丁苯酞在成人脂肪基質細胞分化為神經元樣細胞過程中的分化促進及自噬激動作用觀察

陸艷卉，徐康，趙紫燁，李斌，郭佳，周桂娟

1 唐山市人民醫院神經內科，河北唐山 063000；2 唐山市人民醫院檢驗科

成人脂肪基質細胞（ADSC）來源于脂肪組織，具有多向分化的潛能，具有容易獲得、數量多、容易擴增等特點，成為細胞移植治療神經系統疾病最有前途的干細胞之一。β-巰基乙醇是一種抗氧化劑，有毒性，然而在微克量級上卻是少數幾種可以延長小鼠壽命的化合物之一［1］。研究顯示，β-巰基乙醇作為一種化學誘導劑，可誘導ADSC 分化為神經元樣細胞，但誘導速度較慢，并且在幾小時內就會出現細胞凋亡［2-6］。自噬在細胞的生長發育過程中具有雙重作用，既是一種異于凋亡的細胞程序性死亡，又可以作為一種保護和防御機制來抵御環境變化對細胞造成的損傷，保護細胞免于凋亡和壞死［7-11］，所以適度調節自噬水平已經成為預防或治療神經系統病變的一條重要途徑［12］。雷帕霉素作為經典的自噬激活劑，能夠誘發和增強自噬反應［13］。丁苯酞（Dl-3-nbutylphthalide，NBP）從芹菜中提取，具有改善線粒體功能、抗氧化應激、抑制凋亡、降低谷氨酸釋放、促進神經元再生等多種神經保護作用［14］，在缺血性卒中的治療等方面被廣泛研究與應用，但其對自噬的影響及作用機制尚不清楚。2019 年9 月10 日—2020年12月10日，我們觀察了丁苯酞在ADSC 誘導分化為神經元樣細胞過程中的分化促進及自噬激動作用，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 成人ADSC 的提取和培養 采用針吸法抽取成人（20～35 歲）志愿者腹部皮下脂肪組織（無內分泌及血液系統疾病），參照葉長青等［4］的實驗方法，提取原代細胞，置于37 ℃、體積分數為5%的CO2飽和濕度培養箱中進行培養，期間每隔2～3 d換一次培養基，到10～14 d 細胞達到80%～90%融合時，按1∶2 比例進行傳代培養。本研究經河北省唐山市人民醫院倫理委員會批準施行，批準文號：RMYY-LLKS-2022-015，并經志愿者知情同意。

1.2 細胞分組、誘導分化及丁苯酞給予方法 將傳至第3～6 代的成人ADSC，用胰酶-EDTA 進行消化、離心，制成單細胞懸液，將細胞按照1×107/L 的細胞濃度接種于已經預先放置無菌蓋玻片的培養板中，制成細胞爬片，待細胞生長至70%～80%融合時，應用1 mmol/L 的β-巰基乙醇進行預誘導，培養24 h 后棄去，沖洗3 次后，分為β-巰基乙醇組、β-巰基乙醇+ 丁苯酞組、β-巰基乙醇+ 雷帕霉素組。其中β-巰基乙醇組加入含5 mmol/L 的β-巰基乙醇正式誘導液誘導其向神經元樣細胞分化，β-巰基乙醇+ 丁苯酞組加入5 mmol/L 的β-巰基乙醇和10 μmol/L 的丁苯酞，β-巰基乙醇+ 雷帕霉素組加入5 mmol/L 的β - 巰基乙醇和200 μg/L 的雷帕霉素。

1.3 不同時間點各組細胞形態學觀察及細胞分化率測算 取各組細胞，在預誘導、誘導1 h、誘導3 h、誘導5 h、誘導8 h時，采用倒置相差顯微鏡觀察各組細胞形態學變化。在高倍視野下（×100）隨機計數視野中的分化細胞數及細胞總數，計算細胞分化率。細胞分化率=分化細胞數/細胞總數×100%。觀察3個樣本，每個樣本計數5次，取平均值。

1.4 誘導1 h、誘導5 h時各組細胞超微結構觀察及自噬小體和自噬溶酶體數量測算 取各組細胞，在誘導1 h、誘導5 h 時后進行消化、離心，3%戊二醛、1%餓酸固定，丙醛脫水，環氧樹脂包埋，超薄切片機切片，2%醋酸鈾和枸櫞酸鉛染色，在透射電鏡下觀察細胞的超微結構并攝片。透射電鏡下隨機選取5個視野，計數自噬小體和自噬溶酶體數量。

1.5 不同時間點各組細胞存活率觀察 取各組細胞，在誘導1 h、誘導3 h、誘導5 h、誘導8 h 時，按5×103個/孔密度接種至96孔板，每板設6個復孔，每孔加入5 g/L 的MTT 20μL，37 ℃孵育4 h，吸去孔內液體，每孔加入150μL 的二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），于37 ℃恒溫搖床低速震蕩15 min。在酶聯免疫檢測儀上于490 nm 處測量各孔的OD值，以OD值表示各組細胞存活率。

