牛副結核病防控

王淑娟，楊為強，宋 梅，于小靜，呂 艷，孫成友，王 華，吳曉東

（1.中國動物衛生與流行病學中心，山東青島 266032；2.青島市即墨區農業農村局，山東青島 266200）

牛副結核病（bovine paratubereulosis） 也稱牛副結核性腸炎，由Johne 和Frothingham 于1895 年首次發現，所以又叫約翰氏病（Johne's disease），是一種反芻動物的慢性消化道疾病，由副結核分枝桿菌（Mycobacterium aviumsubsp.paratuberculosis，MAP）引起，是以持續性頑固性腹瀉、漸進性消瘦為特征的慢性腸道肉芽腫性人獸共患傳染病[1]，常見于牛，特別是奶牛，給畜牧業造成了巨大危害。世界動物衛生組織（WOAH）將副結核病列為須通報動物疫病，我國將其列入三類動物疫病。

1 病原學

1.1 病原分類

牛副結核病的病原為副結核分枝桿菌，屬于分枝桿菌屬，與結核分枝桿菌相似。

1.2 病原特點

革蘭氏陽性桿菌，專性細胞內寄生，不能在環境中繁殖，但能在水中的變形蟲體內復制[2]；具有抗酸染色的特性；病原抵抗力強，耐寒、耐高溫、耐干燥、耐紫外線、耐酸性環境，在被污染的土壤及水源中能存活1 年以上[3]，為需氧菌；最適生長溫度37.5℃，最適pH6.8～7.2[4-5]。MAP 為短桿菌，長0.5～1.5 μm，寬0.3～0.5 μm，不形成芽孢和莢膜，無鞭毛，有的呈球桿狀，有的呈短棒狀[4]；病原體在組織和糞便中排列成團狀或叢狀，形態不典型，在感染的動物體內，主要存在于病灶部位。

1.3 培養特性

病原進行細菌培養生長緩慢，分離極為困難，需要特殊培養基進行培養，比如添加分枝桿菌素的Herrold 氏卵黃培養基，一般接種5～8 周后，最長達6 個月后才能觀察到肉眼可見小菌落，最初透明小菌落呈半球狀，隨著培養時間的延長，菌落外觀似乳頭狀。

2 流行病學

2.1 傳染源

病畜和潛伏感染的帶菌畜是主要傳染源，其分泌的乳汁和排出的糞便、尿液等都可能污染環境、水源、生產用具而傳播該病。人類副結核病的主要傳染源是患畜的乳、肉制品及內臟器官等，其次是被污染的環境、水源等，未見人與人直接傳播的報道[6]。

2.2 傳播途徑

牛副結核既可水平傳播也能垂直傳播。主要傳播途徑是動物采食了被污染的飼料、牧草或飲水經消化道傳播，也可通過精液或胎盤垂直傳播。犢牛可經母體胎盤或乳汁感染該病病原[7-8]。在感染牛群牛舍的塵埃中也能檢測到病原菌，研究證明氣溶膠也是重要的水平傳播方式之一。引進感染牛是傳播該病的主要方式，處于發病階段的病牛排菌量是潛伏期的100 倍以上，1 頭臨床病牛排出的病原菌能感染超過25 頭健康牛[9]。

2.3 易感動物

主要易感動物為反芻動物，包括牛、羊、駱駝、羊駝、鹿等，另外馬、豬、猴、兔、狐貍、黃鼠狼等也可被感染。MAP 易感性與年齡有關，年齡越小越易感，6 月齡以下幼畜最易感，尤其是出生后24 h 之內的犢牛。牛特別是奶牛最易感，母牛在懷孕、分娩及泌乳期一旦機體抵抗力變差就更容易被感染。另外飼養管理不善、飼料營養不均衡、飼料缺乏礦物質、飼養密度過大等原因都可使牛免疫力降低從而易感。易感性還和牛的品種有關，娟姍牛比荷斯坦牛更易感[9]。

