UPLC-MS/MS檢測長白山白眉蝮蛇蛇毒中的類凝血酶

咸瑞卿 ，王聰聰，鞏麗萍，張迅杰，彭 麗，石 峰*

（1. 山東省食品藥品檢驗研究院，國家藥品監督管理局仿制藥研究與評價重點實驗室，山東省仿制藥一致性評價工程技術研究中心，山東 濟南 250101；2. 山東大學 藥學院，山東 濟南 250012；3. 華潤雙鶴利民藥業（濟南）有限公司 質量部，山東 濟南 250200）

蛇毒是由蛇的毒腺分泌的一種天然蛋白質，含多種蛋白質、多肽、酶類和其他小分子物質，具有廣泛的生物學活性[1-4]。蛇毒類凝血酶（thrombin-like enzyme，TLE）是蛇毒中與凝血酶作用機制部分相似的一類蛋白水解酶，屬絲氨酸蛋白酶，能水解纖維蛋白原為纖維蛋白，具有體外促凝、體內降纖的作用，因其具有重大臨床應用價值而被廣泛研究[5-6]。目前國內獲批上市的蛇毒類凝血酶藥物有多種，其中注射用白眉蛇毒血凝酶（邦亭）、注射用矛頭蝮蛇血凝酶（巴曲亭）等是臨床廣泛使用的止血藥，占止血藥市場份額近50 %[7-9]。但不同蛇種來源的類凝血酶結構不同，其作用機制不同，相應的藥理作用也存在差異[10]，因此明確蛇毒類凝血酶蛇種來源對于該類產品的質量控制，保障臨床用藥的安全有重要作用。

現報道的蛇毒種屬鑒別及其類凝血酶檢測方法主要為酶聯免疫吸附測定（ELISA）[11]、液相色譜法和電泳法等[12]，存在方法繁瑣、專屬性差等問題。隨著蛋白質組學技術的發展，基于液相色譜串聯質譜技術的物種特征肽檢測已逐漸成為食品藥品質量控制的重要方法[13-14]。本研究基于長白山白眉蝮蛇類凝血酶特征肽，建立了一種專屬性強、靈敏度高的超高效液相色譜-串聯質譜法（UPLC-MS/MS），用于檢測長白山白眉蝮蛇的蛇毒種屬來源及類凝血酶含量。

1 儀器與材料

1.1 儀器

AB SCIEX Triple Quad 6500+型超高效液相色譜-三重四極桿質譜聯用儀（美國AB SCIEX公司）；CP225D電子天平（德國Sartorius公司）；Sigma 3-30 K冷凍離心機（德國Sigma公司）；Milli-Q Advantage A10超純水儀（美國Millipore公司）。

1.2 試藥

乙腈（色譜純，美國Honeywell公司）；甲酸（色譜純，美國ACS恩科化學公司）；胰蛋白酶（效價≥10 000 IU/mg）；碘乙酰胺（分析純，美國Sigma公司）；三羥甲基氨基甲烷（分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司）；二硫蘇糖醇（純度：≥99 %，上海翌圣生物科技有限公司）；特征肽（TLCAGVMEGGIDTCNR）對照品（純度：≥98 %，上海強耀生物科技有限公司）；其他試劑均為分析純；水為超純水。

長白山白眉蝮蛇蛇毒（編號：S1～S3，錦州奧鴻藥業有限責任公司）；矛頭蝮蛇蛇毒（編號：S4～S6，蓬萊諾康藥業有限公司）；長白山白眉蝮蛇類凝血酶（批號：201429，錦州奧鴻藥業有限責任公司）。

2 方法與結果

2.1 色譜質譜條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱溫：40 ℃；進樣量：2 μl；流速：0.2 ml/min；流動相A為0.1 %甲酸水溶液，流動相B為0.1 %甲酸乙腈，梯度洗脫，洗脫程序：0→1 min， 流動相B 20 %；1→3 min，流動相B 20 %→60 %；3→6 min，流動相B 60 %。

2.1.2 質譜條件 電噴霧離子源，正離子掃描模式，多反應監測；以m/z877.4（雙電荷）→892.4為定量離子對，以m/z877.4（雙電荷）→550.2為定性離子對；離子源溫度：500 ℃；離子化電壓：5.5 kV；碰撞室出口電壓：10 V；入口電壓：10 V；碰撞能量：45 eV，去簇電壓：135 V。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 取特征肽對照品10 mg，精密稱定，置100 ml量瓶中，用25 mmol/L碳酸氫銨溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別精密量取0.1，0.25，0.5，1，2 ml，分別置100 ml量瓶中，用25 mmol/L碳酸氫銨溶液稀釋至刻度，搖勻；分別精密量取200 μl，加0.2 mol/L二硫蘇糖醇溶液10 μl，混勻，60 ℃反應60 min，加0.2 mol/L碘乙酰胺溶液20 μl，避光放置30 min，加25 mmol/L碳酸氫銨溶液760 μl和0.4 mg/ml胰蛋白酶水溶液（臨用新制）10 μl，37 ℃反應90 min，90 ℃酶解10 min，放冷至室溫，12 000 r/min離心10 min，取上清作為系列對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取待測樣品20 mg，置10 ml量瓶中，用25 mmol/L碳酸氫銨溶液溶解并定容；精密量取200 μl，加0.2 mol/L二硫蘇糖醇溶液10 μl，混勻，60 ℃反應60 min，加0.2 mol/L碘乙酰胺溶液20 μl，避光放置30 min，加25 mmol/L碳酸氫銨溶液760 μl和0.4 mg/ml胰蛋白酶溶液（臨用新制）10 μl，37 ℃反應90 min，90 ℃酶解10 min，放冷至室溫，12 000 r/min離心10 min，取上清作為供試品溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 精密量取25 mmol/L碳酸氫銨溶液200 μl，加0.2 mol/L二硫蘇糖醇溶液10 μl，混勻，60 ℃反應60 min，加0.2 mol/L碘乙酰胺溶液20 μl，避光放置30 min，加25 mmol/L碳酸氫銨溶液760 μl和0.4 mg/ml胰蛋白酶溶液（臨用新制）10 μl，37 ℃反應90 min，90 ℃酶解10 min，放冷至室溫，12 000 r/min離心10 min，取上清，即得陰性樣品溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1 專屬性試驗 分別取對照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液和空白溶液（25 mmol/L碳酸氫銨溶液），按2.1項下色譜質譜條件進樣測定，MRM色譜圖見圖1。結果顯示陰性樣品溶液、空白溶液在對照品溶液出峰位置沒有干擾峰出現，供試品溶液在相應保留時間處峰形良好，表明該方法專屬性良好。

