恩他卡朋片微生物限度檢查方法的建立及驗證

趙同申，秦桂霞，于洪華*，季智飛，徐偉娜

（1. 山東華魯制藥有限公司，山東 聊城 252100；2. 山東省藥學科學院，山東 濟南 250101）

恩他卡朋片是抗帕金森病藥物，有效成分為恩他卡朋，輔料包括甘露醇、微晶纖維素、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、氫化蓖麻油。恩他卡朋片可作為左旋多巴/芐絲肼或左旋多巴/卡比多巴的輔助用藥，用于治療以上藥物不能控制的帕金森病及劑末現(xiàn)象（癥狀波動）。

經(jīng)查閱文獻，未見恩他卡朋片微生物限度檢驗方法的研究。試驗中發(fā)現(xiàn)恩他卡朋片有抑菌作用，因此，本文建立了稀釋法消除抑菌性的微生物限度檢驗方法，并選用3批樣品進行方法適用性試驗。

1 儀器與材料

1.1 儀器

SPX-250生化培養(yǎng)箱（北京市永光明醫(yī)療儀器廠）；DHP-600電熱恒溫培養(yǎng)箱（北京市永光明醫(yī)療儀器廠）；MZ-301微生物限度儀（杭州美卓生物科技有限公司）；濾膜（上海市新亞凈化器件廠，直徑50 mm，孔徑0.45 μm）；YXQ-LS-50SⅡ立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠）；KF-3102電子天平（浙江凱豐集團有限公司）；DZKW-C恒溫水浴鍋（龍口市電爐制造廠）。

1.2 試驗菌種

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）〔CMCC(B)10 104〕，大腸埃希菌（Escherichia coli）〔CMCC(B)44 102〕，金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus） 〔CMCC(B)26 003〕，枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）〔CMCC(B)63 501〕，白色念珠菌（Candida albicans）〔CMCC(F)98 001〕，黑曲霉（Aspergillus niger）〔CMCC(F)98 003〕，均購自山東省食品藥品檢定研究院。

1.3 培養(yǎng)基及試劑

胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（批號：210122），胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（批號：210129），沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（批號：210223），麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（批號：190301），麥康凱液體培養(yǎng)基（批號：200520），pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液（批號：1901162，北京三藥科技開發(fā)公司）按標簽說明配制，經(jīng)高壓蒸汽滅菌后密封備用，培養(yǎng)基適用性自行完成，均符合規(guī)定。聚山梨酯80（批號：20181016，天津市科密歐化學試劑有限公司）。

1.4 樣品

恩他卡朋片（山東華魯制藥有限公司，批號：200801，210301，210401）。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌液制備

取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、大腸埃希菌新鮮培養(yǎng)物，分別用0.9 %無菌氯化鈉溶液制成適宜濃度菌懸液。取含黑曲霉的沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基，用含0.05 %聚山梨酯80的0.9 %無菌氯化鈉溶液將孢子洗脫，并稀釋制成適宜濃度黑曲霉孢子懸液。

2.2 供試液制備

稱取恩他卡朋片10 g，加含1 %聚山梨酯80的pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 ml，置45 ℃恒溫水浴鍋中，振蕩至均勻分散，作為1:10（m:v）供試液。量取1:10供試液適量，用含1 %聚山梨酯80的pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋制成1:20及1:50供試液。

2.3 計數(shù)方法適用性試驗

分別取1:10，1:20及1:50供試液9.9 ml，置無菌試管中，分別加入試驗菌菌懸液0.1 ml（含菌量不大于1000 cfu），混勻，取1 ml混勻后的供試液注入90 mm無菌培養(yǎng)皿中，加入培養(yǎng)基，其中接種金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌、黑曲霉菌的培養(yǎng)皿加胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，另取接種白色念珠菌、黑曲霉菌的培養(yǎng)皿加沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，將平皿倒置于相應培養(yǎng)箱培養(yǎng)，計數(shù)。