2.4 潛伏期

動物感染該病后潛伏期一般都很長，最長可達15 年，大部分約有2～5 年的隱蔽期和亞臨床期，所以發病牛基本在2～6 歲出現臨床癥狀，但4～15月齡的牛也可能發病，這與應激、營養不良、抵抗力差、感染其他病原等有關。

2.5 流行特征

該病無明顯的季節性，但常發生于春秋兩季。該病特點是發展緩慢、病程長、感染率高，大多呈地方性流行或散發，集中養殖狀態下發病率較高，多數集中發病于規模養殖場，分散飼養發病率較低。此外，母牛妊娠、生產及泌乳期間或者氣候惡劣、劇烈變化時發病率高。

2.6 流行概況

牛副結核病呈全球性分布，遍布世界各地，在世界各國均有流行，給養牛業造成了嚴重經濟損失，尤其是美國、英國、德國、加拿大、澳大利亞等養牛業發達國家深受其害[10-11]。2013 年美國奶牛個體陽性率為5%～10%，牛群陽性率達91.1%。我國最早是1955 年在內蒙古一牧場發現該病，此后該病又在黑龍江、遼寧、河北、貴州、山西、陜西、新疆等很多地區發生。吳建勇[12]等在2014—2015年對新疆某牛場連續4 次開展血清學檢測，發現副結核病陽性率分別為13.51%、2.91%、7.55%、33.33%，4～5 歲牛群檢出率最高，檢測間隔時間越長對防控該病越不利。孫雨等[13]2014—2015 年對我國山西、西藏、新疆、河北、青海、重慶、湖北等地區開展了牛副結核病的血清學調查，發現陽性率分別是3.75%、3.5%、2.2%、2.0%、1.5%、0.75%、0.5%。近年來由于奶牛和肉牛業發展非常迅速，集約化、規模化養殖越來越多，牛副結核病也呈上升趨勢：北京奶牛場該病的發病率普遍在10%～12%[14]；胡曉艷等[15]2017—2019 年對上海市松江區的規模牛場隨機采樣進行牛副結核病抗體檢測，發現3 年的抗體陽性率分別為1.6%、0.7%、4.4%；趙怡雯[16]等在2018—2020 年對大連市的規模化奶牛場進行了血清學檢測，發現3 年的抗體陽性率分別為8.04%、2.07%、8.31%。

3 危害

該病潛伏期長，患畜長期大量排菌，傳染性強，無有效治療方法，一旦發病很難凈化根除，給牛場造成的經濟損失非常嚴重，對畜牧業危害非常大。主要危害有患病牛消瘦、生產性能下降、飼料轉化率降低、產奶量下降、受胎間隔時間延長、引發乳房炎和繁殖障礙、易感染其他病原甚至死亡[17-18]等。該病可造成奶牛產奶量下降5.9%～20.0%，牛群死亡率增加6.0%。據估計，每年美國奶業因副結核病造成的經濟損失為2 億～15 億美元，每年每頭牛遭受的經濟損失為75～100 美元[10]，僅由于產奶量下降每年就有2 億美元的損失[14]。英格蘭每年因副結核病造成的損失達15.4 億美元[10]。我國1頭患有副結核的奶牛被淘汰造成的經濟損失達1 萬元以上[14]。此外，人類食用被MAP 污染的牛肉、牛奶或奶制品，接觸或食用污染的內臟器官等感染MAP 造成潰瘍性腸炎、過敏性腸道癥狀[9]，被稱為克羅恩病（Crohn's disease）。傳統的巴氏消毒法不能將奶制品中的MAP 完全殺死，所以該病不但嚴重危害畜牧業，也對人類有潛在威脅。該病在養牛業發達國家廣泛流行，目前尚未有國家能徹底消滅該病，美國酪農雜志曾將該病稱為養牛業的“癌癥”[17]。

4 診斷

早發現早診斷對于疫病防控非常重要。該病在發病初期癥狀與腹瀉類疾病相似，容易與牛病毒性腹瀉、寄生蟲性胃腸炎、冬痢等疫病混淆，所以可結合臨床表現和病理變化進行初步診斷，再通過實驗室方法進行確診[18]。

