非洲豬瘟病毒污染運(yùn)輸車輛模擬消毒試驗(yàn)

劉 俊，楊作豐，張皓淳，魏 澍，陳揚(yáng)揚(yáng)，吳曉傲，王宏燕，龐學(xué)敏，董 娜，劉金玲

（1.遼寧省農(nóng)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，遼寧沈陽 110015；2.康平新望農(nóng)牧有限公司，遼寧沈陽 110500；3.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)，遼寧沈陽 110161；4.沈陽市農(nóng)業(yè)綜合行政執(zhí)法隊(duì)，遼寧沈陽 110031）

自2018 年非洲豬瘟（ASF）在我國首次暴發(fā)以來，大量生豬染疫死亡或被撲殺，造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失。ASF 目前尚無可用疫苗，防控難度大[1]。非洲豬瘟病毒（ASFV）是一種雙鏈DNA 病毒，粒子直徑大小為260 nm，具有雙層脂質(zhì)囊膜結(jié)構(gòu)，基因組大小為170～190 kb，pH 耐受范圍為3.9～11.5，在低溫冷凍環(huán)境下可以存活數(shù)年，但經(jīng)56 ℃處理70 min、60 ℃處理20 min 或80 ℃處理3 min 可被滅活[2]。豬偽狂犬病毒（PRV）也是一種雙鏈DNA 病毒，粒子直徑大小為180 nm，具有脂質(zhì)單層囊膜結(jié)構(gòu)，基因組大小為150 kb，pH 耐受范圍為4～12，55～60 ℃處理30～50 min 或80 ℃處理3 min 可被滅活。可見ASFV 和PRV 在生物學(xué)特性和理化特性方面均具有極高的相似度。由于對ASFV 的研究需要在國家授權(quán)的相應(yīng)級別生物安全實(shí)驗(yàn)室中才能進(jìn)行，因此將PRV 作為ASFV臨床研究標(biāo)識物成為研究者們的普遍選擇[3]。

精準(zhǔn)清洗消毒是控制ASF 傳染源、切斷傳播途徑和保護(hù)易感動(dòng)物的關(guān)鍵措施[4]。對運(yùn)輸車輛進(jìn)行消毒是疫情應(yīng)急處置及日常防控工作的重要環(huán)節(jié)[5]，而碾壓消毒墊和駛過消毒池是運(yùn)輸車輛較常用的兩種消毒方式。為驗(yàn)證以上兩種消毒方式對ASFV 的殺滅效果，本研究采用PRV 疫苗稀釋液作為ASFV 替代標(biāo)識物，噴灑車輪模擬ASFV 污染，在車輛碾壓消毒墊和駛過消毒池后不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行車輪采樣檢測。本試驗(yàn)對運(yùn)輸車輛碾壓消毒墊和駛過消毒池兩種方式的消毒效果進(jìn)行了評價(jià)，以期為優(yōu)化ASF 疫情應(yīng)急處置方案和日常消毒防控措施提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

杜邦衛(wèi)可（主要成分為過硫酸氫鉀三鹽復(fù)合物，稀釋度1:200），購自杜邦衛(wèi)可動(dòng)物保健公司；火堿（化學(xué)成分為氫氧化鈉，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%），購自內(nèi)蒙古君正化工有限責(zé)任公司；“喜可凈”PRV活疫苗（主要成分為PRV Bartha K-61 株，稀釋度為1:100），購自西班牙海博萊生物大藥廠。

試驗(yàn)用車、消毒墊（麻袋）、消毒池（長15 m、寬4 m、深30 cm）、噴霧設(shè)備，由康平新望農(nóng)牧有限公司提供或建造；ATP 清洗消毒效果檢測儀、采樣棉拭子、一次性培養(yǎng)皿、一次性涂抹棒、采樣管、PBS 樣品緩沖液、塑料薄膜，由遼寧省農(nóng)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心提供。

ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix、2×TaqPlus Master Mix，購自南京諾唯贊生物科技有限公司；無菌除酶水，購自索萊寶公司；pBM16A Toposmart 克隆試劑盒，購自博邁德生物公司；DH5α 感受態(tài)，購自全式金生物公司；麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，購自廣東環(huán)凱微生物公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 消毒墊消毒試驗(yàn) 試驗(yàn)車輛經(jīng)過充分清洗，經(jīng)ATP 生物熒光檢測儀檢測RUL 值小于50，表示達(dá)到試驗(yàn)可接受水平；試驗(yàn)車輛車頭前鋪設(shè)20 m長的潔凈厚塑料薄膜，在薄膜上沿車輪碾壓路線鋪設(shè)15 m長麻袋，噴灑1:200稀釋的杜邦衛(wèi)可消毒劑，直至充分浸潤。在車輛一側(cè)每個(gè)車輪的底部均勻選擇6 個(gè)5 cm×5 cm 的采樣點(diǎn)并用著色劑標(biāo)記，用1:100 稀釋的PRV 活疫苗均勻噴灑整個(gè)車輪；開動(dòng)車輛緩慢碾壓浸潤杜邦衛(wèi)可消毒液的麻袋，并在碾壓后0、1、2、3、4、5 min 對每個(gè)車輪的標(biāo)記位點(diǎn)進(jìn)行采樣，同一車輪的樣品混樣裝入同一采樣管（含10 mL PBS）內(nèi)，4 ℃送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測。

1.2.2 消毒池消毒試驗(yàn) 試驗(yàn)車輛和消毒池經(jīng)過充分清洗，經(jīng)ATP 生物熒光檢測儀檢測RUL 值小于50，表示達(dá)到試驗(yàn)可接受水平；車輛一側(cè)每個(gè)車輪的側(cè)面均選擇6 個(gè)5 cm×5 cm 的采樣點(diǎn)并用著色劑標(biāo)記，用1:100 稀釋的PRV 活疫苗均勻噴灑4 個(gè)車輪；開動(dòng)車輛緩慢駛過注滿2%火堿消毒液的消毒池，并在駛過消毒池后0、2、5、10 min對每個(gè)車輪的標(biāo)記位點(diǎn)進(jìn)行采樣，同一車輪的樣品混樣裝入同一采樣管（含10 mL PBS）內(nèi)，4 ℃送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測。

1.3 樣本檢測

1.3.1 反應(yīng)體系及反應(yīng)條件 以PRV Bartha K-61 株gB基因?yàn)榘行蛄性O(shè)計(jì)1對引物，優(yōu)化建立了1 套SYBR Green 染料熒光定量PCR檢測方法。上游引物F：5'-GTCTGTGAAGCGGTTCGTGAT-3'；下游引物R：5'-ACAAGTTCAAGGCCCACATCTAC-3'。反應(yīng)體系：ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 5.0 μL，無菌除酶水3.6 μL，模板1.0 μL，上下游引物（10 pmol/μL）各0.2 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性10 s，60 ℃退火延伸30 s，共40 個(gè)循環(huán)。

1.3.2 陽性標(biāo)準(zhǔn)品制備 以PRV Bartha K-61 株gB基因?yàn)榘行蛄辛硗庠O(shè)計(jì)1 對引物。上游引物F：5'-CTGGCCTCGGACGTCTT-3'；下游引物R：5'-GCGGTCACCTTGTGGTTG-3'。目標(biāo)擴(kuò)增片段包含熒光定量PCR 檢測方法的擴(kuò)增片段。反應(yīng)體系：2×TaqPlus Master Mix 50 μL，無菌除酶水32 μL，模板10 μL，上下游引物（10 pmol/μL）各4 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，58℃ 20 s，72℃ 1 min，共30 個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。以PRV Bartha K-61 株DNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后回收目的片段連接到pMD18-T 載體上，轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)。挑選鑒定正確的陽性質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品，將標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10 倍倍比稀釋，采用建立的SYBR Green 染料熒光定量PCR 方法進(jìn)行擴(kuò)增，每種梯度標(biāo)準(zhǔn)品做3 個(gè)重復(fù)，以拷貝數(shù)的次方值為橫坐標(biāo)，Ct 值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 PRV 核酸檢測 對樣本拭子進(jìn)行渦旋震蕩洗脫，各取同一采樣時(shí)間點(diǎn)（消毒墊模式0、1、2、3、4、5 min；消毒池模式0、2、5、10 min）4個(gè)車輪的洗脫液50 μL 混合成200 μL 的混合洗脫液，提取樣本DNA，采用建立的熒光定量PCR 方法進(jìn)行檢測，以滅菌水為陰性對照，“喜可凈”PRV活疫苗為陽性對照，每個(gè)樣本做3 個(gè)重復(fù)。

