pSS患者外周血和唇腺組織中差異表達基因生物學功能分析、關鍵基因篩選及唇腺組織中免疫細胞變化觀察

饒鈺君，田龍龍，2，張勇斌，閔星星，2，陳桂玉，2，李國青

1 揚州大學附屬醫院風濕免疫科，江蘇揚州 225000；2 大連醫科大學研究生院

原 發 性 干 燥 綜 合 征（primary Sj?gren’s syndrome，pSS）是一種以淋巴細胞增殖和進行性外分泌腺損傷為特征的慢性系統性自身免疫?。?-2］。pSS的發生發展與遺傳、環境、免疫機制等因素相關，但目前其確切發病機制尚未闡明，臨床治療中多為經驗性用藥以延緩病情。因此，深入探索pSS 的發病機制和發現更多可靠的診斷及預后評估標志物，對pSS 患者的預后改善極其關鍵。生物信息學是分子生物學與信息技術相結合的一門交叉學科，對揭示疾病的分子機制具有重要意義。基因芯片作為其中一種新興技術，被用于高效地獲取生物信息和疾病表達譜數據，為理解疾病發生的機制提供可供選擇的 思 路［3］。 NCBI GEO（Gene Expression Omnibus，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）數據庫是一個儲存芯片、二代測序以及其他高通量測序數據的數據庫。本研究從GEO數據庫下載pSS患者與健康人的微陣列數據集［4］，從中篩選出與疾病相關的差異表達基因，并利用STRING 數據庫對差異表達基因進行功能富集分析，獲得關鍵調控基因及其富集的信號通路、分子功能及生物學過程，篩選調控pSS 發生發展的關鍵基因，還采用CIBERSORT算法初步評估pSS 患者唇腺組織中22 種免疫細胞浸潤情況，并進一步分析不同類型免疫細胞之間的相關性，旨在確定pSS 外周血和唇腺組織中潛在的生物標志物并評估其免疫細胞浸潤情況，為pSS 的精準診斷和分子機制研究提供生物信息學理論參考。

1 材料與方法

1.1 pSS相關基因表達譜數據的選取及預處理 選取GEO 數據庫收集的pSS 相關基因表達譜芯片GSE51092，該芯片基于GPL6884 平臺（Illumina HumanWG-6 v3.0 expression beadchip），包括190例pSS患者和32 例健康人的外周血和唇腺組織中mRNA表達譜［5］。利用R 軟件（版本4.0.3，https：//www.rproject.org/）讀取該數據集的原始數據，運用穩健多陣列均數算法進行背景校正和數據歸一化。所有數據來自網上公開數據庫，未涉及任何在人體或動物身上進行的實驗。

1.2 pSS 患者外周血和唇腺組織中差異表達基因的生物學功能分析、發生發展關鍵調控基因的篩選

1.2.1 pSS 患者外周血和唇腺組織中差異表達基因的篩選 通過R 軟件的Limma 包，設置|logFC|＞0.5 和P-value＜0.05 為 篩 選 閾 值，篩 選pSS 患者與健康人外周血和唇腺組織中的差異表達基因。

1.2.2 pSS 患者外周血和唇腺組織中差異表達基因的生物學功能分析 包括基因本體論（Gene ontology，GO）功能富集分析、基于京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）信號通路富集分析、基因集富集分析（Gene set enrichment analysis，GSEA）。其中，GO 功能富集分析是對基因進行注釋和生物學過程分析的重要工具，分為生物學過程、分子功能和細胞組分三方面。KEGG 信號通路富集分析是用于從大規模分子數據集中了解基因的富集通路。使用R 軟件的cluster-Profiler 包對其進行GO 和KEGG 富集分析，P＜0.05認為有統計學意義。GSEA 用來評估一個預定義的基因集中基因表達量的變化是否有某些特定的基因集合的傾向性［6］，判斷基因集里面的成員在基因列表里是隨機分布還是主要聚集在列表的頂部或底部，若聚集在在列表頂部或底部，則說明此基因集成員對表型的差異有貢獻。GSEA 一般以NOMP-value＜0.05、FDR q-value＜0.25、|NES|＞1 作為顯著富集的篩選標準。

1.2.3 pSS 發生發展關鍵調控基因的篩選 通過STRING 數據庫構建差異表達基因的蛋白互作網絡（Protein-protein inter- action，PPI）（score＞0.4），然后利用Cytoscape 軟件（www. cytoscape. org/）的Cytohubba 插件，選取連接度值排序前10 的差異表達基因，即為可能參與pSS 發生發展的關鍵調控基因。

