兼具抗氧化及鮮度指示特性的結冷膠基活性智能膜研究

陳 青 岳志敏 邢加偉 俞創勛 潘 玲 胡 紅

(浙江工商大學食品與生物工程學院， 杭州 310018)

0 引言

利用天然高分子開發可生物降解的食品包裝材料是目前的研究熱點[1-3]。多糖是一種重要的天然高分子材料，其來源廣泛、可再生、具有良好的生物相容性、生物降解性和成膜特性，因此多糖基食品包裝材料的開發備受關注[4-7]。

食品包裝具有3個基本功能：密封、保護食品品質以及避免食品在流通中遭受外界環境的影響。隨著消費者需求及食品安全意識的改變，越來越多的消費者期望食品包裝不僅有助于延長食品保質期，還能便捷地實時反映食品新鮮度，活性智能膜則提供了新的可能[8-10]。目前很多研究者制備了具有抑菌性、抗氧化活性的包裝材料或者基于環境酸度敏感的智能標簽[11-15]，但兼具抗氧化及酸度敏感性的活性智能包裝材料研究還很少。

結冷膠是線性陰離子多糖，其安全無毒、相容性好、耐熱耐酸，是一種新型可降解成膜基質[16-18]。紫甘藍在我國大多數地區都有種植，其廉價易得、富含花青素，紫甘藍花青素具有優異的抗氧化能力與酸度響應特性[19]。如果將紫甘藍花青素應用于包裝材料開發中可能得到一種兼具抗氧化及酸度響應特性的智能活性包裝膜。鑒于此，本文利用低酰基結冷膠和紫甘藍花青素制備兼具抗氧化活性和酸度敏感性的活性智能膜，并考察活性智能膜在大黃魚鮮度指示和豬油保鮮中的應用效果。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

低酰基結冷膠，美國Kelco公司，食品級；紫甘藍、豬油、鮮活大黃魚購于杭州市永輝超市；甘油、氯化鈉，上海凌峰化學試劑有限公司；2,2-二苯基-1-苦基酰肼(DPPH)、甲基紅、溴甲酚綠、酚酞，阿拉丁試劑有限公司；無水乙醇、氫氧化鈉、冰乙酸，西隴科學有限公司；三氯乙酸、三氯甲烷、硫代巴比妥酸、硼酸、氧化鎂、硫代硫酸鈉、可溶性淀粉，上海國藥集團化學試劑有限公司。所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

恒溫干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司；CR-400型色差儀，Konica Minolta Sensing公司；TA.XT型物性分析儀，英國SMS公司；TGA 1型綜合熱分析儀，Melller Toledo公司；pH計，德國Sartorius公司；XH-300A型超聲微波組合萃取儀，北京祥鵠科技有限公司；半自動凱氏定氮儀，上海遷檢儀器有限公司；UV-2600型紫外分光光度計，島津儀器有限公司；新芝SCIENTE-10N型冷凍干燥機，寧波新芝生物科技有限公司；HAAKE MARS Ⅲ型旋轉流變儀，德國Thermos公司；螺旋測微器，哈爾濱量具刃具有限公司；電子分析天平，北京賽多利斯儀器系統有限公司；Millipore-Q 型超純水儀，美國Millipore有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1花青素提取

新鮮紫甘藍(20 mm×20 mm)60℃干燥24 h，粉碎過40目篩，利用超聲微波組合萃取儀進行紫甘藍花青素提取(微波功率482 W，超聲功率320 W， 55℃提取22 min，乙醇體積分數70%，料液比0.1 g/mL)，提取液經抽濾、旋蒸、凍干，制得紫甘藍花青素粉末。

1.3.2低酰基結冷膠-紫甘藍花青素活性智能膜的制備

在室溫(20℃)下將適量低酰基結冷膠粉末加入到去離子水中，溶脹24 h，于85℃下進行磁力攪拌，直至結冷膠粉末完全溶解形成澄清透明的溶液，溶液降溫至60℃，依次加入甘油、紫甘藍花青素及氯化鈉溶液，攪拌均勻，制得成膜溶液。去除氣泡，將成膜溶液緩慢均勻注入100 mm(長)×100 mm(寬)×2 mm(高)的模具中，35℃干燥箱中干燥24 h，即可得到結冷膠-紫甘藍花青素活性智能膜，將制備好的活性智能膜放入25℃、相對濕度為54%的干燥器中平衡48 h，進行性能表征。