1.3.4 細(xì)菌培養(yǎng)計(jì)數(shù) 對樣本拭子進(jìn)行渦旋震蕩洗脫，各取同一采樣時(shí)間點(diǎn)（消毒墊模式0、1、2、3、4、5 min；消毒池模式0、2、5、10 min）4 個(gè)車輪的洗脫液100 μL 混合成400 μL 的混合洗脫液；分別取100 μL 混合洗脫液均勻涂布于麥康凱瓊脂培養(yǎng)皿上，以滅菌水為陰性對照，車輪駛過消毒墊和消毒池前4 個(gè)車輪棉拭子樣本PBS 洗脫液為陽性對照，37 ℃倒置培養(yǎng)48 h 后采用平板菌落計(jì)數(shù)法進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，每個(gè)樣本做3 個(gè)重復(fù)。

2 結(jié)果

2.1 陽性標(biāo)準(zhǔn)品制備與檢測方法建立

經(jīng)測定，標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)為3.968×106copies/μL，通過10 倍倍比稀釋至3.968×102copies/μL，采用建立的SYBR Green染料熒光定量PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為y=-3.299 9x+36.965，R2=0.993，R2＞0.99 表示所建方法和線性回歸方程有效（表1 和圖1）。

表1 10 倍梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品熒光定量PCR 檢測結(jié)果

2.2 碾壓消毒墊消毒效果

試驗(yàn)條件下車輛碾壓駛過消毒墊后0、1、2、3、4、5 min，車輪PRV 檢測的Ct 值隨時(shí)間增加而增加，將Ct 值分別帶入線性回歸方程y=-3.299 9x+36.965，得到樣本中病毒拷貝數(shù)的次方值（表2）；車輛碾壓駛過消毒墊后0、1、2、3、4、5 min，車輪可被檢測的菌落數(shù)呈下降趨勢（表3）。結(jié)果說明，車輛碾壓消毒墊（含衛(wèi)可）對PRV 和細(xì)菌均有殺滅作用，殺滅效果隨時(shí)間增加而增強(qiáng)，但消毒墊模式消毒后5 min 仍無法殺滅所有PRV，細(xì)菌殺滅率為92.5%。鑒于PRV 與ASFV 在生物學(xué)特性和理化特性上具有高度相似性，因此推定在相同試驗(yàn)條件下杜邦衛(wèi)可消毒液對ASFV 具有相似的殺滅效果。

表2 消毒墊方式PRV 殺滅效果

表3 消毒墊方式細(xì)菌計(jì)數(shù)結(jié)果

2.3 駛過消毒池消毒效果

試驗(yàn)條件下車輛駛過消毒池后0、2、5、10 min，車輪PRV 檢測的Ct 值隨時(shí)間增加而增大，可被檢測的PRV 含量呈逐漸下降趨勢，駛過消毒池后10 min 未檢測到PRV 核酸，將Ct 值帶入線性回歸方程y=-3.299 9x+36.965，得到樣本中病毒拷貝數(shù)的次方值（表4）；車輛駛過消毒池后0、2、5、10 min，車輪可被檢測的菌落數(shù)呈下降趨勢，5 min 后殺菌率為94.6%，10 min 后殺菌率達(dá)到98.3%（表5）。結(jié)果說明，車輛駛過消毒池（含火堿）對PRV 和細(xì)菌均有殺滅作用，殺滅效果隨時(shí)間增加而增強(qiáng)，駛過消毒池后10 min 即可有效殺滅所有PRV。鑒于PRV 與ASFV 在生物學(xué)特性和理化特性上具有高度相似性，因此推定在相同試驗(yàn)條件下火堿對ASFV 具有相似的殺滅效果。

