TRPV5基因多態性與腎含鈣結石疾病的相關性研究

范先明 林劍鋒 涂建平 梁福律 葉志彬 張明芽 李亞楠 郭昭建 胡力仁

（福建中醫藥大學附屬廈門市第三醫院泌尿外科，福建 廈門 361100）

泌尿系結石在我國乃至全世界都是常見的疾病，其發病率仍持續增加，我國發病率高達6.06%，但呈不均衡分布，男性多于女性，農村高于城市，南方高于北方[1]；而含鈣結石是最常見的泌尿系結石的類型[2]。泌尿系結石病因涉及環境和遺傳因素等方面[3]。研究發現泌尿系結石患者其親屬50%～70%患有泌尿系結石[4]。而Curhan等[5]對泌尿系結石患者的家庭成員限制鈣攝入量后，結石風險增加，導致人們對遺傳因素、環境因素及混雜因素增加泌尿系結石的風險存有疑惑。目前有基因的作用研究支持有泌尿系結石病史的家庭中有常染色體顯性遺傳可能[6]。全基因組關聯分析（genome-wide association study wide association，GWAS）是在全基因組范圍內常見遺傳變異（單核苷酸多態性和拷貝數）與疾病進行輪廓性的整體性的關聯分析方法，篩選出與疾病相關的SNPs。目前僅有少量來自歐洲和日本關于泌尿系結石形成中調節鈣和磷酸鹽代謝的各種基因位點的GWAS，認為常見遺傳變異的尿液轉運蛋白和大分子是尿路結石病相關的危險因素[7-8]。GWAS研究易于實施并呈上升的趨勢，是評估復雜疾病（如腎結石）的遺傳決定因素，實用且經濟高效的方式，在資源有限的研究環境中有明顯的優勢[9]。目前已經發現許多與增加腎結石風險相關的SNP位點[10-14]。但能夠減少腎結石風險相關的SNP位點較少報道。本研究旨在確定TRPV5、UMOD基因中常見遺傳變異與泌尿系結石患者易感性之間的潛在關聯。此外，我們還通過收集和分析與含鈣腎結石易感性相關的TRPV5、UMOD基因多態性的現有數據，采用了系統的方法，這是通過使用含鈣腎結石病患者和健康對照的候選基因關聯研究確定的，通過Logistic回歸分析影響含鈣腎結石發病的危險因素，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 研究組：隨機選擇在廈門市第三醫院確診的腎含鈣腎結石共237例為研究對象，時間為2017年10月至2020年7月，年齡52～73歲，平均（64.78±3.93）歲；對照組：選擇我院同期的無泌尿系結石病史的健康者149名，年齡55～74歲，平均（65.31±3.87）歲。兩組一般資料比較，P＞0.05，具有可比性。采用相同方法分析血清中的鈣、尿素和肌酐，并分析尿液以研究尿鈣排泄[15]。通過問卷調查獲得研究組與對照組年齡、性別、BMI、腎結石家族史的詳細信息。對所有的參與研究的結石患者進行隨訪，以了解結石的復發情況。本研究已經獲得倫理委員會批準。

1.2 納入和排除標準

納入標準：年齡18～85歲；確診泌尿系結石患者；患者屬于中國國籍及漢族；臨床資料完整；患者經結石成分分析為含鈣結石。

排除標準：有腎結石家族史的患者；懷孕期、哺乳期的泌尿系結石患者；有骨髓自體移植和外周干細胞移植等器官移植史，及近期輸血史患者；有明顯精神障礙及中樞神經系統障礙史者；伴有嚴重泌尿系感染或活動性消化道潰瘍需要治療者；合并有長期的尿路梗阻、甲狀腺功能亢進、慢性腸道疾病、甲狀旁腺功能亢進、不能控制的糖尿病等疾病患者；合并惡性腫瘤患者。

1.3 方法 收集研究組血液樣本237例及對照組血液樣本149例。留取EDTA抗凝血標本，棄去上清后留取其他的細胞成分，存放于-80 ℃冰箱，待后采用苯酚-氯仿法提取DNA，測定DNA濃度及純度，保持DNA A260/280在1.7～1.9。在第三方檢測機構中檢測目的基因SNP。