1.3 pSS 患者唇腺組織中免疫細胞變化情況觀察 免疫細胞浸潤分析是針對組織中不同免疫細胞的浸潤程度差異，分析其與疾病的進展和預后之間的相關性。使用R語言程序并鏈接基于線性支持向量回歸的CIBERSORT 反卷積算法，對已獲標準化處理的全基因RNA-Seq 表達矩陣與免疫細胞表達矩陣進行融合分析，對T 細胞、記憶和原始B 細胞、活化和靜止NK 細胞等22 種免疫細胞的細胞占比進行預測評估，以細胞占比表示免疫細胞浸潤情況［7］。隨后采用Pearson 相關分析法分析各類免疫細胞間的相關性，并觀察pSS 患者和健康人之間的免疫細胞占比差異。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 pSS患者外周血和唇腺組織中差異表達基因的生物學功能分析、發生發展關鍵調控基因篩選結果

2.1.1 pSS 患者外周血和唇腺組織中差異表達基因的篩選結果 篩選出282個差異表達基因，包括165個上調基因和117個下調基因，上調的基因有RNF36、STAT1、PARP9、EPSTI1、STAT2、MAFB、IFIH1、TTYH3、GBP1、TDRD7、IFI44、PARP12、CXCL10、GBP5、CEACAM1、PARP14、XAF1、RSAD2、TTC21A、LY6E、IFI44L、DDX58、SP140、PML、IFIT3、IL15、ATF3、IFIT2、ISG15、IFITM3、MT1A、BATF2、IFI27、OTOF、MUC1、TOP2A、CCL8、CHMP5、MX1、HES4、NEXN、AGRN、GPD2、CCR1、MASTL、OAS2、IFI6、FANCL、SCO2、VRK2、MERTK、OAS1、CCL2、HESX1、PCGF5、USP18、INCA、IRF7、PGAP1、CCNA2等，下調的基因有NRCAM、MMP28、FBLN2、CD248、IMPA2、ASF1B、THRA、ARL3、FEZ1、MATK、F8A3、FGF9、CAPN5、HGD、LRRN3、ALPL、RASD1、TKTL1、FCGBP、TLE2、COLQ、RFX2、ATG9B、PTGDS、GPR77、CXCR6、CLIC3、MPZL1、SIRPB2、SDK2、CYP2S1、EDAR、FBXO9、TGM3、CXCL5、AK5、VWCE、RPL3L、MICAL2、COCH、COL6A2、PFN2、THBD、CD8B、DSC1、HOMER2、CD8B1、AXIN2、CTDSPL、CRAT等。

2.1.2 pSS 患者外周血和唇腺組織中差異表達基因的生物學功能分析結果 GO 功能富集分析結果顯示，pSS 外周血和唇腺組織中差異表達基因在生物學過程體現在病毒應答、病毒防御應答、Ⅰ型干擾素（IFN）信號通路、病毒基因組復制、IFN-γ 介導的信號通路等過程上；分子功能變化主要集中在雙鏈RNA 結合、翻譯調節活性、NAD+ADP-核糖轉移酶活性等功能上；而在細胞組分上的改變無顯著的富集結果。KEGG 信號通路富集分析發現，顯著富集的信號通路包括冠狀病毒（COVID）-19、人乳頭瘤病毒感染、甲型流感、丙型病毒性肝炎、EB 病毒感染、麻疹、NOD 樣受體信號通路、急性髓系白血病等。GSEA 分析結果顯示，差異表達基因富集在免疫反應通路，包括對病毒的防御反應、對IFN-γ 的應答、RIG-I樣受體信號通路、調控破骨細胞分化等通路。

2.1.3 pSS 患者發生發展關鍵調控基因的篩選結果 構建的PPI 網絡由259個節點和1 025個邊組成，其中連接度值前10 的差異表達基因為STAT1、IRF7、CXCL10、MX1、ISG15、IFIT3、IFIH1、OAS1、OAS2、IFIT2（圖1）。

圖1 CytoHubba插件篩選出的參與pSS發生發展的關鍵調控基因

2.2 pSS 患者唇腺組織中免疫細胞變化情況 pSS患者唇腺組織中細胞占比較高的免疫細胞類型分別是M2 巨噬細胞、M0 巨噬細胞、M1 巨噬細胞、幼稚B細胞、活化的CD4+T 細胞、活化的NK 細胞、調節性T 細胞（Treg）、靜息的肥大細胞，其中活化的NK 細胞與CD8 + T 細胞的細胞占比呈正相關關系（r=0.44，P＜0.05），活化的記憶CD4 + T 細胞與Treg 的細胞占比呈負相關關系（r=-0.54，P＜0.05）。與健康人相比，pSS 患者唇腺組織中活化樹突狀細胞（DC）的細胞占比顯著增加（P＜0.001），CD8+T細胞的細胞占比顯著降低（P=0.038）。