4.1 臨床表現

該病潛伏期長，病牛發病初期無明顯臨床癥狀，發病后臨床上主要表現為腹瀉、營養不良、貧血、消瘦、體重下降、生產力下降、嗜睡甚至死亡等。發病早期會出現間歇性腹瀉，然后慢慢發展成頑固性腹瀉，糞便常呈噴射狀排出，稀薄帶有氣泡和大量黏液并伴有惡臭，有時會有血塊。隨著病期延長，病牛反芻功能下降，精神不振、食欲減退、逐漸消瘦、眼窩凹陷、生產性能嚴重下降、泌乳減少甚至停止、虛弱無力、臥地不起等[19]。

4.2 病理變化

病理學特征為慢性增生性腸炎，腸系膜淋巴結炎及淋巴管肉芽腫。主要病理變化在消化道和腸系膜淋巴結。消化道的損害主要集中于空腸、回腸和結腸前段，特別是回腸腸壁增厚，腸黏膜脫落，表面不平整，質地變硬。腸內容物稀少，含有大量液體和少量氣泡，有惡臭。漿膜下淋巴管和腸系膜淋巴結異常腫大，呈索狀，暗褐色，切面外翻，多汁。腸黏膜異常增厚達3～20 倍，并形成明顯的硬而彎曲的皺褶，黏膜呈黃色或灰色，皺褶凸起充血而色紅，有稠而渾濁的黏液[14]。但無明顯臨床癥狀的牛撲殺后剖檢未見上述病變特征。

4.3 實驗室診斷方法

4.3.1 鏡檢法 病原學檢測最常用方法是直腸黏膜糞便檢菌法[20]——將直腸刮取物或糞便黏液制成涂片，經抗酸染色后鏡檢確診，可觀察到紅色短小桿菌單個或分枝狀排列。該方法操作簡單，但由于副結核分枝桿菌的排出是周期性的，不一定得到陽性結果，需要間隔進行多次檢測，另糞便樣品中還可能存在其他的抗酸菌，容易出現假陽性。

4.3.2 細菌分離培養法 將病料用4% H2SO4或2% NaOH 處理后中和，接種于選擇性固體培養基，如添加分枝桿菌素的Herrold 氏卵黃培養基、Dubos 培養基、小川氏培養基或Waston-Reild 培養基等[21]，培養大約5～8 周，有的長達6 個月后才會長出小菌落。細菌培養是唯一不會產生假陽性的方法，是診斷該病的“金標準”，但該方法操作要求高，培養成本高，耗費時間長，很難應用于生產實踐[5]。

4.3.3 PCR 法 常用的PCR 方法有常規PCR 和熒光定量PCR。常規PCR 一般根據MAP 基因組中 的F57、IS900、Ismap02、IS1311、Locus255等基因序列設計引物建立傳統PCR、巢式PCR 或多重PCR。熒光定量PCR 根據MAP 基因組中的F57、IS900等基因序列設計引物探針來建立[20-21]。PCR 方法有操作簡便、快速、成本低，敏感性和特異性都比較高等優點，但也可能存在假陰性和假陽性。

4.3.4 變態反應法 用提純的副結核菌素和禽型結核菌素進行皮內注射，具體操作方法和判定同結核菌素皮內接種試驗相同。為了更好地確診，可以在頸部兩側分別做結核和副結核變態反應，皮差較大側則為陽性；也可以靜脈注射，體溫升高1 ℃為判定標準。此方法可檢出感染初期大部分的亞臨床癥狀或無癥狀病畜，但有明顯臨床癥狀的病畜不適合用此法，許多牛在感染中后期會出現耐受性或皮試無反應[20]。

4.3.5 血清學方法 血清學方法有瓊擴試驗（AGID）、補體結合試驗（CFT）、酶聯免疫吸附試驗（ELISA）等。AGID 特異性不高，存在一定比例假陽性；CFT 操作復雜，也存在假陽性，不適合大規模檢測。現在應用最多的是ELISA。該方法快速、靈敏、準確、操作簡單，適合大規模檢疫，是目前用于檢測MAP 血清抗體最敏感而特異的方法，在出入境檢疫及牛場凈化中發揮著重要作用[22]。研究發現，混合抗原建立的ELISA 方法敏感性和特異性均高于單一抗原建立的ELISA方法。Speer 等[23]2006 年用甲醛和超聲裂解處理MAP，提取表面抗原建立ELISA 方法，發現其敏感性和特異性都高達95%以上，高于商業提供的ELISA方法。

