檢測B 細胞成熟抗原的噬菌體展示單鏈抗體實時熒光定量免疫PCR方法建立

康子茜，王加利，和似琦，崔鑫銘，石冰潔，王建勛

北京中醫藥大學生命科學學院，北京102488

多發性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是一種克隆漿細胞異常增多的惡性疾?。?］。近年來，MM患者面臨的治療選擇越來越多樣化，找到一種快速準確地監控治療效果的方法非常重要。目前，MM 患者的荷瘤狀態是通過監測單克隆蛋白（M蛋白）和血清游離輕鏈水平來評估的，這兩項指標都衡量了惡性漿細胞克隆產生的全部或部分抗體。然而M 蛋白的變化水平緩慢，免疫球蛋白在體內的半衰期很長，這就意味著檢測疾病狀態變化需要很長時間；M蛋白與血清游離輕鏈這兩項指標在患者腎功能衰竭時則不能準確評估，而腎功能衰竭是MM 患者的常見并發癥，這就限制了很多患者的應用。這些患者只能選擇更具侵入性和更昂貴的程序進行監測，例如PET-CT檢查，然而這項檢查并不能經常進行。這些項目的限制性產生了對監測MM 患者狀態的新的血清標志物的需求［2-3］。B 細胞成熟抗原（B cell maturation antigen，BCMA）是腫瘤壞死因子受體超家族的成員，可通過B 細胞激活因子（B cell-activating factor，BAFF）和增殖誘導配體（a proliferation-inducing ligand，APRIL）的信號轉導促進漿細胞的存活和增殖［4］。BCMA 在惡性漿細胞上的選擇性高表達使其成為治療MM 的理想靶抗原。研究［5］發現，血清BCMA 水平是監測MM 患者病情和總生存期的一個新 的 生 物 標 志 物。2020 年12 月10 日—2022 年1 月1 日，我們構建了一種基于噬菌體展示單鏈抗體的實時熒光定量免疫PCR（phage display real time-immuno polymerase chain reaction，PDRT-IPCR）檢 測BCMA的新方法，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 試劑、儀器 BCMA 抗原標準品購自美國ACRO Biosystems 公司，M13KO7 輔助噬菌體購自成都仁域生物技術有限公司，抗BCMA 抗體基因片段ANTI-BCMA、抗CD19 抗體基因片段ANTI-CD19 由本實驗室合成保存；E. coliDH5α 感受態細胞購自TIANGEN 生化科技（北京）有限公司，Pyrobest DNA Polymerase 購自TaKaRa 公司，DL 2000 DNA Marker、ELISA 包被液、5%BSA 封閉液購自北京索萊寶科技有限公司，高吸附酶標板購自美國康寧公司，SYBR熒光定量PCR試劑盒、Easy Geno快速重組克隆試劑盒、PEG 8000、NaCl、PBS、Tween-20 均購自北京蘭博利德商貿有限公司。HQL150B 大幅度恒溫搖床購自上海智城分析儀器制造有限公司，CFX96 real time PCR 儀、T100TM型PCR 儀、ChemiDocTMMP Imaging System 購自美國Bio-Rad 公司，超微量分光光度儀購自美谷分子儀器（上海）有限公司，DYY-6C 電泳儀購自北京六一生物科技有限公司。引物合成及測序由北京擎科生物科技有限公司完成。

1.2 重組噬菌體M13KO7-ANTI-BCMA 的制備及展示抗BCMA單鏈抗體鑒定

1.2.1 重組噬菌體質粒M13KO7-ANTI-BCMA 的構建 M13KO7 噬菌體載體缺少合適的酶切位點，故采用無縫克隆的形式將抗體片段與載體進行連接。由于完整的載體片段較大，所以將載體預先擴增為兩部分，再同抗體片段連接入噬菌體載體。根據M13KO7 的編碼序列，設計2 對引物，分別擴增M13KO7-1 和M13KO7-2 兩個片段。擴增M13KO7-1編 碼 序 列 的 引 物：M13KO7-1-F 為5′-GCGGCCGCAGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTG-3′，M13KO7-1-R 為5′-CTTCCCTGTTAAGTATCTTCCTGGCATCTTCCAGGAAATC-3′。擴增M13KO7-2 編碼序列的引物：M13KO7-2-F 為5′-GGAAGATACTTAACAGGGAAGTGAGAGGGCCGCGGCAAAGC-3′，M13KO7-2-R 為5′-TTCAGCGGAGTGAGAATAGAAAGGAACAACTAAAGGAATT-3′。采用PCR 法擴增載體片段，取擴增產物進行凝膠電泳檢測片段后，進行凝膠電泳分離并切膠回收。根據抗體ANTI-BCMA 片段與M13KO7 載體序列設計引物，ANTI-BCMA-F 為5′-CTATTCTCACTCCGCTGAAGATATCGTGCTGACACAAAGC-3′，ANTI-BCMA-R 為5′-GAGATGAGTTTTTGTTCTGCGGCCGCAGCAGCGGCGCTAGAAAC-3′。PCR擴增后進行凝膠電泳檢測片段大小，然后凝膠電泳分離并切膠回收抗BCMA單鏈抗體片段ANTI-BCMA。將M13KO7的載體片段與ANTI-BCMA片段進行無縫克隆重組，獲得重組噬菌體質粒M13KO7-ANTI-BCMA。將重組噬菌體質粒M13KO7-ANTI-BCMA轉化E.coliDH5α感受態細胞，挑取陽性克隆并測序，將測序正確克隆的菌液加甘油保存于-80 ℃冰箱。