3 討論

pSS是一種病情雜糅、癥狀多樣的自身免疫性疾病，臨床上缺乏敏感、特異的診斷指標，通常基于病理檢測聯合影像技術確診，此時大多數患者病情已進展，往往失去最佳治療時機，導致預后不良。因此，需要不斷探索其發病機制，尋找診斷的特異性標志物和精準治療的靶點，這對改善pSS 患者的預后至關重要。

本研究從GEO 數據庫下載了pSS 表達譜數據，共鑒定了282個差異表達基因，并對其生物學功能和信號轉導途徑進行功能分析。GO 富集主要包括病毒應答、病毒防御應答、Ⅰ型IFN 信號通路、病毒基因組復制、IFN-γ 介導的信號通路、雙鏈RNA 結合、翻譯調節活性、NAD+ADP-核糖轉移酶活性等；KEGG 分析發現顯著富集的通路包括COVID-19、人乳頭瘤病毒感染、甲型流感、丙型病毒性肝炎等，其中關于COVID-19 通路的結果提示pSS 的疾病狀態可驅動或增加COVID-19 的易感性。目前已有多中心研究支持自身免疫性疾病患者表現出更高的COVID-19 患病率和病情惡化風險［8-9］。另外，GSEA分析將常規GO/KEGG 分析中容易遺漏的差異表達不顯著卻有重要生物學意義的基因包含在內，挖掘出更多的具有生物學意義的信息，其結果表明基因集與病毒防御應答、對IFN-γ 的應答、RIG-I 樣受體信號通路等相關。以上結果均提示了病毒感染和多種免疫反應等信號通路與pSS 的發生發展密切相關，而這些富集的信號通路也可能是pSS 患者的免疫治療評估中的關鍵因素，為pSS 的治療提供新思路。

本研究篩選出的10個pSS發生發展關鍵調控基因排序如下：STAT1、IRF7、CXCL10、MX1、ISG15、IFIT3、IFIH1、OAS1、OAS2、IFIT2。STAT1 是Ⅰ型IFN信號通路關鍵的轉錄激活因子，通過酪氨酸和絲氨酸殘基的磷酸化而激活，指導IFN 調節基因的轉錄，參與細胞生長、分化及凋亡［10］。STAT1 被激活后可增加體內活性氧含量而引起肺纖維化，因此pSS 患者因活性氧明顯增多，容易繼發間質性肺?。?1］。IRF7 是IFN 依賴性免疫應答的調節因子，介導多種免疫相關細胞的I 型IFN 反應，誘導IFN-α 和其他促炎細胞因子的轉錄。ISG15為IFN刺激基因，參與介導I 型IFN 通路的活化和傳導而發揮抗病毒作用。MX1 則受IFN 調節，通過抑制病毒基因組復制、翻譯、抑制出芽等途徑發揮抗病毒作用，其基因表達與pSS 疾病活動相關，有望成為潛在的生物標志物［12］。IFIT3、IFIT1 以及IFIT2 屬于IFN 誘導蛋白家族，參與抗病毒免疫反應［13］。OAS1、OAS2 則是在IFN 誘導下編碼抗病毒反應的必需蛋白，其水平升高可激活核糖核酸酶L，誘導病毒分解［14］。最后，趨化因子配體10（CXCL10）是一種B細胞穩態趨化因子，在淋巴組織發育和調節免疫細胞運輸中發揮關鍵作用，其表達上調可促使生發中心形成和增加淋巴細胞浸潤程度，以加速pSS 疾病進展。研究［15］發現，CXCL10 與pSS 的口眼干燥和高蛋白血癥有關，可能是體現pSS 疾病活動性的生物標志物?？傊鲜龌蚧虻鞍追肿又饕婕傲丝共《靖腥竞兔庖哒{節兩方面，這提示了pSS 的發生發展與病毒感染引起的免疫反應密切相關，也為我們更深刻地認識pSS 的發病機制以及研究pSS 潛在治療靶標提供了有價值的線索。

從免疫系統的角度評估不同類型免疫細胞間的浸潤差異及動態調節，對闡明pSS 發病的分子機制和開發新的免疫治療靶點具有重要價值。免疫細胞浸潤的類型和比例與臨床結果密切相關，其不僅對患者的生存具有預測價值，還可作為藥物靶標來提高患者的預后，影響治療效果。組織中某種免疫細胞相對含量升高時，可針對該免疫細胞進行個性化的用藥，從而提高疾病的診治水平。CIBERSORT 是一種分析工具，可基于標準化處理后的基因芯片表達譜數據來估算組織中的22 種免疫細胞種類和相對含量，且能量化組織中特定細胞類型的豐度。它使用RNA-seq 數據來評估免疫細胞的表達，并從樣本中獲得不同的免疫細胞比例。該工具在白細胞亞群和惡性腫瘤預后基因的應用中相當成熟，現如今也被用于分析風濕免疫性疾病的免疫細胞浸潤情況，如狼瘡性腎炎、特應性皮炎、骨關節炎等［16-18］。本研究采用CIBERSORT 反卷積法對pSS 的免疫細胞間的相關性進行分析，得出活化的NK 細胞與CD8+T 細胞呈正相關關系，活化的記憶CD4+T 細胞與Treg 呈負相關關系，側面反映不同免疫細胞之間在pSS 的病程進展中存在協同或拮抗作用。但是因為目前暫無大規模的基礎研究對不同類型免疫細胞之間的相關性進行驗證，此預測僅具有一定的參考價值。

