黃芪治療幽門螺桿菌相關性消化性潰瘍的靶向自噬基因生物學功能分析及其核心基因篩選

仇婧玥，吳嫚婷，宋厚盼，3，喻昶，熊萌，孫啟芳，茹凱月，隆采玲，曾梅艷

1 湖南中醫藥大學中醫診斷學湖南省重點實驗室，長沙 410208；2 湖南中醫藥大學中醫學院；3 湖南中醫藥大學中醫心肺病證辨證與藥膳食療重點研究室

消化性潰瘍（Peptic Ulcer，PU）是我國是臨床常見消化系統疾病，主要分為胃潰瘍和十二指腸潰瘍，患者以中上腹部反復發作的節律性疼痛為典型癥狀。幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，Hp）感染是導致PU 的最主要原因。Hp可利用自噬機制在胃黏膜細胞與巨噬細胞中長期存活，對機體進行慢性、持續性感染。對于Hp 相關性PU 患者，根除Hp 可促進PU 愈合、降低PU 并發癥的發生率，明顯降低PU 復發率。目前用于治療Hp相關性PU的四聯療法存在服藥時間長、患者依從性差、易使人體產生耐藥性、潰瘍易復發等問題，且長期服用抑酸劑會增加胃黏膜萎縮風險，導致罹患胃癌概率增加［1］。因此，從中醫藥尋找治療Hp相關性PU的方藥成為治療該病的新思路。Hp相關性PU 在中醫中屬于為“胃痛”、“胃瘍”范疇，其病位在胃，與肝、脾相關，多由氣滯、血瘀、食滯致使胃體充血、水腫，絡瘀血敗而成，或因虛致胃黏膜失養而成。黃芪是一味溫補中藥，有補氣升陽、托毒排膿、斂瘡生肌等功效。在現代藥理學中，黃芪具有提高免疫力、抗菌、抗潰瘍等作用［2］。臨床研究［3］表明，黃芪治療Hp 陽性的PU 患者療效顯著，且安全性高、不良反應少。我們運用網絡藥理學與生物信息學方法，分析了黃芪治療Hp 相關性PU 靶向自噬基因的生物學功能，尋找黃芪治療Hp相關性PU 分子機制中可能涉及的自噬相關核心基因，為其應用于Hp 相關性PU 的臨床治療提供科學依據，為后續深入的實驗研究提供思路和參考。

1 材料與方法

1.1 黃芪有效活性成分及其靶基因的篩選 在中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP 平臺，https：//old. tcmsp-e. com/tcmsp. php）中 搜 索“黃芪”，得到黃芪的所有有效成分。以生物口服利用率（OB）≥30%且類藥性≥0.18為篩選條件，篩選得到其中活性較高的成分，記為有效活性成分；并查閱文獻，補充一些已被驗證但在篩選時未被納入的有效活性成分。基于獲得的黃芪有效活性成分，利用TCMSP 平 臺 和SwissTargetPrediction 平 臺（http：//www. swisstargetprediction. ch/index. php）預測其作用靶基因。通過UniProt平臺（https：//www.uniprot.org/）找到靶點對應的已驗證的標準人類基因名，并剔除無對應基因的靶基因。

1.2 Hp 相關性PU 顯著性差異表達基因的篩選在GEO 數據庫（https：//www. ncbi. nlm. nih. gov/geo/）中以“Helicobacter pylori”為關鍵詞檢索，選擇“Homo sapiens”為生物種類，Study Type 選擇非編碼RNA 相關的三種類型，即“Non-coding RNA profiling by array”、“Non-coding RNA profiling by genome tiling array”和“Non-coding RNA profiling by high throughput sequencing”，最 終 選 定GSE98641 數 據集［4］。該數據集實驗平臺為GPL18402，包含Hp感染胃黏膜巨噬細胞樣本6 例，正常人胃黏膜巨噬細胞樣本10例。選取其中處理時長為24小時的樣本，樣本編號為GSM2607444、GSM2607445、GSM2607446，未經Hp 處理的對照組編號為GSM2607450、GSM2607451、GSM2607452。通過R 軟件中對選取的數據集數據進行均一化處理，獲得Hp感染胃黏膜巨噬細胞與正常胃黏膜巨噬細胞的全部差異表達miRNA。在全部差異表達miRNA 中以P＜0.01 且｜log2FC｜≥2 為條件進行篩選，從中提取log2FC 最大的前五個上調miRNA 與log2FC 最小的前五個下調miRNA，獲得顯著性差異表達miRNA。在Star-Base（http：//starbase.sysu.edu.cn/index.php）、miRTarBase（https：//mirtarbase. cuhk. edu. cn）中查找顯著性差異表達miRNA 的靶基因，即為Hp 相關性PU顯著性差異表達基因。