1.2.2 重組噬菌體M13KO7-ANTI-BCMA 的制備取-80 ℃冰箱凍存的測序正確的含有重組噬菌體質粒M13KO7-ANTI-BCMA 的菌液緩慢融化，接種環蘸取菌液劃線于卡那霉素抗性的LB 平板，37 ℃培養12 h。挑取單克隆接種于10 mL 的卡那霉素抗性的2×YT液體培養基中，37 ℃、220 r/min振蕩培養12 h。培養液在4 ℃條件下3 500 r/min離心15 min以沉淀菌體，取上清液，加入總體積1/5 體積的PEG/NaCl溶液混勻，冰上靜置1.5 h，4 ℃條件下10 000 g 離心30 min，即獲得重組噬菌體M13KO7-ANTI-BCMA，棄上清液后，用1 mL PBS重懸。

1.2.3 重組噬菌體M13KO7-ANTI-BCMA 展示抗BCMA 單鏈抗體的鑒定 采用Western Blotting 法。將重組噬菌體M13KO7-ANTI-BCMA 熱變性后進行SDS-PAGE，電泳結束后進行轉膜，取出硝酸纖維素膜用TBST 漂洗后，加入含5%脫脂奶粉的TBST 封閉1 h，棄去封閉液，加入TBST洗滌2次，棄去TBST，加入用5%脫脂奶粉1∶2 000稀釋的抗噬菌體PⅢ蛋白一抗，4 ℃孵育過夜。TBST 洗膜3 次后加入羊抗鼠IgG-HRP 二抗，室溫孵育1 h，棄去二抗，TBST 洗膜3次，顯影液的A 液和B 液按照1∶1的比例混勻滴加于膜上，避光孵育2 min 顯影，使用BIO RAD ChemiDocTMMP Imaging System 凝膠成像系統曝光，觀察抗BCMA 單鏈抗體-PⅢ重組蛋白的分子量。M13KO7 噬菌體通過PⅢ蛋白與抗BCMA 單鏈抗體連接，其中M13KO7 噬菌體PⅢ蛋白分子量約為42.5 kD，抗BCMA 單鏈抗體蛋白分子量約為31 kD，若抗BCMA 單鏈抗體蛋白成功連接到M13KO7 噬菌體PⅢ蛋白上，則抗BCMA單鏈抗體-PⅢ重組蛋白分子量約為73.5 kD。

1.3 PDRT-IPCR檢測BCMA的線性范圍、最低檢測限測算 取BCMA標準品用包被液稀釋（1 000 ng/mL、100 ng/mL、10 ng/mL、1 ng/mL、0.1 ng/mL、0.01ng/mL、0 ng/mL）后，以每孔100 μL 包被96 孔高吸附酶標板，4 ℃孵育過夜。PBST（含0.05%Tween-20 的PBS，pH 7.4）洗板5 次，5% BSA 封閉，37 ℃孵育1.5 h，PBST 洗板5 次。每孔加入100 μL的1×1011copies/mL 的重組噬菌體M13KO7-ANTIBCMA，以不加噬菌體的孔為陰性對照孔，陰性對照孔添加1 000 ng/mL 的BCMA 包被。37 ℃孵育1 h，PBST 洗板5 次，每孔加入100μL 無酶水，95 ℃水浴10 min，將與BCMA 特異性結合的噬菌體熱裂解，以裂解噬菌體的DNA 作為擴增模板，進行實時熒光定量PCR。根據M13KO7 噬菌體的PⅢ蛋白基因序列設計通用引物，引物序列如下：PⅢ蛋白-F 為5′-CGTGCTGACACAAAGCCCTC-3′，PⅢ蛋白-R 為5′-ATCAGCAGAGTAGGAGGTTG-3′。PCR 反 應 體 系如下：2×Mix 10 μL，PⅢ蛋白-F（10 μmol/L）1 μL，PⅢ蛋白-R（10 μmol/L）1 μL，M13KO7-ANTI-BCMA噬菌體2 μL，ddH2O 6 μL，反應體系共計20 μL。PCR 反應條件：預變性95 ℃，2 min；變性95 ℃，15 s；退火57 ℃，30 s，39個循環；循壞后添加溶解曲線。觀察不同濃度BCMA 的實時熒光定量PCR 擴增曲線，比較最低濃度BCMA 與0 ng/mL BCMA 之間的CT 值差異，確定大致線性范圍。同時以不加M13KO7-ANTI-BCMA 噬菌體孔作為陰性對照，判斷整個實驗操作是否存在污染情況。以BCMA標準品坐濃度為橫標，CT 值為縱坐標，運用OriginPro2021軟件進行四參數Logistic擬合曲線，根據相關系數R2確定相關性最強的濃度范圍為該方法檢測的線性范圍。根據文獻［6］檢測限計算方法，以如下公式計算本方法的最低檢測限：LoD（Limit of Detection）=LoB+ 1.645（SDlowconcentrationsample），LoB（Limit of Blank）=meanblank+1.645（SDblank）。