1.6 各組細胞中神經元特異性烯醇化酶（NSE）、神經絲蛋-200（NF-200）、LC3 蛋白檢測 采用免疫細胞化學法。取各組細胞，消化后制成細胞爬片，取出細胞爬片，用40 g/L多聚甲醛固定30 min，0.1%Triton-X-100 處理8 min，3% H2O2孵育10 min 以消除內源性過氧化物酶的活性，室溫孵育15 min，沖洗3次，滴加封閉血清，37 ℃孵育15 min 后傾去，勿洗，滴加稀釋的一抗NF-200（1∶100）、NSE（1∶100）、LC3（1∶100），4 ℃過夜，加入山羊抗兔多克隆二抗，37 ℃孵育30 min，加入3，3’-二氨基聯苯胺顯色，其中NSE、NF-200 取誘導5 h 細胞進行檢測，LC3 取誘導1 h、3 h、5 h、8 h 時細胞進行檢測。在高倍視野下（×100）隨機計數視野中的陽性細胞數及細胞總數，計算陽性細胞率。陽性細胞率=陽性細胞數/細胞總數×100%。觀察3個樣本，每個樣本計數5 次，取平均值。

1.7 統計學方法 采用SPSS23.0 統計軟件。計量資料呈正態分布時以±s表示，多組間比較用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-q檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同時間點各組細胞形態學變化及細胞分化率比較 誘導后的三組細胞形態學變化相似，細胞核變的大而圓，細胞質開始向細胞核方向濃縮，細胞體周圍可見明顯的光暈。在誘導5 h時，分化的細胞呈典型的神經元樣細胞形態，細胞體向細胞核方向回縮成錐形，折光性明顯增強，細胞伸出較長的軸突樣突起，末端可見一級和二級分支。

不同時間點各組細胞分化率比較見表1。由表1可知，隨著誘導時間的延長，各組細胞分化率顯著升高（P均＜0.05），在誘導5 h時達到峰值，而誘導8 h 時與誘導5 h 時細胞分化率無差異（P＞0.05）；與β-巰基乙醇組相比，β-巰基乙醇+雷帕霉素組、β-巰基乙醇+ 丁苯酞組細胞分化率均顯著升高（P均＜0.05）；與β-巰基乙醇+雷帕霉素組相比，β-巰基乙醇+ 丁苯酞組在誘導1 h、3 h 時細胞分化率均顯著升高（P均＜0.05），在誘導8 h 時細胞分化率顯著降低（P＜0.05）。

表1 不同時間點各組細胞分化率比較（%，±s）

表1 不同時間點各組細胞分化率比較（%，±s）

注：與誘導1 h相比，*P＜0.05；與誘導3 h相比，#P＜0.05；與β-巰基乙醇組相比，&P＜0.05；與β-巰基乙醇+雷帕霉素組相比，@P＜0.05。

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2.2 誘導1 h、誘導5 h時各組細胞超微結構及自噬小體和自噬溶酶體數量比較 誘導1 h、誘導5 h 時各組細胞超微結構見圖1。由圖1可見，誘導分化的神經元樣細胞的細胞核體積大而圓，染色淺，其中常染色質多、異染色質較少，細胞質中可見溶酶體、高爾基復合體、線粒體等豐富的細胞器以及由大量密集扁平囊狀粗面內質網構成的典型尼氏小體結構。部分神經元樣細胞的細胞漿可見大量內質網擴張，線粒體出現腫脹、嵴斷裂，有的甚至腫脹變形、空泡化；同時，細胞內出現具有雙層膜結構的自噬小體；在自噬小體和初級溶酶體融合形成的自噬溶酶體內可見含有高密度的吞噬顆粒。

圖1 誘導1 h、誘導5 h時各組細胞超微結構（×10 000倍）

誘導1 h、誘導5 h 時各組細胞自噬小體和自噬溶酶體數量比較見表2。由表2 可知，誘導5 h 時各組細胞自噬小體及自噬溶酶體數量均高于誘導1 h時（P均＜0.05），β-巰基乙醇+ 丁苯酞組、β-巰基乙醇+ 雷帕霉素組細胞自噬小體及自噬溶酶體數量均高于β-巰基乙醇組（P均＜0.05）。

