UPLC-MS/MS 分析綠茶中12 種酚酸類物質

盧 專，黃永橋，于以竹，毛敏霞，簡銀池，吳新文

（貴州省檢測技術研究應用中心，貴州貴陽 550014）

關鍵字：綠茶；超高效液相色譜-串聯質譜；酚酸

茶葉因其特殊風味和保健功效，深受消費者喜愛。茶葉中富含多種營養成分，如茶多酚、咖啡堿、氨基酸、有機酸、茶多糖及礦物元素等，其中酚酸類化合物含量約占鮮葉干重的5%[1-2]。酚酸類物質主要是沒食子酸、咖啡酸等形成的簡單酚酸和奎寧酸、沒食子酸、咖啡酸等形成的縮合衍生物，如鞣花酸、間雙沒食子酸、綠原酸等[3-4]。研究表明，酚酸在許多藥用植物中作為活性成分發揮藥理作用，如綠原酸具有利膽、抗菌、降壓、增高白細胞及興奮中樞神經系統等功效；鞣花酸具有抗菌、抗突變、抗癌及增白等功效[5-7]。因此茶葉中酚酸化合物的含量測定對其生物活性研究具有重要意義。

目前，酚酸化合物的含量測定方法主要有薄層色譜法[8]、毛細管電泳法[9]、高效液相色譜法[10-12]、液相色譜-質譜法[13-15]、氣相色譜法[16]和氣相色譜-質譜法[17]等。高效色譜-質譜法具有選擇性強、靈敏度高、抗干擾能力強和結果準確可靠等特點，是測定酚酸含量常用的分析方法之一。

本研究以遵義市、都勻市、雷山縣3 個地區的綠茶作為研究對象，采用高效液相色譜-串聯質譜儀，通過優化儀器及前處理條件，建立分析測定方法，并對建立的方法進行方法學驗證。通過建立的分析測定方法對不同產地的綠茶進行分析測定，計算各酚酸的含量，通過對不同產地的綠茶中12 種酚酸物質含量差異進行分析，探討酚酸含量的差異與產地是否存在聯系，以期為茶葉化學分類方法提供更多的數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇、乙腈（均為色譜純），德國Merck 公司；沒食子酸（99.35%），德國Dr.Ehrenstorfer 公司；甲酸（色譜純）、鞣花酸（99.9%），上海安普實驗科技股份有限公司；綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、咖啡酸、對香豆酸和鄰香豆酸（純度＞95%），天津阿爾塔科技有限公司；間雙沒食子酸（98.2%），美國Cayman 公司；實驗室用水均為超純水。

茶葉樣品分別購自湄潭、雷山、都勻3 個地區茶葉生產企業生產的60 批次綠茶，均選取當地茶葉進行生產的綠茶，其中湄潭24 批次、雷山23 批次、都勻13 批次。

1.2 儀器與設備

三重四極桿質譜儀（Agilent 6470，配ESI 源）、超高效液相色譜儀（Agilent 1290），美國Agilent 公司；GM200 刀式研磨粉碎儀，德國Retsch 公司；超聲波清洗器，上海科導超聲儀器有限公司；UMV-2 多管渦旋混合器，北京普立泰科儀器有限公司；L-550 離心機，湖南湘儀離心機儀器有限公司；Milli-Q 超純水機，美國Millipore 公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液配制

準確稱取上述12 種酚酸標準品，分別加入甲醇溶解并定容至刻度，配制濃度為1.0 mg/mL 的標準儲備液，于-18℃保存。用80%甲醇溶液稀釋標準儲備液，配制濃度為0.02 μg/mL、0.05 μg/mL、0.20 μg/mL、0.50 μg/mL、1.00 μg/mL、2.00 μg/mL、5.00 μg/mL 和10.00 μg/mL 的系列標準工作液，現配現用。

1.3.2 色譜條件

色 譜 柱ZORBAX Eclipse Plus-C18（150 mm×2.1 mm，1.8 μm）， 美 國Agilent 公 司； 流 速0.3 mL/min；柱溫40 ℃；進樣體積2.0 μL；流動相A 為0.1%乙酸水溶液，B 為乙腈。

梯 度 洗 脫 程 序 為0 ～0.5 min，2.0%B；0.5 ～6.0 min，2.0% ～16.0%B；6.0 ～9.0 min，16.0% ～42.0%B；9.0 ～10.0 min，42.0% ～46.0%B；10.00 ～10.01 min，46.0%～95.0%B；10.01 ～11.00 min，95.0B%；11.00 ～11.01 min，95.0% ～2.0%B；11.01 ～12.0 min，2.0%B。

1.3.3 質譜條件

電噴霧離子源：負離子掃描；多反應監測；毛細管電壓為3.5 kV；霧化器壓力為40 psi；干燥氣流速為10 L/min；干燥氣溫度為325 ℃；鞘氣流速為10 L/min；鞘氣溫度為325 ℃；目標物質譜參數見表1。