我們對pSS 患者合計健康人的免疫細胞浸潤水平進行比較，發現pSS 患者較健康人的外周血和唇腺組織中活化DC 的浸潤比例明顯增加（P＜0.001），提示了DC 浸潤在pSS 免疫病理中起關鍵作用。以往DC 一直被認為是體內唯一的抗原提呈細胞，而參與pSS 發病的免疫病理過程相關報道較少，其作用被低估。相關研究［19］發現，DC 可產生大量I 型IFN，并刺激MHC Ⅰ和Ⅱ類分子、共刺激分子、趨化因子及其受體的表達，誘導B 細胞成熟和分化成漿細胞。其中，漿細胞樣DC 能在被Toll樣受體識別病毒核酸時迅速產生高達1 000 倍于其他細胞的Ⅰ型IFN［20］，而B 細胞衍生的自身抗體則刺激DC 產生Ⅰ型IFN、自身抗原而驅動免疫反應，從而形成一個以Ⅰ型IFN 為中心的包含先天系統和適應性系統的正前饋環路［21］?？梢奍FN 通路的失調是pSS 重要的特征之一，而DC 的穩態也與全身自身免疫的疾病狀態直接相關。

另外，本研究還發現pSS 患者較健康人的CD8 + T 細胞浸潤比例相對減少，但差異變化并不明顯（P=0.038），這與以往相關研究并非完全一致。研究［22］報道，CD8 + T 細胞在pSS 患者外周血中明顯減少，推測CD8 + T 細胞減少可通過其對病毒感染的控制而促進pSS 的發展。但也有研究［23］報道，CD8 + T 細胞在自身免疫性疾病中浸潤增加，可促使炎性細胞因子分泌、扭曲分化曲線以及阻擋呼吸暫停等途徑，從而促進疾病的發生。考慮本研究的CIBERSORT 分析基于有限的基因數據，可能會造成檢驗效能偏低，需更大樣本去驗證CD8 + T 細胞的浸潤情況。有關其他免疫細胞相關研究［24］發現，CD4 + T 淋巴細胞在腺體組織中浸潤比例較高，與pSS 疾病活動和病灶積分密切相關。Th1/Th2 細胞在機體內相互制約，若比例失衡將促進炎癥反應，如分泌IL-4、IL-6、TNF-α、IFN-γ等細胞因子，激活Fas/Fas-L 信號通路，刺激淋巴細胞浸潤，導致唾液腺分泌功能破壞、靶器官進一步損害。Treg 則是分泌IL-10、TGF-β 等抑制性細胞因子而發揮維持機體免疫平衡作用。若通過增加體內Treg 含量而抑制炎癥因子表達也不失為一種治療pSS 的方法［25］?？梢姡@些免疫細胞浸潤差異、不同亞群間的密切聯系及相互轉化等，可導致免疫系統失衡，造成組織損傷。未來能否針對某一類細胞亞群作為發病機制研究或治療靶標，還需更多研究支持。

本研究尚有不足之處。一是納入的基因芯片樣本量有限，容易造成誤差，可進一步增加GEO 芯片數據或聯合其他數據庫進行分析；二是CIBERSORT 算法是基于有限的遺傳數據，導致免疫浸潤評估時出現偏倚，仍需進一步體外培養或動物實驗驗證。今后課題組的相關工作將基于生物樣本進行實驗研究，以驗證本研究結果的準確性，并進一步探討關鍵基因和免疫浸潤之間的調控關系。

綜上所述，與健康人相比，pSS 患者外周血和唇腺組織中有282個差異表達基因；差異表達基因與病毒感染、I 型IFN 信號通路傳導、對病毒的防御反應等免疫反應通路有關，STAT1、IRF7、CXCL10等10個基因可能是pSS 發生發展的關鍵調控基因。pSS 患者唇腺組織中活化的NK 細胞與CD8 + T 細胞的細胞占比正相關，活化的記憶CD4 + T 細胞與Treg 的細胞占比負相關；與健康人相比，pSS 患者唇腺組織中活化DC 的細胞占比增加、CD8+T 細胞的細胞占比降低。本研究為pSS 診斷生物標志物的開發和免疫靶標治療研究提供了一些新思路和方向，為pSS 發生發展的分子機制研究提供新的見解。