圖1 專屬性考察MRM圖譜

2.3.2 線性及范圍 按2.2.1項下方法制備終濃度為20，50，100，200，400 ng/ml的系列對照品溶液，按2.1項下色譜質譜條件進樣測定。以系列對照品溶液中特征肽的濃度（x，ng/ml）為橫坐標，以對應的峰面積（y）為縱坐標，計算得線性回歸方程：y=783.41x-10 329（r=0.9990），在20～400 ng/ml范圍內，特征肽的濃度與色譜峰面積呈良好的線性關系。

2.3.3 精密度試驗 精密稱取編號S1的蛇毒樣品，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜質譜條件測定，連續進樣6次，結果顯示保留時間和峰面積的RSD均＜2.6 %，表明該法精密度良好。

2.3.4 重復性試驗 精密稱取編號S1的蛇毒樣品6份，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜質譜條件測定，結果顯示，6份樣品的保留時間和峰面積的RSD均＜2.5 %，表明該法重復性良好。

2.3.5 穩定性試驗 取2.2.2項下供試品溶液，分別在0，2，4，6，8，16，24 h進樣測定，結果顯示，各時間點保留時間和峰面積的RSD均＜3 %，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.3.6 檢出限與定量限 取2.2.1項下20 ng/ml對照品溶液，用空白溶液稀釋制備不同濃度的溶液。當濃度為2 ng/ml和6 ng/ml時，對應的峰高信噪比分別為3.4和11.8，因此檢出限為2 ng/ml，定量限為6 ng/ml。

2.3.7 加標回收試驗 精密稱取已知特征肽含量的蛇毒樣品（S1，含量530 ng/kg）19.80 mg，用25 mmol/L碳酸氫銨溶液溶解并稀釋至10 ml；取9份，每份200 μl，各加入適量特征肽對照品溶液，按2.2.2項下方法制備回收率考察溶液，以m/z877.4（雙電荷）→892.4作為定量離子對，進行檢測。結果顯示3個水平的回收率均在91.2 %～107.8 %范圍內，平均回收率96.2 %，RSD為6.6 %，該方法回收率良好。見表1。

表1 加標回收試驗結果（n=3）

2.4 樣品測定

采用本方法對收集到的6批蛇毒樣品進行測定。結果顯示在以m/z877.4（雙電荷）→892.4和m/z877.4（雙電荷）→550.2離子對提取的供試品溶液離子流色譜中，S1～S3樣品均呈現與對照特征肽色譜保留時間一致的色譜峰，而S4～S6樣品在對照特征肽色譜保留時間處均未提取到色譜峰。因此，編號為S1～S3的3批蛇毒中均可檢測到特征肽TLCAGVMEGGIDTCNR，確認其來源于長白山白眉蝮蛇，而另外3批蛇毒均未檢測到該特征肽，因此為非長白山白眉蝮蛇來源。對于檢測到特征肽的3批樣品，用回歸方程計算供試品溶液特征肽的含量，結果見表2。由表2可見，特征肽含量為474～530 mg/kg。

表2 樣品測定結果

3 討論

特征肽的選擇是采用液相色譜串聯質譜進行蛋白質定性定量分析的關鍵和難點，直接決定了后續建立方法的特異性、靈敏度和穩定性。在前期研究[15]中，采用胰蛋白酶對純化的長白山白眉蝮蛇類凝血酶進行酶解，利用納升液相-高分辨質譜（Nano LC-HRMS）和Proteome Discoverer軟件分別進行多肽的檢測和鑒定，通過BLAST搜索與Uniprot數據庫對比分析，篩選了具有種屬特異性的長白山白眉蝮蛇類凝血酶特征肽段TLCAGVMEGGIDTCNR。

本研究基于具有種屬特異性的白眉蝮蛇類凝血酶特征肽，建立了UPLC-MS/MS檢測白眉蝮蛇蛇毒種屬來源及類凝血酶含量的方法。該方法專屬性強、靈敏高、準確可靠，可進一步推廣應用于長白山白眉毒蛇血凝酶藥物原料、中間體及其制劑中活性蛋白的檢測，對于優選蛇毒原料、優化生產工藝、提高產品安全性具有重要意義。