活性智能膜中結冷膠質量濃度為0.01 g/mL，花青素質量濃度為0.002、0.006、0.01、0.02、0.04、0.06 g/mL，甘油質量濃度為0.01 g/mL，鈉離子濃度為10 mmol/L，將花青素質量濃度為0、0.002、0.006、0.01、0.02、0.04、0.06 g/mL的活性智能膜分別標記為GR-0、GR-0.002、GR-0.006、GR-0.01、GR-0.02、GR-0.04和GR-0.06。

1.3.3成膜溶液流變特性測定

采用HAAKE MARS Ⅲ型旋轉流變儀進行流變特性測定，平行板模式，平行板直徑為35 mm，間距1 mm。動態溫度掃描范圍-10～80℃，降溫速率 2℃/min，測試前將暴露在空氣中的試樣表面涂一層甲基硅油，以防止測試過程中水分揮發。

1.3.4活性智能膜理化性質表征

(1)膜厚、含水率測定

在待測樣品上均勻取13個點，用螺旋測微器進行測量，取平均值作為后續性質測定中的厚度。

在活性智能膜中部剪裁尺寸為20 mm×20 mm的試樣，將試樣放在105℃干燥箱中24 h至質量恒定，含水率(Moisture content，MC)計算公式為

(1)

式中W0——膜的初始質量，g

W1——膜干燥至質量恒定的質量，g

(2)水蒸氣透過率測定

參考文獻[20]的方法測定水蒸氣透過率(Water vapor permeability，WVP)。

(3)機械性能測定

參考文獻[21]的方法利用質構儀測定膜的抗拉強度(Tensile strength，TS)和斷裂伸長率(Elongation at break，EB)。

(4)熱性能測定

采用綜合熱分析儀測定膜的熱性能。溫度范圍25～500℃，升溫速率10℃/min，氣氛為氮氣。

(5)微觀結構表征

將活性智能膜在液氮中淬斷，噴金處理后，用掃描電子顯微鏡觀察斷面形貌，加速電壓3 kV。

(6)花青素釋放性能測定

采用文獻[22]的方法測定活性智能膜中花青素的釋放性能。

(7)酸度敏感性測試

膜的酸度敏感性測試參考文獻[23]方法，將膜裁剪成尺寸為15 mm×15 mm的樣品，浸入pH值為1～12的緩沖溶液2 min后取出，用濾紙吸去樣品表面多余溶液，用色差儀測定膜的L*(亮度)、a*(紅度)、b*(黃度)值，色差ΔE計算公式為

(2)

L*、a*、b*——膜使用后的顏色值

1.3.5活性智能膜對大黃魚新鮮度的表征

將鮮活大黃魚宰殺清除內臟后，裝在專用包裝盒中，將活性智能膜(20 mm×20 mm)置于頂部，不接觸樣品，4℃保存。活性智能膜的圖像拍攝在燈位置、入射角和光照強度恒定的燈箱中進行。每天測定大黃魚的揮發性鹽基氮(TVB-N)含量、硫代巴比妥酸值(TBA)、菌落總數(TVC)和活性智能膜的色差，直至大黃魚徹底腐敗變質。

TVB-N含量：參照GB 5009.228—2016的方法，利用半自動凱氏定氮儀測定TVB-N含量。

TVC：參照GB 4789.2—2016 的方法，選用平板計數法測定樣品肉樣的菌落總數。

pH值：參照GB 5009.237—2016的方法，使用pH計測定大黃魚的pH值。

TBA：參照文獻[24]的方法，取5 g大黃魚魚肉，加入25 mL質量分數20%的三氯乙酸溶液，均質5 min，8 000 r/min離心10 min，取5 mL上清液，加入5 mL 0.02 mol/L硫代巴比妥酸溶液，100℃水浴反應40 min，冷卻至室溫(20℃)，再加入5 mL三氯甲烷溶液，靜置30 min，用紫外分光光度計在532 nm和600 nm波長處測試吸光度，TBA計算公式為

(3)