同步取pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替供試液，作為菌液對照組；以含1 %聚山梨酯80的pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替供試液，作為稀釋劑對照；以供試液代替菌懸液，作為供試品對照。

計算稀釋劑對照組回收比值，回收比值=稀釋劑對照組菌落數(shù)/菌液對照組菌落數(shù)，回收比值應在0.5～2.0范圍內(nèi)。結(jié)果見表1。

小試最佳結(jié)果：當塔頂溫度78℃，塔釜溫度100℃，回流比4∶1，塔頂餾出液氨氮濃度65 000 mg/L，折合氨水濃度7.9%，塔釜液氨氮濃度＜10 mg/L。小試中塔釜脫氨液濃度達到預期，但塔頂氨水作為資源化尚不夠。分析原因：冷凝溫度不夠低，部分氨氣無法冷凝，從經(jīng)濟性角度考慮，宜采用吸收來替代冷凝。考慮到除防垢，對塔釜液進行離心分離，塔釜液SS為1 046 mg/L，300r/min離心分離后，SS去除率約50%，800 r/min離心分離，SS去除率＞75%，為中試提供依據(jù)。

表1 稀釋劑對照組回收比值

結(jié)果：含1 %聚山梨酯80稀釋劑對微生物無毒性。

計算試驗組回收比值，回收比值=（試驗組菌落數(shù)-供試品對照組菌落數(shù)）/菌液對照組菌落數(shù)，回收比值應在0.5～2.0范圍內(nèi)。結(jié)果見表2。

表2 試驗組回收比值

結(jié)果：當供試液濃度為1:50時，試驗組回收比值在0.5～2.0范圍內(nèi)，可確認供試液在該檢驗條件下無抑菌作用或抑菌作用可忽略不計。

2.4 控制菌檢驗方法適用性

取1:10供試液10 ml，加含試驗菌大腸埃希菌的菌懸液0.1 ml（含菌量不大于100 cfu），混勻，置于100 ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻，33.0 ℃培養(yǎng)18 h，取培養(yǎng)物1 ml接種至100 ml麥康凱液體培養(yǎng)基中，43.0 ℃培養(yǎng)24 h，取麥康凱液體培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上，33.0 ℃培養(yǎng)18 h。

同步設立陽性對照，陰性對照，供試品對照及稀釋劑對照。

結(jié)果：陰性對照組無菌生長，試驗有效。稀釋劑對照組、試驗組均檢出試驗菌，且菌落形態(tài)與陽性對照組一致，確定為大腸埃希菌形態(tài)特征。可以判定，含1 %聚山梨酯80稀釋劑對大腸埃希菌無毒性，1:10供試液在該檢驗條件下可正常檢出大腸埃希菌。

3 討論

3.1 稀釋方式的選擇

3.2 稀釋倍數(shù)的確定

經(jīng)前期試驗，本品1:10供試液對微生物有抑制作用，且不溶于水，不宜采用薄膜過濾法，結(jié)合樣品特性及限度要求，遵循“就簡不就繁”的原則，選用稀釋法，使每個平皿中樣品量降低，可有效去除藥品本身的抑菌性，且該方法操作簡單，重復性好[3-6]。綜上，選擇增加稀釋法進行方法適用性試驗，并設定不同稀釋濃度（1:10，1:20，1:50）進行試驗，比較試驗結(jié)果，最終確定供試液濃度在1:50時最佳。

4 結(jié)論

本品不屬于抗生素類藥品，從藥理作用及理化性質(zhì)方面，判斷不出是否具有抗菌性，在日常檢測中，容易忽略其可能存在的未知的抑菌性[7]。本研究采用增加供試液稀釋級別提高試驗菌種的回收率[8]，使微生物限度檢驗更準確，更科學有效，符合藥典要求。本文對類似性質(zhì)藥品的微生物限度檢驗方法的建立及驗證有一定參考意義。