1.4 PDRT-IPCR方法檢測BCMA的特異性驗證為驗證基于PDRT-IPCR 方法檢測BCMA 的特異性，我們同時構建并制備了展示抗CD19 單鏈抗體的重組噬菌體M13KO7-ANTI-CD19。將展示重組噬菌體M13KO7-ANTI-BCMA、重組噬菌體M13KO7-ANTICD19和噬菌體M13KO7各100μL，分別投放入包被100 ng/mL BCMA 的酶標板孔和空白孔中，分別記為BCMA 孔、空白孔，37 ℃孵育1 h，PBST 洗板5 次。每孔加入100μL無酶水，95 ℃水浴10 min熱裂解已結合的噬菌體，以其DNA 作為擴增模板，根據M13KO7噬菌體PⅢ蛋白基因設計引物，進行PDRTIPCR 反應。以M13KO7-ANTI-BCMA 噬菌體的已知濃度質粒進行10倍梯度稀釋作為標準品，以質粒拷貝數為橫坐標、CT 值為縱坐標做標準曲線，根據標準曲線換算噬菌體與BCMA 結合的實際拷貝數，比較3 種噬菌體的BCMA 孔及空白孔結合拷貝數，判斷每種噬菌體是否與BCMA具有特異性結合。

2 結果

2.1 重組噬菌體M13KO7-ANTI-BCMA 展示抗BCMA 單鏈抗體的鑒定結果 在75 kD 處有清晰的蛋白條帶，表明M13KO7 重組噬菌體PⅢ蛋白上已成功連接了抗BCMA 單鏈抗體，抗BCMA 單鏈抗體成功展示在重組噬菌體M13KO7-ANTI-BCMA表面。

2.2 PDRT-IPCR檢測BCMA的線性范圍、最低檢測限 PDRT-IPCR 檢測BCMA 的擴增曲線見圖1。由圖1 可見，隨著BCMA 包被濃度的降低，對應擴增曲線的CT值逐漸變大，當BCMA濃度降至0.01 ng/mL時，其CT值與0.1 ng/mL的擴增CT值已經非常接近，已經不具備良好的線性相關性。PDRT-IPCR 檢測BCMA 的標準曲線見圖2。由圖2 可見，PDRT-IPCR檢測BCMA的線性范圍為0.1 ng/mL～1 000 ng/mL，R2為0.999 3，最低檢測限為0.077 ng/mL。

圖1 PDRT-IPCR檢測BCMA的擴增曲線

圖2 PDRT-IPCR檢測BCMA的標準曲線

2.3 PDRT-IPCR 方法檢測BCMA 的特異性驗證結果 噬菌體M13KO7 與空白孔、BCMA 孔結合的拷貝數分別為1.91×105copies、1.44×105copies，兩者相比，P＞0.05。重組噬菌體M13KO7-ANTI-CD19 與空白孔、BCMA 孔結合的拷貝數分別為3.07×105copies、1.04×105copies，兩者相比，P＞0.05。重組噬菌體M13KO7-ANTI-BCMA 與空白孔、BCMA 孔結合的拷貝數分別為1.02×105copies、4.34×106copies，兩者相比，P＜0.01，提示重組噬菌體M13KO7-ANTIBCMA與BCMA具有特異性結合。

