的PDLSCs 細胞，表達CD44、CD105 等基質細胞、內皮細胞表面標記物，與本研究通過流式細胞術檢測的表型一致。以往研究[12]證實了PDLSCs 的多向分化潛能，主要是成骨、成脂分化能力，也有研究[13]發現其具有向骨骼肌和神經節樣細胞分化的潛能。本研究關注的牙槽骨吸收病理癥狀，涉及破骨細胞調控骨代謝、破骨細胞分化的相關功能，破骨細胞主要分化自單核巨噬細胞相互融合形成的多核巨細胞，不屬于PDLSCs的終末分化方向，但在CP 環境下PDLSCs 的Exo 是否調控破骨細胞的分化、募集、激活，尚無相關研究。

Exo是細胞分泌的微小囊泡，最初被發現時被認為是細胞代謝排出的廢物，后證實其中含有豐富的核酸、蛋白等成分，是介導細胞間通訊的重要媒介。目前的研究中發現不同細胞、不同環境下細胞所分泌的Exo功能有所差異，如腫瘤細胞分泌的Exo 可能介導腫瘤血管新生、腫瘤細胞遷移等[14]。而間充質干細胞分泌的Exo含有豐富的旁分泌因子，可介導旁分泌作用對干細胞進行激活和募集[15]。本研究通過常用的差速離心方法提取Exo，通過不同離心力依次離心去除培養液中的細胞、死細胞、細胞碎片、雜質蛋白等物質，最終收獲Exo。經實驗鑒定，本研究提取的Exo 高表達CD9、CD63 膜蛋白，以及Alix 外泌體內容物蛋白，其微觀形態呈“杯口狀”囊泡，粒徑主要分布在30～150 nm范圍內，符合外泌體的特征。值得注意的是，本研究采用了健康牙周組織的PDLSCs-WT和炎癥牙周組織的PDLSCs-CP進行對照研究，以往研究[16]提出，細胞在缺氧、炎癥等[17]條件下可能促進Exo分泌行為，但本研究通過蛋白濃度對Exo 進行定量并未發現Exo 分泌水平的差異。

目前有關PDLSCs Exo 的研究表明，在成骨誘導培養條件下，PDSLCs Exo 的miRNA 表達譜發生變化[18]，可發揮與間充質干細胞Exo相似的組織修復功能，促進骨組織再生[19]。并且對于PDLSCs在成骨分化總circRNA 和lncRNA 的表達譜變化也有報道，明確了PDLSCs Exo 對成骨分化的促進作用[20]。而對于Exo-CP 的研究則報道了其促血管化和改善炎癥微環境的作用：Liu等[18]發現Exo-CP中血管內皮生長因子表達水平上調，miR-17-5p 下調，對人臍靜脈內皮細胞成管和牙周韌帶的血管化具有促進作用。研究[21]構建了脂多糖刺激的PDLSCs-CP 模型，其外泌體含有miR-155-5p，通過靶向炎性PDLSCs 的SIRT1 來調節Th17/Treg 平衡以改善炎性微環境。上述研究多圍繞Exo RNA成分的表達水平和功能，而本研究主要關注Exo-CP 的蛋白組分，并率先發現了其中破骨細胞分化相關蛋白的高表達。

在蛋白質譜的分析結果中，Exo-WT、Exo-CP的蛋白成分亞細胞定位主要為細胞外成分和細胞質成分，Exo-CP 高表達的TNFSF11、TNFSF2 即RANKL 和TNF-α，前者通過RANKL-RANK 信號途徑[22]，后者通過TNF-α-TNFR1 信號途徑，二者皆可介導NF-κB 通路活化以促進炎癥反應[23]，以往研究[24]報道TNFSF11 由成骨細胞、破骨細胞前體細胞、活化T 細胞表達，與PDLSCs 表型一致。此外，鑒定的Exo-CP 高表達蛋白IL-1α、OSCAR、MMP9、MMP14 對于破骨細胞分化、破骨細胞存活、骨吸收活性具有密切影響。反之，Exo-CP 低表達而Exo-WT 高表達的TGF-β、FGF、BMP 等細胞因子，對骨形成和成骨分化起促進作用，反映出PDLSCs 和間充質干細胞的Exo 可能起到相似的促組織再生作用。生物信息學富集的差異表達蛋白富集的TNF 信號通路、破骨細胞分化信號通路、NF-κB 信號通路證實了PDLSCs-CP Exo 富含促進破骨細胞分化的細胞因子。根據蛋白質譜鑒定結果，對表達差異較大且功能作用突出的5種細胞因子TNF-α、RANKL、IL-1α、TGF-β1、BMP-2 進行了ELISA 驗證，定量的細胞因子濃度與蛋白質譜鑒定的表達水平相吻合。

為驗證Exo-CP 對破骨細胞分化的促進作用，本研究將不同濃度的Exo-WT 和Exo-CP 加入RAW264.7 進行共培養，通過RT-qPCR、Western blot、TRAP 染色實驗證實了經過Exo-CP 作用，有效促進RAW264.7細胞的破骨細胞分化。由于難以對體內環境中PDLSC分泌外泌體的水平進行測定，本研究采用由低到高10、100、1 000 μg·mL?1的外泌體濃度進行誘導，Exo-CP 低濃度誘導即與Con‐trol 組產生了統計學差異，而中、高濃度組和RANKL+M-CSF 陽性對照組對破骨分化基因表達水平的上調作用差異無統計學意義。對破骨細胞分化相關通路的蛋白水平檢測中，檢測到TNF 信號通路的TNF-α 受體相關因子TRAF2，NF-κB 信號通路的IKKβ、NF-κB-p65，以及破骨細胞特異性膜蛋白Integrin β3，在Exo-CP 誘導下蛋白表達水平上升，這與蛋白質譜分析的富集信號通路是一致的。此外，TRAP 染色結果觀察到Exo 濃度對RAW264.7 細胞形態產生影響，高濃度Exo 處理后細胞偽足擴張，根據以往研究，分析該現象可能是RAW264.7 細胞對Exo 的內化伴隨著吞噬行為[25]，進而因吞噬抗原而刺激活化，促使細胞分化出偽足[26]。而Exo-WT 較Exo-CT 更加促進細胞偽足伸長，可能和Exo膜蛋白以及Exo蛋白成分相關，其具體原因有待深入探索。

本研究尚存在值得進一步深入探索的問題，對于Exo所含成分的分析，本研究主要根據旁分泌途徑影響生物學行為的觀點出發，關注了Exo的蛋白組分，而對于核酸如mRNA、miRNA、lncRNA等未能一一進行檢測。此外，本研究明確了PDLSCs-CP Exo 對破骨細胞分化的促進作用，是導致CP 牙槽骨吸收的病理因素之一，但在體內環境中，因PDLSCs Exo 引起的破骨細胞激活是否主導慢性牙周炎牙槽骨吸收的發生，有待進一步研究。

本研究初步分析了CP 中PDLSCs 細胞Exo 的蛋白組分，及其對RAW264.7 破骨細胞分化的影響。相對于PDLSCs-WT Exo，PDLSCs-CP Exo 富含RANKL和TNF-α，可通過激活TNF和NF-κB 相關信號通路促進破骨細胞分化。本研究為PDLSCs Exo 通過遞送RANKL 和TNF-α，促進破骨細胞分化，導致慢性牙周炎的病理性骨吸收，提供了新的視角和思路。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。