1.3 人類自噬基因的篩選 在人類自噬數據庫（HADb 平臺，http：//www.autophagy.lu/index.html）頁面中點擊“Clustering”，篩選人類自噬基因。

1.4 黃芪治療Hp 相關性PU 靶向自噬基因的篩選 在Venny 2.1.0 平 臺（https：//bioinfogp. cnb.csic. es/tools/venny/）頁 面 中“List1”、“List2”、“List3”處分別輸入黃芪有效活性成分作用靶基因、人類自噬基因和Hp 相關性PU 顯著性差異表達基因，獲得三者的交集基因，即為黃芪治療Hp 相關性PU的靶向自噬基因。

1.5 黃芪治療Hp 相關性PU 靶向自噬基因的基因本體（GO）分析與京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析 將黃芪治療Hp 相關性PU 的靶向自噬基因輸入Metascape平臺（https：//metascape.org/gp/index. html#/main/step1）中，以最小重疊數（Min Overlap）=3、P＜0.01、最小富集數（Min Enrichment）=1.5 為條件，分別做GO 分析和KEGG 富集分析。GO 分析是從生物學過程（Biological Process，BP）、細胞組分（Cellular Component，CC）和分子功能（Molecular Function，MF）三個層面分析基因的功能，KEGG 富集分析則分析基因的相關功能與在人體內參與的代謝通路。

1.6 黃芪治療Hp 相關性PU 靶向自噬核心基因篩選 基因與基因之間存在復雜的交互網絡關系，因此黃芪既可通過直接亦可通過間接的方式作用于自噬基因，而發揮治療Hp 相關性PU 的作用。在STRING 平臺（https：//string-db.org/）中輸入黃芪治療Hp 相關性PU 靶向自噬基因，逐個勾選與黃芪治療Hp相關性PU靶向自噬基因直接或間接相關的拓展基因，構建黃芪治療Hp 相關性PU 靶向自噬基因的蛋白質互作（Protein-protein interaction，PPI）網絡，探究基因之間的相互關系。將PPI 網絡導入Cytoscape3.7.1軟件中，利用Cytohubba插件提供的MCC（Maximal Clique Centrality，最大集團中心性）算法篩選黃芪治療Hp相關性PU的靶向自噬核心基因。

2 結果

2.1 黃芪有效活性成分及其靶基因的篩選結果在TCMSP 數據庫中篩選獲得黃芪有效活性成分20個，通過查閱文獻補充已被證實的黃芪有效活性成分5個［2］，共獲得黃芪有效活 性成分25個，包括（24S）-β-谷甾醇-5-烯-3β-醇、槲皮素、白樺脂酸、華良姜素、常春藤皂苷元、異鼠李素、3，9-二-O-甲基紫檀酚、5′-羥基異月桂醇-2′，5′-二-O-葡萄糖苷、7-O-甲基糖核素、黃芪異黃烷苷、美迪紫檀素、聯苯雙酯、芒柄花素、異黃烷酮、毛蕊異黃酮、山奈酚、葉酸、異木糖醇、異木糖醇-7，2′-二-O-葡萄糖苷、1，7-二羥基-3，9-二甲氧基紫檀烯、黃芪皂苷Ⅰ、黃芪皂苷Ⅱ、黃芪皂苷Ⅲ、黃芪皂苷Ⅳ、黃芪多糖。利用TCMSP 數據庫、SwissTargetPrediction 平臺和UniProt 平臺查找黃芪有效活性成分作用靶點及其對應基因，共獲得黃芪有效活性成分的靶基因2 941個，包括E2F1、MPL、CDC25A、CA9、IL6等基因。