式中TBA——TBA，mg/kg

m——樣品質量，g

A532——波長532 nm處的吸光度

A600——波長600 nm處的吸光度

活性智能膜的色差：使用Image J軟件對活性智能膜照片中的Lab值進行提取分析。

1.3.6活性智能膜的抗氧化活性測定

(1) 抗氧化活性

參考文獻[25]的方法測定活性智能膜的抗氧化活性，將樣品(20 mm×20 mm)放入含有4 mL甲醇的試管中， 25℃磁力攪拌2 h，吸取3 mL樣液上清液與1 mL濃度150 μmol/L的DPPH甲醇溶液混合均勻，在517 nm處測量吸光度，同時將3 mL甲醇與1 mL濃度150 μmol/L的DPPH甲醇溶液混勻后作參照，在517 nm處測量吸光度。膜的DPPH自由基清除率計算公式為

(4)

式中A1——樣品吸光度

A0——參照組吸光度

(2)活性智能膜對豬油保鮮性能檢測

用制備好的活性智能膜緊密包覆25.0 g豬油，以未包覆豬油為空白對照，將所有樣品置于25℃恒溫培養箱中直至豬油腐敗變質，每5 d測試一次過氧化值和酸價。參照GB 5009.227—2016和GB 5009.229—2016分別測定豬油的過氧化值和酸價。

1.4 數據處理

利用Origin 8.0和SPSS 17.0進行數據處理和分析。為了減少實驗誤差，提高數據可信度，每組實驗重復測定3次，文中所用數據為平均值。

2 結果與討論

2.1 成膜溶液的流變特性

圖1給出了結冷膠-紫甘藍花青素成膜溶液的動態溫度掃描曲線。可見，成膜溶液動態溫度掃描曲線呈反S形，可分為3個區：第一平臺區、快速增長區和第二平臺區。第一平臺區對應的是高溫區域，所有體系的儲能模量G′和損耗模量G″均較低，且G″>G′，說明此時體系為液體。隨著溫度降低，G′和G″均先出現緩慢上升，二者接近并相交于一點；之后G′和G″快速增大，G′大于G″，進入快速增長區，此時體系表現出了類固體的流動特點。隨著溫度進一步降低，G′>G″并基本保持恒定，曲線進入第二平臺區。結冷膠-紫甘藍花青素溶液在降溫過程中因為大分子的聚集而表現出了類固體的特性，說明體系經歷了液-固轉變，形成了凝膠。花青素濃度越高，體系的動態模量越大，G′和G″發生突變的溫度越高。

圖1 結冷膠-紫甘藍花青素溶液的動態溫度掃描曲線Fig.1 Dynamic temperature sweep curves of gellan gum-red cabbage anthocyanin solution

凝膠溫度對膜的制備影響顯著，文獻[26]認為在降溫過程中，G′快速增大區域的擬合直線外推至G′=0時，對應的溫度即為體系的凝膠溫度。由圖1可知，在降溫過程中，G′存在線性增長區，利用直線外推法確定了成膜溶液的凝膠溫度。圖2給出了花青素質量濃度對成膜溶液凝膠溫度的影響，顯然，花青素質量濃度越大，凝膠溫度越高。且花青素質量濃度對成膜溶液凝膠溫度的影響存在一個臨界值，當花青素質量濃度不高于0.02 g/mL時，隨著花青素質量濃度的增大，體系凝膠溫度會顯著向著高溫區域移動；當花青素質量濃度高于0.02 g/mL時，凝膠溫度的升高速率減緩。

圖2 花青素質量濃度對結冷膠-紫甘藍花青素溶液凝膠溫度的影響曲線Fig.2 Effects of anthocyanin concentration on gelation temperature of gellan gum-red cabbage anthocyanin solutions

2.2 活性智能膜的理化性質

2.2.1膜厚、含水率、水蒸氣透過率和機械性能

表1給出了活性智能膜的厚度、含水率、水蒸氣透過率和機械性能，當花青素質量濃度低于0.01 g/mL時，膜厚差異不大，當花青素質量濃度高于 0.01 g/mL時，花青素質量濃度越高，膜越厚。這是因為花青素質量濃度增高，單位體積內固含量增高。