3 討論

目前，用于檢測腫瘤生物學標志物的方法有放射免疫分析法、化學發光免疫法、酶聯免疫吸附法、納米圓弧免疫傳感器、液體活組織檢查、分子生物學方法等［7-13］。將酶聯免疫吸附測定法與PCR 技術進行結合的免疫PCR 技術結合了兩種方法的優勢，然而也存在DNA 與抗體偶聯繁瑣耗時的缺點，進而出現了噬菌體展示介導的免疫PCR 技術。噬菌體展示技術由George P. Smith 于1985 年首次創建［14］，該技術將一段外源基因插入絲狀噬菌體的外殼蛋白基因中，使外源基因以融合蛋白的方式展示在噬菌體表面，進而通過表型篩選就能同時獲得其編碼基因［15］。噬菌體因其納米尺寸和對其結構和功能進行遺傳修飾的簡便性，使其在各種領域都發揮著巨大應用價值，近年來隨著各種新興技術的出現，噬菌體展示技術與納米金顆粒［16］、高通量測序［17］、磁流體［18］等新技術結合應用，更是對微量物質的檢測方法提供了新思路。通過對基因組進行編輯，在噬菌體的表面幾乎可以表達任何蛋白質或多肽［19］。此外，噬菌體相對較短的復制時間使大量生產成為可能［20］。噬菌體展示的檢測抗體不需要化學偶聯或生物素化，易于制備，在PBS 中加入15%甘油即可冷藏數月，具有較好的實用穩定性［21］。本研究構建的檢測BCMA的PDRT-IPCR方法將抗原抗體反應的特異性與聚合酶鏈式反應的靈敏性結合起來，噬菌體既作為檢測抗體，其攜帶的DNA 又可作為PCR 中的擴增模板，PCR 指數級的信號擴增使得此方法的靈敏度和線性范圍得到了明顯改善［22］。

本研究首先運用無縫克隆技術將抗體基因連接入噬菌體載體中，成功構建了M13KO7-ANTI-BCMA重組質粒。無縫克隆技術簡單靈活，連接陽性率高，且連接時間較酶切連接大大減少。陽性質粒測序正確后保存于大腸桿菌中，質粒在大腸桿菌胞內組裝合成噬菌體。M13KO7 噬菌體作為一種溫和噬菌體，并不會像烈性噬菌體一般將宿主菌裂解，而是會將胞內已合成的噬菌體分泌到胞外，培養過夜通過PEG/NaCl 溶液低溫沉降，即可收集到噬菌體顆粒。為了確保單鏈抗體成功連接到噬菌體尾部的PⅢ蛋白上，我們做了Western blotting 實驗檢測抗BCMA單鏈抗體與噬菌體PⅢ蛋白的融合蛋白的分子量大小，符合預期，至此已成功構建并制備出來展示抗BCMA單鏈抗體的重組噬菌體M13KO7-ANTI-BCMA。為了將該重組噬菌體應用于檢測BCMA 的實時熒光定量免疫PCR 的方法，我們對BCMA 的包被濃度進行了摸索，在低于0.1 ng/mL 設置了0.01 ng/mL BCMA，但是更低濃度的BCMA 與CT 值已不再具備線性關系，最終選取了線性相關系數最強的0.1 ng/mL～1 000 ng/mL濃度區間作為檢測的線性范圍。

為了驗證本方法檢測BCMA 的特異性，將三種噬 菌 體 M13KO7-ANTI-BCMA、M13KO7-ANTICD19、M13KO7 分別與包被100 ng/mL BCMA 孔及空白孔進行結合并進行實時熒光定量PCR 檢測CT值，同時以提取的已知濃度的M13KO7-ANTI-BCMA 質粒作為標準品進行梯度稀釋并做實時熒光定量PCR，繪制標準曲線。根據標準曲線換算三種噬菌體與每孔的結合拷貝數，分析拷貝數可知，M13KO7-ANTI-BCMA 噬菌體的BCMA 孔結合拷貝數遠大于空白孔，另外兩種噬菌體的BCMA 孔結合拷貝數略小于空白孔，可見M13KO7-ANTI-BCMA噬菌體與BCMA 的結合是特異性的，另外兩種噬菌體與BCMA 無特異性結合；另外兩種噬菌體的BCMA 孔結合拷貝數反而小于空白孔，推測是由于BCMA 的包被阻止了兩種噬菌體與板孔的非特異性結合。

綜上所述，本研究建立了基于PDRT-IPCR 檢測BCMA 的方法，該檢測方法具有檢測限靈敏、線性范圍寬、重復性高、選擇性好、準確度高、實用性強等特點，它可用于臨床診斷中對BCMA的敏感檢測，在腫瘤患者的早期階段微量生物標志物的檢測、中晚期治療效果的評定、疾病狀態的變化預后等方面都有巨大價值，也為臨床檢測BCMA 試劑盒的開發奠定了研究基礎。