2.2 Hp 相關性PU 顯著性差異表達基因的篩選結果 將從數據集中均一化處理后獲得的2 027個miRNA 以P＜0.01 且｜log2FC｜≥2 為標準，篩選得顯著性差異表達miRNA 90個，其中顯著上調miRNA 55個，顯著下調miRNA 35個。最顯著的五個上調miRNA 是hsa-miR-30b-5p、hsa-miR-671-5p、hsa-miR-590-5p、hsa-miR-148a-3p、hsa-miR-28-5p，最顯著的五個 下 調miRNA 是hsa-miR-371b-5p、hsa-miR-4788、hsa-miR-4758-5p、hsa-miR-2392、hsa-miR-188-5p。在StarBase 平臺與miRTarBase 平臺中查找10個最顯著差異表達miRNA對應的靶點基因，共獲得Hp 相關性PU 顯著性差異表達基因2 109個。

2.3 人類自噬基因的篩選結果 篩選得到BIRC5、CAPN1、CASP1、CASP4、CDKN2A、CTSB、CTSD、DAPK1、EGFR、EIF2AK3等人類自噬基因232個。

2.4 黃芪治療Hp 相關性PU 的靶向自噬基因篩選結果 共獲得黃芪治療Hp相關性PU的靶向自噬基因16個，分別為MYC、CASP3、RPS6KB1、CDKN1A、CCL2、BCL2、HDAC1、RB1、IKBKB、BAX、MAPK1、TP53、MAPK8、ATIC、BCL2L1、CASP8。

2.5 黃芪治療Hp 相關性PU 靶向自噬基因的GO分析和KEGG 富集分析結果 GO 分析獲得BP 相關條目434條，主要涉及凋亡信號通路、細胞程序性死亡的正調控、有絲分裂細胞周期G1/S 的轉變、線粒體膜通透性的調節、腫瘤壞死因子的反應、對有毒物質的反應等過程；獲得CC 相關條目16 條，主要涉及線粒體外膜、轉移酶復合物、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶復合物、核膜、神經元細胞體、質膜蛋白復合物等區域；獲得MF 相關條目26 條，主要涉及蛋白質結構域特異性結合、BH3 域綁定、蛋白激酶活性、轉錄因子結合、激酶結合、細胞因子受體結合等功能。

KEGG 信號通路富集分析獲得46 條通路，其中包括多種癌癥相關通路，如癌癥的通路、鉑耐藥、胃癌、病毒致癌、p53 信號通路、PI3K-Akt 信號通路、AGE-RAGE 信號通路、ErbB 信號通路、腫瘤壞死因子信號通路等；參與調節細胞生長、分化、衰老、凋亡等生物學過程的相關信號通路，如神經營養素信號通路、鞘脂信號通路等；炎癥相關通路，如NOD 樣受體信號通路、IL-17 信號通路、Toll 樣受體信號通路、RIG-I樣受體信號通路等。

2.6 黃芪治療Hp 相關性PU 的靶向自噬核心基因篩選結果 黃芪治療Hp相關性PU靶向自噬基因的PPI網絡有314個節點、1 880條邊，MCC 算法篩選獲得TP53、CDKN1A、CCND1、CDK1、CDK2、CDK4、CCND2、E2F1、RB1、CCND3 等10個黃芪治療Hp 相關性PU的靶向自噬核心基因（圖1）。

圖1 黃芪治療Hp相關性PU的靶向自噬核心基因

3 討論

研究［5］表明，Hp 作為PU 的主要致病因素，主要利用自噬機制在機體內長期存活。Hp 感染可誘導自噬發生，并在自噬體內進行復制。自噬可降解空泡毒素（VacA）和細胞毒素相關基因A（CagA），以抑制Hp 毒性，但長期接觸VacA 可破壞自噬體。CagA可調控線粒體自噬，可能對自噬起負調控作用［6］。Hp 可通過調控microRNA 的表達，抑制自噬通路中多個核心基因的表達來抑制自噬。研究［7］顯示，Hp的鞭毛能抑制巨噬細胞的自噬以逃避清除，Hp分泌的HP0175蛋白在Hp急性感染期間可以上調自噬相關基因的表達，誘導自噬。綜上所述，自噬可降解VacA 和CagA 以抑制Hp 毒性，但Hp 長期在宿主體內存活會逐漸破壞細胞的自噬能力，使Hp及其有害產物無法被及時清除。此外，Hp 還可通過黏附作用、擾亂細胞凋亡與細胞周期及誘發炎癥反應等多種途徑誘導PU 的發生發展［8］，其對人體的持續感染會影響潰瘍瘢痕的形成，導致PU遷延難愈。黃芪是治療Hp 相關性PU 的常用中藥。現代研究［2］表明，黃芪可增強巨噬細胞的吞噬作用，并顯著抑制Hp VacA 活性［9］，但黃芪治療Hp 相關性PU 的機制與自噬的關系尚不明確。