表1 活性智能膜的厚度、含水率、水蒸氣透過率與機械性能Tab.1 Thickness, moisture content, water vapor permeability and mechanical properties of gellan gum-red cabbage anthocyanin active and intelligent film

活性智能膜的含水率隨著花青素質量濃度的升高而降低，而水蒸氣透過率則隨著花青素質量濃度的增大而升高，當花青素質量濃度從0增大到0.06 g/mL時，WVP從0.28 g·mm/(h·kPa·m2)增至0.43 g·mm/(h·kPa·m2)。花青素添加改變了結冷膠分子之間的相互作用，一方面降低了結冷膠分子鏈上羥基的可用性，另一方面減弱了結冷膠分子鏈間的纏結，造成活性智能膜含水率降低，WVP增大。文獻[23,27]報道，殼聚糖-藍莓花青素智能膜的WVP在0.68～0.86 g·mm/(h·kPa·m2)范圍內(藍莓花青素質量分數為0～4%)，淀粉-聚乙烯醇-紫薯花青素復合膜的WVP為0.75～0.84 g·mm/(h·kPa·m2)(紫薯花青素智能膜花青素質量分數為0～1%)。顯然，本研究制備的活性智能膜阻水性優于文獻報道結果。

此外還可發現，隨著紫甘藍花青素質量濃度增大，活性智能膜的抗拉強度逐漸降低，斷裂伸長率則逐漸升高。當花青素質量濃度從0增大到0.06 g/mL，抗拉強度從33.58 MPa降低到19.61 MPa，斷裂伸長率則從19.37%增大到32.87%，這可能是因為花青素起到了部分塑化劑的作用，增大了結冷膠分子鏈的移動性，這也與文獻[28]的研究結果類似。

2.2.2微觀結構之間具有較好的相容性。且隨著花青素含量的增加，活性智能膜的斷面變得更加光滑。

圖3給出了活性智能膜的微觀結構，所有樣品斷面都是均勻的，說明花青素分子與結冷膠分子結合活性智能膜含水率、水蒸氣透過率和機械性能的變化規律，提出了結冷膠-紫甘藍花青素活性智能膜網絡結構形成機理，如圖4所示。對于未添加花青素的結冷膠體系而言，結冷膠分子鏈通過氫鍵形成螺旋構型，并聚集發展成三維網絡結構。制備活性智能膜時，體系的pH值即為結冷膠本體pH值(5.4)，顯酸性，加入花青素后，花青素分子帶正電，結冷膠分子鏈上的羧基帶負電，二者之間產生靜電相互作用，同時花青素分子上的羥基也會和結冷膠分子鏈上的羥基形成氫鍵，這些作用會降低結冷膠分子鏈上羥基的可用性，使得結冷膠分子鏈間氫鍵作用減弱，影響分子鏈的聚集，使得網絡結構弱化，導致活性智能膜的抗拉強度降低，水蒸氣透過率增大。

圖3 活性智能膜的SEM圖像Fig.3 SEM of gellan gum-red cabbage anthocyanin active and intelligent film

圖4 結冷膠-紫甘藍花青素活性智能膜網絡結構形成機理Fig.4 Structure of gellan gum-red cabbage anthocyanin active and intelligent film before and after adding anthocyanin

2.2.3熱性能

圖5給出了活性智能膜的熱重圖譜，由圖5可知，所有樣品在25～500℃范圍內均出現兩個質量損失階段。第1階段大概發生在70℃左右，主要是活性智能膜中自由水和結合水的損失；第2階段發生在150～250℃，主要是結冷膠熱分解所致。由圖5可知，隨著花青素質量濃度的升高，最大失重溫度逐漸升高，質量損失逐漸減小，說明適量花青素加入可以增加膜的熱穩定性，這與文獻[29]的研究結果一致。綜上所述，結冷膠-紫甘藍花青素活性智能膜在低于100℃時具有較好的熱穩定性，適用于大多數食品包裝。

圖5 活性智能膜的TGA曲線和DTG曲線Fig.5 TGA and DTG curves of gellan gum-red cabbage anthocyanin active and intelligent film