表1 質譜參數

1.3.4 樣品前處理

稱取粉碎后的茶葉樣品0.50 g 于50 mL 具塞離心管中，準確加入20 mL 80%甲醇溶液，超聲15 min，渦旋振蕩30 min，5 000 r/min 離心10 min，取上清液過膜上機。

1.4 數據處理

實驗數據計算采用Excel 2016 版，圖譜繪制采用Origin 2018 版，Bayes 判別分析采用SPSS 22.0 版。

2 結果與分析

2.1 質譜條件優化

采用0.5 μg/mL 的標準溶液，在負離子模式下全掃描質譜得到各目標物一級碎片離子，優化去簇電壓，對母離子進行二級質譜掃描，得到子離子特征碎片質譜圖，選擇響應值高、基線噪聲低的兩對離子對作為定性和定量離子對，進一步優化碰撞能量及其他質譜參數，得到最優的質譜條件。

2.2 色譜條件優化

比較了Agilent Poroshell SB-a（q100 mm×2.1 mm，2.7 μm）、Agilent Poroshell SB-C18（100 mm×2.1 mm，2.7 μm） 和Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（150 mm×2.1 mm，1.8 μm）。結 果 表 明，Poroshell SB-aq 和Poroshell SB-C18兩根色譜柱未能有效分離出12 種酚酸化合物，且兩根色譜柱的色譜峰響應和峰型較差，Eclipse Plus C18色譜柱分離較好，峰形尖銳，且各物質的響應值均高于另外兩根色譜柱。考察了水相中加入甲酸、乙酸及甲酸銨對目標物離子化效率和靈敏度的影響，結果表明，0.1%乙酸溶液對目標物的分析靈敏度最好。進一步考察以甲醇和乙腈為有機相，甲醇條件下目標物相應增加但對于異綠原酸A、B 和C 3 種同分異構體分離較差。因此，選用0.1%乙酸溶液和乙腈為流動相。采用梯度洗脫程序，12 min 內，各物質能較好分離，圖1 為12 種酚酸標準溶液總離子流圖。

圖1 混合標準溶液總離子流圖

2.3 前處理優化

選取超純水、甲醇和乙醇作為提取溶劑，結果發現采用超純水對目標物提取效率低于甲醇和乙醇提取溶劑的提取率。在此基礎上，進一步對比不同比例的甲醇溶液和乙醇溶液的提取率。結果表明，使用80%甲醇溶液為提取溶劑時提取效率最好。實驗前期對超聲提取和渦旋振蕩提取時間進行考察。因此，本實驗選用體積分數80%甲醇溶液超聲提取15 min，渦旋振蕩提取30 min 作為樣品提取方法。

2.4 方法學驗證

2.4.1 標準曲線

使用配制的系列標準工作液，以標準溶液質量濃度對峰面積做標準曲線（見表2）。結果表明，12種酚酸在0.02 ～10.00 μg/mL，線性關系良好，相關系數r＞0.991，適用于定量分析。

表2 標準曲線方程

2.4.2 重復性試驗

稱取同一茶葉樣品6 份，依據建立的前處理和儀器分析方法，計算12 種酚酸含量及RSD，結果如表3 所示。RSD 在0.3%～6.4%，均小于10%，說明方法具有良好的重復性。

表3 重復性試驗

2.4.3 穩定性試驗

用同一供試品溶液分別在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h 和24 h 時進樣分析，計算各酚酸含量及RSD 值，結果見表4。RSD 在1.5%～8.4%，說明樣品保存在4 ℃、24 h 內具有良好的穩定性。

表4 穩定性試驗（n=3）

2.5 Bayes 判別分析

使用12 種酚酸含量對3 個地區的綠茶進行Bayes 判別分析，結果見表5。結果表明，13 個都勻綠茶樣品判別率為61.5%，24 個湄潭綠茶樣品判別率為79.2%，23 個雷山綠茶樣品判別率為30.4%，判別圖總判別56.7%。因此，使用12 種酚酸含量對3個產地的判別效果不佳。

表5 茶葉分類判別結果

3 結論

采用超高效液相色譜-串聯質譜儀對3 個地區綠茶中12 種酚酸化合物的含量進行測定，12 種酚酸化合物在質量濃度范圍內的相關系數r＞0.991，重復性和穩定性均小于10%。都勻、湄潭、雷山3 個產地的綠茶中酚酸類物質的含量存在明顯差異，說明茶葉產地的不同可能會導致酚酸類物質的含量差異。使用12 種酚酸含量對不同產地的綠茶進行Bayes 判別，結果表明，3 個地區綠茶的總判別率56.7%，說明使用12 種酚酸含量能對綠茶的產地進行一定的判別，但判別效果不佳，無法完全區分。本研究為茶葉的化學分類提供了一定參考，后續研究應進一步加大樣本量，根據現有成果增加更多的分析判別方法對茶葉中多種酚酸進行比較與驗證，并考慮結合茶葉中兒茶素、咖啡堿等成分進行判別分析。