試驗流程：樣品質檢—設計引物??—PCR驗證—PCR擴增—PCR產物回收純化—建庫—上機測序—數據分析。利用HapMap據庫（http://hapmap.ncbi.nlm.nil.gov/）以及相關文獻，選擇候選基因功能性SNP位點位于啟動子、5'-非翻譯區（5'-UTR）、內含子和3'-非翻譯區（3'-UTR）等，且滿足在CHB人群中MAF＞0.05。與TVRP5相關的3個單核苷酸多態性（SNP）（rs17210、rs17212和rs17262），UMOD基因相關的SNP（rs13329952、rs11648131和rs9652588）已進行調查。對于所有SNP，樣品中的檢出率約為91%。經χ2檢驗驗證了受試者符合Hardy-Weinberg平衡（HWE）。根據SNP位點序列信息并采用Assay Designer 3.1軟件進行引物設計PCR反應和單堿基擴展引物，并交由有限公司合成。TRPV5、UMOD基因各個SNP位點引物序列詳見表1。多聚酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)在4 μL體系中進行，每個微孔中的總體積為4 μL，包括1 μL基因組DNA，0.625 μL 10×PCR緩沖液，1 μL引物使用液，0.325 μL MgCl2，0.1 μL HotstarTaq，用雙蒸水補足不足體積。PCR反應條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 20 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，72 ℃ 3 min，4 ℃ forever。PCR反應后，多余的脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP）和引物用SAP酶清除，SAP程序：37 ℃40 min，85℃ 5 min，4 ℃ forever。延長反應，延長反應條件：1.94 ℃ 30 s；2.94 ℃ 5 s；3.52 ℃ 5 s；4.80 ℃ 5 s；5.72 ℃ 3 min；6.4 ℃ forever。3～4步驟5個循環后，2～4步驟再40個循環。產物純化及構建文庫，把檢測樣品轉移到表面覆蓋基質的Mass ARRAY SpectroCHIP測序芯片上，即可放入質譜儀進行全自動分析檢測，每個檢測點只需3～5 s。應用邊合成邊測序方式進行測序，堿基種類根據4種不同的熒光信號來確認，并保證核酸序列質量。試驗結果用TYPER軟件分析并獲得分型數據。

表1 TRPV5、UMOD 基因SNP位點的合成引物序列

1.4 研究指標 研究對象的基本情況、飲食和運動情況。研究對象基本情況包括：年齡、性別、基礎病（糖尿病、心血管疾病等）和體質量指數（BMI）。

1.5 統計學方法 收集的資料符合正態分布的用（）描述。利用SPSS 25.0統計軟件，兩組獨立樣本采用Student's檢驗，3組樣本及以上計量資料用方差分析。統計所有樣本中SNP位點的分型情況，基因型、最小等位基因數（MAF）以及不同等位基因/基因型的比例。使用χ2檢驗檢查受試者中每個的基因型頻率是否偏離Hardy-Weinberg平衡（HWE），P＞0.05被認為與HWE差異無統計學意義。使用χ2檢驗分析不同基因型/等位基因與腎結石發病風險之間的相關性，以P＜0.05其相關性差異有統計學意義。通過二元Logistic回歸分析了SNP與含鈣結石患者之間的關聯，確定比值比（odds ratio，OR）及其95%置信區間（confidenceInterval，CI）。

2 結果

2.1 兩組基本資料比較 研究組的BMI、血尿酸、血肌酐、收縮壓及收縮壓顯著高于對照組（P＜0.05），其他指標差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 兩組基本資料比較（）

表2 兩組基本資料比較（）

2.2 兩組TRPV5和UMOD基因多態性分布比較 研究組TRPV5基因rs17212位點的等位基因A的頻率顯著高于對照組（P＜0.05），rs17212位點AA、GA的基因型顯著高于對照組（P＜0.05），UMOD基因rs11648131位點的等位基因C的頻率顯著高于對照組（P＜0.05），rs11648131位點CC的基因型顯著高于對照組（P＜0.05），其他點位基因多態性差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3、表4。

表3 兩組TRPV5基因多態性分布比較

表4 兩組UMOD基因多態性分布比較

2.3 含鈣腎結石危險因素Logistic回歸分析 Logistic回歸分析結果顯示年齡≤35歲、BMI和rs17212是含鈣腎結石發病的危險因素（P＜0.05），rs11648131是含鈣腎結石發病的保護因素（P＜0.05），血尿酸與含鈣腎結石無明顯相關性。見圖1。

