2型糖尿病患者血漿miR-320b表達變化及其與糖代謝指標的相關性

邸亞男，馬思思，陳彩鳳，王志勇，王晉星一，汪峰

1 貴州醫科大學第二附屬醫院，貴州黔東南州 556000；2 北京大學第三醫院檢驗科；3 泰興市人民醫院內分泌科；4 泰興市人民醫院檢驗科

糖尿病已成為威脅全球人類健康最重要的非傳染性疾病之一，我國更是已成為糖尿病患者增長最快的國家。據統計，我國糖尿病平均患病率為9.7%～11.6%，在某些省份甚至高達22.1%［1］。其中，2 型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）占90%～95%［2］。然而，目前T2DM 尚缺乏早期診斷指標。微小RNA（miRNA）是一類非編碼內源性小分子RNA。越來越多的研究［3］證實，miRNA 是脂代謝和葡萄糖代謝的關鍵調節因子，有望成為糖尿病的診斷和治療新靶點。課題組前期通過miRNA 芯片研究發現，在健康對照者、T2DM 前期患者和T2DM患者血漿中miR-320b水平依次降低，且ROC曲線顯示其具有良好的診斷價值［4］。為了深入了解miR-320b 在T2DM 中的應用價值，本研究觀察了T2DM患者血漿中miR-320b 的表達變化，并分析其與糖代謝指標相關性，為T2DM的早期診斷提供線索。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2019 年9 月—2020 年9 月于蚌埠醫學院附屬泰興市人民醫院慢病科就診的T2DM 患者30 例，記為T2DM 組；選取同期確診的T2DM 前期患者29 例和體檢健康者30 例，分別記為T2DM 前期組和健康對照組。T2DM 前期和T2DM 診斷符合中國T2DM 防治指南（2017 版）公布的相關診斷標準。T2DM 前期組和T2DM 組納入標準：空腹血糖（FPG）≥7.0 mmol/L 和/或口服葡萄糖耐量試驗（OGTT）2 h 血糖≥11.1 mmol/L 者為T2DM 患者，6.1 mmol/L≤FPG＜7.0 mmol/L 者為T2DM 前期患者。排除標準：有T2DM 史或服用降糖藥物史、急慢性炎癥史、嚴重肝腎功能障礙及心臟疾病史、高血壓、精神心理疾病、懷孕者及其他內分泌疾病患者。T2DM 組男16 例、女14 例，年齡49（43，54）歲；T2DM 前期組男17 例、女12 例，年齡49（32，56）歲；健康對照組男17 例、女13 例，年齡44（41，51）歲；三組間性別、年齡等基本資料具有可比性。

1.2 三組受檢者血漿中miR-320b檢測 采用qRTPCR 法。取三組受檢者清晨空腹靜脈血，分離得到血漿后，采用TRIzol 總RNA 提取試劑進行樣本RNA提取，實驗操作嚴格按產品說明書進行；使用Nano-Drop?ND-2000 測定所提取RNA 濃度和純度，確保其純度A260/A280 在1.8～2.1 間。利用變性瓊脂糖凝膠電泳觀察RNA 完整性。用miRNA cDNA 第一鏈合成試劑進行反轉錄，首先利用Poly（A）Polymerase（E. coli）對miRNA 進行加尾，之后對修飾后的miRNA 在反轉錄酶作用下進行反轉錄以合成cDNA 第一鏈。以cDNA 第一鏈為模板，按說明書配置qRT-PCR 反應體系，cDNA 2 μL，上下游引物各0.5μL，2×Master Mix 10μL，加純水至20μL。按以下程序在熒光定量PCR 儀上進行檢測：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火和延伸40 s，40個循環；擴增循環結束后，降溫至60 ℃，然后加熱升溫至95 ℃變性DNA 產物。以U6 作為內參，引物序列如下：miR-320b 上 游 引 物 為5′-AAAAGCTGGGTTGAGAGGGCAA-3′，下游引物為5′-GGCCAACCGCGAGAAGATG-3′；U6 上 游 引 物 為5′-CTGCGCAAGGATGACACGCAAATT-3′，下 游 引 物 為5′-GGCCAACCGCGAGAAGATG-3′。以2-ΔΔCt表示血漿中miR-320b的相對表達量。

1.3 三組受檢者糖代謝指標檢測 取三組受檢者清晨空腹靜脈血，分離得到血漿后，采用葡萄糖氧化酶法在日立7180 全自動生化分析儀上檢測FPG，采用高效液相離子交換色譜法在糖化血紅蛋白全自動分析儀上檢測糖化血紅蛋白（glycated hemoglobin，HbA1c），采用化學發光方法在羅氏E601 電化學發光免疫分析儀上檢測空腹胰島素（FINS）。根據FPG和FINS 值計算胰島素抵抗指數（HOMA-IR）、胰島β細胞功能指數（HOMA-β），以評估患者胰島素抵抗情況和胰島β 細胞功能。HOMA-IR=FPG×FINS/22.5，HOMA-β=（20×FINS）/（FPG-3.5）。