本研究篩選出包括槲皮素、白樺脂酸、華良姜素等25個黃芪中的有效活性成分及2 941個黃芪可能靶向作用的基因，并構建黃芪治療Hp 相關性PU 靶向自噬基因的PPI網絡，在Cytohubba中篩選出10個黃芪治療Hp 相關性PU 靶向自噬核心基因TP53、CDKN1A、CCND1、CDK1、CDK2、CDK4、CCND2、E2F1、RB1、CCND3。其中TP53 是腫瘤相關基因，CDKN1A、CCND1、CDK1、CDK2、CDK4、CCND2、E2F1、RB1、CCND3都與調控細胞周期有關。

p53是TP53基因編碼的蛋白。研究［10］表明，p53可通過調控自噬對腫瘤細胞產生影響，在營養匱乏等不良因素刺激下，p53通過抑制mTOR通路促進自噬；細胞核中的p53 誘導自噬，細胞質中的p53 抑制自噬。野生型p53 蛋白可通過調控microRNA，實現抑制腫瘤、調節細胞周期、誘導細胞衰老和凋亡等功能［11］，而TP53 基因突變產生的突變型p53 蛋白不僅失去野生型p53蛋白的功能，還促進腫瘤發展，甚至進一步抑制了野生型p53 蛋白的腫瘤抑制功能，這種突變存在于超過50%的癌癥中［12］。實驗證明，TP53 基因第72 密碼子Pro/Pro 基因型可降低Hp 陽性胃潰瘍患者的Hp根除率和胃潰瘍愈合率，并可導致預后不良，增加患者的胃癌發生風險［13］。

與細胞周期調控有關的蛋白主要有三類，分別是細胞周期蛋白（Cyclin）、細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）、細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑（CKI），其中CDK 具有中心地位。各種信號通過影響Cyclin水平，使Cyclin與不同CDK結合并被激活，推動細胞周期的運行或轉換。CKI 是CDK 抑制劑，可通過與CDK 或Cyclin-CDK 復合物結合對細胞周期進行調控。這些蛋白的異常表達可能導致腫瘤發生。CDK1、CDK2、CDK4 都屬于CDK，作用于不同的細胞周期，CDK1 被發現在Hp 陽性與Hp 陰性的胃癌及癌前病變的患者中表達具有顯著差異［14］；CDK1與CDK2 可作為判斷胃癌預后的指標［15］；CDK4 的過表達可能在胃癌發生早期參與促進細胞惡性轉化［16］。

RB1 基因可對細胞周期進行負調控，參與調節細胞衰老、凋亡等過程，并抑制腫瘤的發生發展。pRB 是RB1 編碼的蛋白，是CDK 的激活底物，當細胞發生癌變時，pRB 可通過調控細胞衰老和細胞凋亡阻止惡性腫瘤的發生發展［17］。pRB 的磷酸化使E2F1 基因得以釋放。E2F1 基因被發現參與包括細胞增殖及凋亡等多個過程，且在多種惡性腫瘤中呈高表達。研究［18］表明，E2F1 的異常表達可能在胃癌發生早期促進細胞的惡性轉化，且其與p53 在胃癌的發生發展中起協同作用。同時，E2F1 可恢復被Hp VacA 抑制的樹突狀細胞的成熟過程［19］，而樹突狀細胞對胃癌患者的預后有積極作用。

CDKN1A 屬于CKI，其編碼的p21蛋白參與細胞分化、遷移、凋亡、轉錄、自噬等過程，且在不同細胞環境下常展現雙重作用。研究［20］表明，p21 可激活自噬加速癌細胞死亡，也可抑制自噬誘導正常細胞凋亡。p21 受到p53 的激活，通過與CDK 結合，阻滯細胞周期而直接抑制細胞增殖，而低濃度p21 可在癌細胞中組合、激活Cyclin D 與CDK4的復合物促進增殖。p21 在細胞核中的表達常抑制腫瘤細胞增殖與遷移，而p21 在細胞質中的高表達常幫助腫瘤細胞發揮抗凋亡增益作用。在胃癌等多種癌癥中，p21的下調與預后不良相關，而p21 的高表達常提示預后良好。