2.2.4花青素釋放實驗

圖6給出了活性智能膜的花青素釋放曲線，不難發現，質量濃度為0.06 g/mL的花青素溶液在546 nm波長下存在最大吸光度0.050，而GR-0.06在75%乙醇溶液和無水乙醇溶液浸泡12 h后吸光度分別為0.002與0.001，且浸泡后的溶液為無色，說明紫甘藍花青素被成功固定在活性智能膜中。

圖6 GR-0.06殘留溶液的紫外-可見光譜Fig.6 UV-Vis spectra of residue solutions of GR-0.06

2.3 活性智能膜的酸度敏感性

在不同的pH值環境中，花青素會以黃烊鹽離子(紅色)、甲醇假堿(無色)、醌式堿(藍色)和查爾酮(無色，淡黃色)4種結構形式共存[30]。表2給出了活性智能膜在pH值1.0～12.0緩沖溶液中的顏色變化，顯然，所有樣品均隨著pH值的改變發生了顯著的顏色改變，總體而言，pH值為1.0～3.0范圍內顯示紅色，pH值為4.0～7.0時為紫色，pH值為8.0～11.0時為藍色，pH值為12.0時變為綠色。

表2 活性智能膜在不同pH值緩沖溶液中的色差Tab.2 Chromaticity parameters and photographs of gellan gum-red cabbage anthocyanin active and intelligent film in different buffer solutions

在確定的花青素質量濃度下，隨著pH值增大，紅度a*減小，膜的顏色由紅變綠。在確定的pH值下，活性智能膜的亮度L*隨著紫甘藍花青素含量的增加而減小，說明膜的顏色逐漸加深，這也與肉眼觀測的結果一致。此外還可發現，隨著pH值的增大，膜的色差ΔE出現了先減小后增大的變化趨勢，但彼此間差異較大，說明結冷膠-紫甘藍花青素活性智能膜有望用于食品品質指示。

2.4 活性智能膜對大黃魚新鮮度的指示

根據膜的理化性質和酸度敏感性的研究結果，選擇了綜合性能和指示性能較好的GR-0.02用于大黃魚新鮮度評價。TVB-N含量(揮發性鹽基氮質量比)是國際通用的評價肉類與魚類等新鮮度的主要指標，對于大黃魚而言，0～13 mg/(100 g)為一級鮮度；13～30 mg/(100 g)為二級鮮度，大于30 mg/(100 g)為腐敗變質。TVC也是評價魚類新鮮度的重要指標，0～4 lg CFU/g為一級鮮度，4～6 lg CFU/g為二級鮮度，大于6 lg CFU/g魚肉腐敗。TBA可評價魚類脂肪氧化程度，TBA為1～2 mg/kg時，魚肉腐敗[31]。

研究發現，4℃下貯藏，大黃魚的TVB-N含量、TBA、TVC均隨著貯藏時間的延長而逐漸增大，初始TVB-N含量為7.07 mg/(100 g)，TBA為0.35 mg/kg，TVC為2.64 lg CFU/g。貯藏1 d時，TVB-N含量為8.24 mg/(100 g)，TBA為0.42 mg/kg，TVC為3.48 lg CFU/g，為一級鮮度。貯藏4 d時，TVB-N含量為14.56 mg/(100 g)，TBA為0.76 mg/kg，TVC為4.39 lg CFU/g，為二級鮮度；貯藏9 d時，TVB-N含量為30.02 mg/(100 g)，TBA為1.35 mg/kg，TVC為5.85 lg CFU/g，大黃魚腐敗變質。

隨著大黃魚品質的劣變，活性智能膜顏色產生了顯著改變。以TVB-N含量為主要鮮度評價指標，考察了活性智能膜顏色改變與大黃魚鮮度之間的關系，結果如圖7所示。可見，初始時，活性智能膜顏色為紫色，貯藏1 d后，TVB-N含量變為8.24 mg/(100 g)，ΔE為6.12(已經可以被肉眼識別)，膜的顏色變為淺紫色。貯藏4 d后，TVB-N含量升至14.56 mg/(100 g)，ΔE為12.32，膜的顏色變為藍色；貯藏9 d后，TVB-N含量升至30.02 mg/(100 g)，魚肉腐敗變質，膜的顏色變為綠色，ΔE變為31.28，這種顏色變化可由非專業人士裸眼識別。由此可見，GR-0.02活性智能膜顏色變化與大黃魚新鮮度密切相關。