圖1 Logistic回歸分析泌尿結石危險因素的OR值

3 討 論

目前腎結石可通過許多微創的方法治療，但其有較高的殘石率及復發率，腎結石仍是泌尿外科中棘手問題之一[16]。在泌尿系結石中以草酸鈣或磷酸鈣結石為主，主要成分是鈣離子[17-18]。既往研究表明，高尿鈣癥也是泌尿系結石的主要危險因素之一，遺傳和環境風險因素會對原尿液中鈣離子再吸收產生重大影響，繼而導致泌尿系結石[19-20]。因此，促進尿液鈣離子再吸收和減少尿鈣排泄可能是減少腎結石形成的一種方式。

在腎臟中，TRPV5蛋白質主要在腎遠曲小管和連接小管的上皮中表達，是鈣離子重吸收的最后門戶，在尿原液中鈣離子的重吸收和維持鈣離子的穩態中起重要的作用[21-23]。已有研究證明，TRVP5基因敲除的小鼠表現出Ca2+重吸收減少，增加腸道鈣吸收和降低骨密度[24-25]，用小的活化RNA（ds-320）激活TRVP5后可促進大鼠尿鈣離子的重吸收并減少尿鈣離子的排泄，從而抑制乙二醇誘導的草酸鈣晶體形成[26]。TRPV5表達下調直接降低大鼠尿液中鈣離子重吸收，直接導致尿鈣丟失并導致高鈣尿癥[27]。這表明TRPV5的表達水平涉及腎結石的形成，上調TRPV5的表達可能是腎結石一個新的治療方法。

TRPV5單核苷酸多態性主要在高鈣性疾病中。首個報告在美國非洲裔中TRPV5有A8V、R154H（rs4236480）、A563T和L712F的基因多態性，僅R154H（rs4236480）與高尿鈣相關[28]。在20例高的尿鈣患者中檢測到TRPV5的SNP（A8V、R154H和A561T），盡管對TRPV5通道功能沒有受到影響[29]。與野生型TRPV5相比，TRPV5的S682P突變導致小鼠模型中出現高鈣尿癥、多尿癥、高磷尿癥和更酸性的尿液[30]。在我國臺灣地區人群中，發現與泌尿系結石相關TRPV5基因多態性位點是rs4236480，因為攜帶TT+CT基因型的患者比CC基因型患者患結石的風險增加[31]。Oddsson等[32]通過全基因組關聯研究（GWAS）發現TRPV5與泌尿系結石的復發存在明顯相關性（OR=3.62，P=4.1×10-5）。在本研究中，所選得TRPV5的SNP（rs17210，rs17212和rs17262）僅發現rs17212與腎結石的發病風險顯著相關，在腎結石的患者中rs17212的AA 純合子基因型攜帶者高于其他基因型攜帶者，rs17212是腎結石的危險因素之一[OR=2.210，95%CI（1.040～4.698）]。

UMOD 基因位于染色體16p12上，編碼哺乳動物尿液中含量最高的尿調節蛋白（Tamm-Horsfall蛋白）。GWAS發現UMOD單核苷酸多態性（SNPs）對含有鈣的腎結石具有保護作用[33]。UMOD通過細胞外作用和減少TRPV5的內吞作用來上調TRPV5，刺激Ca2+重吸收有助于防止腎結石發生的風險，形成并具有抑制結石形成特征的巨細胞[34-35]。在本研究中UMOD 3個多態性位點（rs13329952、rs11648131和rs9652588）僅發現rs1164813多態性位點與腎結石的發病風險顯著負相關，在腎結石患者中CC純合子基因型攜帶者低于CG雜合子基因型攜帶者，有助于防止腎結石發生的風險。

這項研究仍然存在局限性。由于潛在的SNP是根據已發表的文章和公共數據庫選擇的，因此我們可能會錯過其他一些潛在的功能遺傳變異性，這些變異不一定是SNPs。其次，偏差可能由本研究的樣本量相對較小引起，需要進一步研究樣本量較大的樣本量來驗證我們的發現。此外，這項研究的參與者都是中國人，最好將這項研究擴展到不同的種族群體，并檢驗我們發現的有效性。此外，雖然我們已經揭示了SNP rs17212、rs1164813與腎結石之間的關聯，但實際分子和細胞機制仍有待探索。