CCND1、CCND2、CCND3 屬 于Cyclin。CCND1通過促使pRB 磷酸化、釋放E2F1 來促進細胞增殖，并在幫助腫瘤細胞侵襲與轉移中發揮作用［21］。在胃癌患者中，CCND1 陽性率與Hp 感染有正相關性［22］。CCND1 還可幫助胃癌的早期診斷［16］。研究［23］表明，CCND2的表達可能導致癌變，當CCND2表達產物定位于細胞核中時，胃癌組織分化程度高、浸潤較淺，而CCND2表達產物定位于細胞質中時，胃癌組織分化程度低、浸潤強且更易發生淋巴轉移，提示預后不良。由此可見，本研究篩選出的自噬核心基因均與細胞周期、細胞凋亡的調控密切相關，提示黃芪可能通過調控自噬反應來調控細胞周期與細胞凋亡，最終起到治療Hp相關性PU的作用。

本研究對黃芪治療Hp 相關性PU 有關16個自噬基因做GO 功能富集分析，發現結果主要涉及細胞凋亡信號通路、有絲分裂細胞周期G1/S 的轉變、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶復合物、蛋白質結構域特異性結合、蛋白激酶活性等，基本與細胞凋亡、細胞周期以及炎癥等領域有關。研究表明，Hp可干擾細胞正常增殖、凋亡及細胞周期，促使細胞從G1 期進入S 期，并停滯于S 期，從而抑制細胞增殖［8］；絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶復合物（TOR）可間接對自噬產生影響［10］；炎癥反應是Hp 相關性PU 發病機制中的重要部分［24］，而黃芪可通過降低炎癥因子水平、減輕炎性細胞浸潤來發揮抗炎作用［25］。

在KEGG 通路富集分析中得到與Hp 相關性PU有關的通路46 條，其中較為顯著的有癌癥通路、細胞凋亡通路、NOD 樣受體信號通路等。胃潰瘍在多因素長期作用下可惡化為胃癌，其中Hp的持續感染是重要因素。Hp侵入機體后，在多種外膜蛋白幫助下黏附并定植于胃黏膜上皮細胞表面，其毒力因子VacA、CagA 等抑制自噬蛋白表達、破壞機體自噬能力、損傷胃黏膜，通過多種途徑在宿主體內持續感染，使有害產物、受損細胞不能及時降解，最終引起胃病癌變。Hp 還可上調抑制抑癌基因、促進胃癌細胞發展的miRNA，下調能抑制胃癌細胞增殖轉移的miRNA［26］，促進腫瘤發展。細胞凋亡通路在黃芪治療Hp 相關性PU 中起重要作用。Hp 可使機體自噬與凋亡水平均上調。當自噬抑制時，Hp 可上調因自噬抑制引起的凋亡；當凋亡抑制時，Hp 可誘導細胞自噬性死亡［27］。而黃芪可通過激活自噬來抑制細胞凋亡［28］。NOD 樣受體是病原識別受體，是組成機體先天免疫系統的重要部分，Hp 在胃黏膜定植后可刺激宿主免疫應答機制，NOD1、NOD2 通過與自噬蛋白ATG16L1 的相互作用將其募集到細菌入侵部位，觸發自噬反應，發揮抗感染作用［29］，Hp 陽性患者體內NOD1、NOD2 的表達水平顯著上升［30］。本研究結果進一步驗證了前期已論證的實驗結果。

綜上所述，黃芪治療Hp 相關性PU 靶向自噬基因可能通過細胞凋亡、細胞周期等生物學過程發揮作用，與癌癥通路、細胞凋亡通路、NOD 樣受體信號通路等信號通路有關；TP53、CDKN1A、CCND1、CDK1、CDK2、CDK4、CCND2、E2F1、RB1、CCND3 等10個基因可能是黃芪治療Hp 相關性PU 靶向自噬核心基因。本研究運用網絡藥理學與生物信息學方法探究黃芪治療Hp 相關性PU 的分子網絡調控機制，挖掘了黃芪治療Hp 相關性PU 涉及的核心自噬基因，發現黃芪治療Hp 相關性PU 的分子機制可能與激活機體自噬反應以增強胃黏膜對Hp 自噬從而抑制其慢性持續性感染有關。本研究結果可為將黃芪或含黃芪的中藥復方應用于Hp相關性PU的臨床治療提供科學依據，為后續深入的實驗研究提供思路和參考。