圖7 大黃魚貯藏過程中活性智能膜色差變化曲線Fig.7 Change of color difference for active intelligent film during large yellow croaker storage

為了確定活性智能膜的可視性變化與大黃魚品質改變的相關性，進一步考察了ΔE與大黃魚鮮度指標TVB-N含量、TBA、TVC之間的相關性，結果表明，ΔE與TVB-N含量決定系數R2=0.922 5，p<0.01。ΔE與TBA決定系數R2=0.961 3，p<0.01。ΔE與TVC的決定系數R2=0.942 3，p<0.01。由此可知，GR-0.02膜的ΔE與各指標呈顯著相關性，可用于大黃魚新鮮度的評定。

2.5 活性智能膜的抗氧化活性

2.5.1DPPH自由基清除率

DPPH被廣泛應用于評定膜的抗氧化能力。未添加花青素的結冷膠膜僅具有微弱的抗氧化活性(DPPH自由基清除率6.81%)，這可能與結冷膠中羥基有關。花青素的添加顯著提高了膜的抗氧化活性，當花青素質量濃度為0.002 g/mL時，DPPH自由基清除率就增至67.01%，且隨著花青素含量的增大，膜的抗氧化活性增強。當花青素質量濃度從0.006 g/mL升至0.06 g/mL，膜的DPPH自由基清除率從75.38%增至91.47%。文獻[32]發現當花青素質量濃度為0.3 g/(100 mL)時，淀粉-明膠-黑馬鈴薯花青素智能膜的DPPH自由基清除率為60.87%。文獻[33]發現卡拉膠-羥丙基甲基纖維素-山桃稠李果汁綠色包裝膜的最大DPPH自由基清除率為28.76%。顯然，本研究制備的活性智能膜抗氧化活性遠高于文獻中結果。

2.5.2活性智能膜對豬油的保鮮

過氧化值與酸價是評價油脂酸敗的重要指標，活性智能膜對豬油保鮮效果如圖8所示。新鮮豬油的過氧化值與酸價分別為1.32 mmol/kg和0.24 mg/g，25℃儲藏30 d后，對照組的過氧化值與酸價分別達到8.41 mmol/kg和1.65 mg/g，超過國標限值，豬油變質。活性智能膜處理組樣品的過氧化值與酸價均顯著低于對照組，且均未超過國標限定值。這可能是因為活性智能膜不僅阻止了豬油與氧氣的接觸，同時還具有良好的抗氧化活性，有效緩解了豬油的酸敗。花青素含量越高，活性智能膜對豬油的保鮮效果越好。本研究制備的活性智能膜處理組樣品在儲藏時間為15 d時，過氧化值為2.22～2.82 mmol/kg，酸價為0.41～0.48 mg/g；貯藏20 d時，豬油的過氧化值為2.64～3.51 mmol/kg，酸價為0.49～0.61 mg/g，在類似的研究中，貯藏15 d時，卡拉膠-羥丙基甲基纖維素-山桃稠李提取物復合膜包裹的豬油過氧化值為4.95～8.09 mmol/kg，酸價為1.01～1.43 mg/g[34]；貯藏20 d時，卡拉膠-羥丙基甲基纖維素-山桃稠李果汁綠色包裝膜包裹的豬油過氧化值為3～4 mmol/kg，酸價為1.25～1.30 mg/g[33]。由此可見，結冷膠-紫甘藍花青素活性智能膜具有良好的抗氧化活性，在油脂包裝領域具有廣闊的應用前景。

圖8 不同活性智能膜對豬油過氧化值和酸價的影響曲線Fig.8 Effects of different active and intelligent film on peroxide value and acid value of lard

3 結論

(1)制備了結冷膠-紫甘藍花青素活性智能膜，其結構均勻，兼具抗氧化活性和品質指示特性。

(2)活性智能膜可用于大黃魚新鮮度的實時無損檢測中，其顏色變化與TVB-N含量、TBA、TVC變化規律一致，ΔE與鮮度指標(TVB-N含量、TBA、TVC)顯著相關，R2在0.922 5～0.961 3范圍內，p<0.01。

(3)活性智能膜對豬油的保鮮效果優異，可用于油脂包裝領域。