表2 誘導1 h、誘導5 h時各組細胞自噬小體及自噬溶酶體數量比較（個，±s）

表2 誘導1 h、誘導5 h時各組細胞自噬小體及自噬溶酶體數量比較（個，±s）

注：與誘導1 h時相比，*P＜0.05；與β-巰基乙醇組比，&P＜0.05。

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2.3 不同時間點各組細胞存活率比較 不同時間點各組細胞存活率比較見表3。由表3可知，隨著誘導時間的延長，各組細胞存活率均顯著下降（P均＜0.05）；與β-巰基乙醇組相比，β-巰基乙醇+雷帕霉素組、β-巰基乙醇+丁苯酞組細胞存活率均顯著升高（P均＜0.05）；與β-巰基乙醇+雷帕霉素組相比，β-巰基乙醇+丁苯酞組在誘導1、5、8 h 時細胞分化率均顯著降低（P均＜0.05）。

表3 不同時間點各組細胞存活率比較（±s）

表3 不同時間點各組細胞存活率比較（±s）

注：與誘導1 h相比，*P＜0.05；與誘導3 h相比，#P＜0.05；與誘導5 h相比，&P＜0.05；與β-巰基乙醇組相比，@P＜0.05；與β-巰基乙醇+雷帕霉素組相比，△P＜0.05。

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2.4 各組NSE、NF-200、LC3 陽性細胞率比較 各組NSE、NF-200 陽性細胞率比較見表4。由表4 可知，與β-巰基乙醇組相比，β-巰基乙醇+ 雷帕霉素組、β-巰基乙醇+ 丁苯酞組NSE、NF-200 陽性細胞率均顯著升高（P均＜0.05）；與β-巰基乙醇+雷帕霉素組相比，β-巰基乙醇+丁苯酞組NSE 陽性細胞率顯著升高（P＜0.05）。

表4 各組NSE、NF-200陽性細胞率比較（%，±s）

表4 各組NSE、NF-200陽性細胞率比較（%，±s）

注：與β-巰基乙醇組相比，&P＜0.05；與β-巰基乙醇+雷帕霉素組相比，@P＜0.05。

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不同時間點各組LC3 陽性細胞率比較見表5。由表5 可知，隨著誘導時間的延長，各組LC3 陽性細胞率均顯著升高（P均＜0.05），在誘導5 h 時達到峰值，而誘導8 h 時與誘導5 h 時LC3 陽性細胞率無差異（P＞0.05）；與β-巰基乙醇組相比，β-巰基乙醇+ 雷帕霉素組、β-巰基乙醇+ 丁苯酞組LC3 陽性細胞率均顯著升高（P均＜0.05）；與β-巰基乙醇+ 雷帕霉素組相比，β-巰基乙醇+ 丁苯酞組在誘導1 h、3 h 時LC3 陽性細胞率均顯著升高（P均＜0.05），在誘導8 h 時LC3 陽性細胞率顯著降低（P＜0.05）。

表5 不同時間點各組LC3陽性細胞率（%，±s）

表5 不同時間點各組LC3陽性細胞率（%，±s）

注：與誘導1 h 時相比，#P＜0.05；與誘導3 h 時相比，△P＜0.05；與誘導5 h 時相比，◆P＜0.05；與β-巰基乙醇組比，&P＜0.05；與β-巰基乙醇+雷帕霉素組比，@P＜0.05。

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3 討論

ADSC 在β-巰基乙醇的誘導下可定向分化為神經元樣細胞，但誘導后神經元樣細胞存活時間較短，幾小時就發生死亡。研究［5］發現，凋亡是誘導后細胞死亡原因之一。自噬是細胞維持自身穩態的一種自適應機制。在生理狀態下，細胞內部營養供給充足，自噬維持在較低的水平；在饑餓、缺氧等應激狀態下，自噬可通過代謝受損的細胞器和細胞質成分為細胞提供新的營養，起到積極防御作用［15］。溫和的自噬能保護細胞免受外界因素的侵害，促進細胞存活，嚴重的自噬將誘導細胞發生自噬性死亡［16］。

雷帕霉素作為經典的自噬激活劑，它可以通過抑制mTOR 的活性而誘發和增強自噬反應［17］。研究［18］發現，丁苯酞具有保護線粒體、抗氧化應激、抗凋亡、抗炎、調控自噬、抗血小板聚集、改善循環等作用。丁苯酞能夠通過誘導自噬，上調Beclin-1、LC3-Ⅱ等水平，抑制血小板源性生長因子誘導的血管平滑肌細胞增殖，從而改善心肌重塑。