1.4 統計學方法 采用MedCalc15.2.2 軟件。計量資料呈非正態分布時以中位數（四分位數）［M（P25，P75）］表示，多組間比較用Kruskal-Wallis 檢驗，兩兩比較用Post-hoc analysis 檢驗；相關性分析用Spearman 相關分析法。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組受檢者血漿中miR-320b 相對表達量比較 T2DM 組、T2DM 前期組、健康對照組血漿中miR-320b 相對表達量分別為0.148（0.076，0.394）、0.447（0.080，0.926）、3.820（1.894，6.720），兩兩比較，P均＜0.05。

2.2 三組受檢者糖代謝指標比較 三組受檢者糖代謝指標比較見表1。由表1 可知，T2DM 組、T2DM前期組受檢者血漿中FPG、HbA1c 水平及HOMA-IR均 高 于 健 康 對 照 組（P均＜0.05），FINS 水 平 及HOMA-β 均低于健康對照組（P均＜0.05）；且T2DM組受檢者血漿中FPG、HbA1c 水平均高于T2DM 前期組（P均＜0.05），FINS 水平低于T2DM 前期組（P＜0.05）。

表1 三組受檢者糖代謝指標比較［M（P25，P75）］

2.3 三組受檢者血漿中miR-320b 相對表達量與糖代謝指標的相關性 Spearman 相關性分析結果顯示，三組受檢者血漿中miR-320b 相對表達量與HOMA-IR 負 相 關（r=-0.263，95%CI為-0.448～-0.056 7，P=0.013 3），與HOMA-β正相關（r=0.494，95%CI為0.317～0.638，P＜0.01），與FPG、HbA1c、FINS均無關（P均＞0.05）。

3 討論

T2DM 是影響我國國民健康的重要慢性疾病之一，其防治至關重要。然而，對于T2DM，傳統的診斷方式通常依賴于糖代謝指標如FPG、OGTT 實驗和HbA1c 等，但當糖代謝指標異常時，患者往往已經存在胰島素抵抗和/或胰島β 細胞損傷，影響其早期診斷［5］。另外，這些常規指標并不能評估糖尿病相關并發癥的發生風險。因此，尋找T2DM早期診斷和預測病情發展的生物標志物顯得十分重要。

miR-320 家族具有高度的保守性，僅存在于脊椎動物中，該家族包括5個成員，分別為miR-320a、miR-320b、miR-320c、miR-320d 和miR-320e［6］。文獻報道顯示，miR-320 與多種脂代謝和糖代謝相關疾病如動脈粥樣硬化［7］、糖尿病腎病［8］、糖尿病心肌損傷［9］等有關。miR-320b 基因位于人類1 號染色體上［10］。本研究結果顯示，miR-320b 在健康對照者、T2DM 前期患者和T2DM 患者血漿中的表達水平依次降低，與前期研究結果一致［4］。進一步相關性分析發現，血漿miR-320b 水平與HOMA-IR 呈負相關，與HOMA-β 呈正相關。以上結果提示，miR-320b 可能通過影響胰島β 細胞功能和胰島素抵抗在T2DM 的發生發展中起著重要作用，并且可能作為T2DM 早期診斷生物標志物和治療靶點。

然而，關于miR-320 在糖尿病時的水平變化，目前的研究結果并不完全一致。一項前瞻性研究［11］顯示，在糖尿病前期患者和T2DM 患者血漿中miR-320水 平 較 低，且 聯 合miR-15a、miR-126、miR-223和miR-28-3p 等miRNA 能較為準確的區分T2DM 患者和對照者。李華等［12］研究發現，老年人群T2DM患者的循環miR-320 水平較對照者低。孫志兵等［13］研究發現，T2DM 患者視網膜病變時時血清miR-320表達降低，且與病程進展及糖脂代謝指標相關，是發生糖尿病視網膜病變的危險因素。但是也有研究［14］發現，T2DM 患者的循環miR-320 水平較對照者高，且與空腹血糖呈正相關。遺憾地是，我們的研究中未發現miR-320b 與FPG 具有顯著相關性。LING等［15］研究發現，與正常脂肪細胞相比，在胰島素抵抗的3T3-L1脂肪細胞中miR-320表達上調。產生這種差異的原因可能是研究中所用的策略和方法不同，所用到的樣本量較小，且研究人群具有差異。例如有些研究中，將同一組的樣本混合后一起檢測，這樣可能導致某一樣本水平的異常增高或降低導致了整組樣本的改變。因此，有必要開展大樣本量的前瞻性研究進一步確定miR-320b 是否能夠作為糖尿病的診斷標志物。

綜上所述，與體檢健康者和T2DM 前期患者相比，T2DM 患者血漿中miR-320b相對表達量降低；血漿miR-320b 相對表達量與糖代謝指標HOMA-IR、HOMA-β 相關，miR-320b 可能作為T2DM 早期診斷及病情進展檢測的生物標記物，但需要進一步大樣本量前瞻性性研究確證。