表4 消毒池方式PRV 殺滅效果

表5 消毒池方式細(xì)菌計(jì)數(shù)結(jié)果

3 討論

本研究經(jīng)過試驗(yàn)確定了兩種消毒方法對ASFV和細(xì)菌均能起到有效殺滅作用，但殺滅效果受消毒時(shí)間長短影響較大。陳家锃[6]從消毒劑作用機(jī)理方面歸納了影響ASFV 消毒效果的七大因素，發(fā)現(xiàn)消毒時(shí)間不足是ASFV 消毒中最常見的誤區(qū)之一，每種消毒劑在特定濃度下都有最短殺菌時(shí)間，消毒作用時(shí)間必須長于最短消菌時(shí)間才能起到消毒作用。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，碾壓消毒墊方式在消毒后5 min 仍能檢測到病毒核酸，也無法殺滅所有細(xì)菌，提示一次性無停留短時(shí)碾壓消毒墊方式對車輪攜帶病毒和細(xì)菌的殺滅效果有限，與相關(guān)類似研究結(jié)果具有一致性。建議在使用消毒墊方式消毒時(shí)，在消毒劑有效使用期內(nèi)延長車輛在消毒墊上的停留時(shí)間或使用多組消毒墊間隔組合等方式延長病毒和細(xì)菌與消毒劑的作用時(shí)間，確保消毒效果。本試驗(yàn)用消毒池長15 m，車輪在消毒池中的行進(jìn)長度大于5個(gè)輪胎周長，因此輪胎攜帶的病毒和細(xì)菌與消毒液接觸時(shí)間較長，但基層多數(shù)消毒池實(shí)際長度達(dá)不到此標(biāo)準(zhǔn)，建議通過往復(fù)行駛多次等方法延長車輛駛過消毒池的時(shí)間來增強(qiáng)消毒效果。

“杜邦衛(wèi)可”溶解于水后會發(fā)生鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，持續(xù)產(chǎn)生小分子自由基、次氯酸、新生態(tài)氧和活性氧衍生物，通過氧化和氯化反應(yīng)使病原體蛋白變性，產(chǎn)生的羥基自由基可作用于病原體DNA 磷酸二酯鍵，干擾其合成，從而破壞殺滅病原微生物[7-8]。余婷等[9]研究“杜邦衛(wèi)可”對ASFV 的消毒殺滅效果發(fā)現(xiàn)，在1:800 的稀釋比例下，衛(wèi)可消毒劑對ASFV 仍然有效；南文龍等[10]也證實(shí)過硫酸氫鉀類消毒劑對ASFV 熒光定量PCR 檢測Ct 值影響顯著。火堿屬于強(qiáng)堿類，火堿溶液作用于病原體可以使其蛋白質(zhì)和核酸發(fā)生變性和降解。綜上可知，杜邦衛(wèi)可和火堿均能對ASFV 核酸產(chǎn)生降解作用，而以被降解的核酸為模板會直接影響到熒光定量PCR 的Ct 值。因此，應(yīng)用SYBR Green 熒光定量PCR 方法評價(jià)“杜邦衛(wèi)可”和火堿的消毒效果是可行的[11]。如王巍等[12]發(fā)現(xiàn)，針對ASFV 消毒效果的評價(jià)，應(yīng)該在確定ASFV 滅活方法的機(jī)理基礎(chǔ)上，通過分析ASFV 基因組結(jié)構(gòu)和序列特點(diǎn)，挖掘ASFV 的代謝脆弱區(qū)進(jìn)行核酸檢測。該論述為尋找更加科學(xué)的ASFV 消毒效果評價(jià)方法提供了新思路，對本研究方法改進(jìn)提供了科學(xué)借鑒。