自噬在ADSC 誘導分化為神經元樣細胞過程中的作用尚不明確。我們通過在ADSC 誘導分化為神經元樣細胞的反應過程中加入雷帕霉素、丁苯酞對自噬的作用進行研究。本研究結果顯示，ADSC 誘導分化5 h 時存活細胞中88%分化為神經元樣細胞，并且此時的分化率達高峰，而此后的細胞分化率則不再明顯升高，但隨誘導時間延長存活的細胞也越來越少；在整個誘導分化過程中分化的細胞具有典型的自噬的超微結構改變，可見自噬小體及自噬溶酶體，且隨誘導時間延長，自噬小體及自噬溶酶體數量逐漸增多。作為細胞自噬的標志蛋白，β-巰基乙醇組LC3陽性細胞率在誘導5 h時達到高峰，與細胞分化的變化趨勢以及自噬小體及自噬溶酶體數量變化相同，但是各個誘導組LC3 陽性細胞率卻明顯低于細胞分化率。這些結果提示誘導分化過程中分化細胞的自噬功能不足，致使分化過程中產生的大量代謝產物不能及時有效地清除，從而導致細胞死亡，也是細胞分化率在誘導5 h后不再明顯增加的重要原因之一。

我們在正式誘導反應時分別加入雷帕霉素和丁苯酞，結果顯示細胞分化率在誘導反應1 h就達70%以上，且隨誘導反應時間延長增加；同時，這兩組發生自噬反應的細胞數量明顯增多，強度也明顯增強，在誘導反應1 h 時，LC3 陽性細胞率已高達90%以上，并且在整個反應過程中均維持在很高的水平，且到誘導8 h 時LC3 的陽性細胞率較前無明顯下降。而LC3的陽性細胞率在1 h時達90%以上，誘導各個時間點均高于分化率，在1 h、3 h陽性為著。加入雷帕霉素和丁苯酞后細胞的細胞分化率明顯增高，也證實雷帕霉素、丁苯酞可促進細胞分化。但也有研究［19］顯示，雷帕霉素對骨髓造血干細胞向樹突狀細胞分化的過程影響較小，使分化的樹突狀細胞處于穩定的不成熟狀態，需要進一步研究以證實及鑒別。在正式誘導反應時加丁苯酞和雷帕霉素后，細胞的分化率及LC3陽性細胞率在誘導5 h相差不大，故丁苯酞對自噬也有促進作用，且與雷帕霉素激動作用相當，而細胞的存活率較只有β-巰基乙醇組升高，說明雷帕霉素、丁苯酞均能通過增強自噬，促進誘導后神經元樣細胞生存。

在三組細胞整個分化過程中，發生自噬的細胞比率均明顯高于發生細胞分化的比率，這進一步證實了自噬是細胞分化過程中的重要基礎和支撐性反應。因此，細胞在分化過程中必須有足夠的自噬能力才能保證細胞誘導分化，這也是大量獲得目標細胞的關鍵環節和基礎條件之一。本研究中，雖然雷帕霉素、丁苯酞應用與否細胞分化都顯示相似的形態學變化，但細胞分化速度和程度則具有顯著不同。誘導劑中加入雷帕霉素和丁苯酞后，ADSC 誘導分化反應1 h，就有70%的細胞出現了較長的突起，已經出現神經元的雛形。但在β-巰基乙醇組，誘導反應3 h才能夠達到該種分化程度，該結果說明在ADSC 誘導分化過程中，雷帕霉素和丁苯酞不但可以立即激活分化細胞的自噬反應，提高自噬強度，而且也可以加快ADSC 的分化速度。自噬的調控是一個非常復雜的過程，涉及許多信號通路，誘導分化反應中的細胞具體信號傳導通路還不清楚，而丁苯酞促進自噬的機制也不明確。

ADSC 誘導分化為神經元樣細胞過程中，透射電鏡下可見細胞漿中出現大量內質網擴張、線粒體腫脹、嵴斷裂，有的甚至發生腫脹變形和空泡化，并且可見包裹有吞噬線粒體的雙層膜結構的自噬小體以及由含有高密度吞噬顆粒的初級溶酶體融合而形成的單層膜狀結構的自噬溶酶體的自噬的發生。在誘導劑中加入雷帕霉素和丁苯酞后，分化細胞形態學變化相似，但自噬小體及自噬溶酶體的數量明顯增多，且隨誘導時間延長逐漸增多。檢測發現，隨著誘導分化時間延長而LC3 陽性細胞率升高，但生存細胞數量逐漸下降，自噬水平不足以清除腫脹破壞的線粒體以及分解產物，導致細胞的分化速度減慢，甚至細胞發生死亡。也有研究［20］證實，神經細胞的自噬增強具有神經保護作用。雷帕霉素、丁苯酞是一種很有前途的預防和治療神經退行性疾病的藥物，尤其是用于早期的帕金森綜合癥和阿爾茨海默氏病以及PMP22 相關性脫髓鞘性多發性神經病的治療方面。

綜上所述，ADSC 誘導分化為神經元樣細胞過程中，自噬起到保護和支撐性作用，丁苯酞可促進細胞分化，并通過升高自噬小體和自噬溶酶體數量等自噬激動作用提高了細胞存活率。