4.3.6 全血γ-干擾素ELISA 牛感染MAP 后可對其進行體外模擬變態反應。致敏的淋巴細胞會釋放γ-干擾素，而γ-干擾素可用ELISA 方法檢測。該方法敏感性為50%左右，特異性在95%以上[23]。

4.3.7 小結 副結核病的診斷方法有很多種，但是每一種都有優缺點，在實際應用中應多種方法聯合應用，盡可能提高檢測的敏感性和特異性，這對牛場的凈化和出入境檢疫都有重要意義。牛感染MAP后，機體首先產生細胞免疫，然后是體液免疫。變態反應法檢測的是細胞免疫反應，即感染初期還未表現臨床癥狀的牛，ELISA 方法檢測的是體液免疫反應，即感染中后期表現臨床癥狀的牛，在牛場中用變態反應和ELISA 同時檢測，二者互相補充，可作為確診和凈化該病的有效手段[20]。

5 防控措施

養牛業是畜牧業的重要組成部分，我國對布魯氏菌病、結核病等動物疫病的防控比較重視，制定了專門的防控規劃，但副結核病由于感染初期無臨床癥狀，一般2～5 歲才表現臨床癥狀，所以在牛場的疫病防控中很容易被忽視。隨著我國經濟的發展，越來越多的牛場發病，嚴重危害畜牧業的健康發展，同時該病的防控一直是世界性難題，如何進行有效防控一直是生產者和研究人員探討的問題。考慮到存在潛在的人畜共患風險，探討該病的有效防控措施對于養殖業的健康發展和人畜的健康安全具有重要意義。該病的防控措施主要從以下幾方面入手。

5.1 免疫

疫苗免疫能夠在一定程度上降低牛場副結核病的發病率，在成本上比檢測并淘汰陽性牛更低。歐美副結核病嚴重的國家經過長期試驗，認為對新生犢牛進行免疫注射，配合必要的獸醫衛生防控措施是防控該病最有效的辦法，如果嚴格按照這一防控措施執行，一般5～10 年可以消除該病[24]。目前常用的商品化疫苗有弱毒活疫苗和滅活苗兩種。英國及一些東歐國家一般用弱毒活疫苗，美國、挪威等國家用滅活苗[25]。但瑞典政府禁止奶牛用副結核疫苗，美國副結核疫苗的使用也有限制條件[9]。由于牛接種疫苗后在注射部位會產生肉芽腫，會干擾牛結核病的診斷，所以一般不建議使用疫苗，如果要在副結核感染牛群使用疫苗，在新生犢牛一出生就進行隔離并喂消毒乳，7 日齡內進行疫苗接種，同時隔離犢牛并由專人飼養，舍內清掃消毒，用過疫苗的牛禁止出售。目前我國尚未有商品化疫苗。

5.2 犢牛繁育

副結核病主要發生在新生犢牛階段，年齡越小越易感，主要通過糞-口途徑傳播，所以加強圍產牛和犢牛的管理，減少犢牛接觸病原是預防該病的關鍵。

待產母牛經過檢測，陽性母牛和陰性母牛要分開產犢，每頭母牛要有單獨的產欄并保持干凈。繁育犢牛時，要減少糞便污染犢牛。若母牛經檢測呈陽性，產犢后應立即將犢牛與母牛分開，給犢牛人工喂養經過滅菌的初乳或陰性牛的牛乳[26]。我國目前奶牛場普遍采取措施如下：對副結核感染牛群中的新生犢牛，出生后立即與母牛分開，給犢牛飼喂經80 ℃加熱滅菌20 min 的消毒乳，由專人飼養，勤清掃衛生，經常用來蘇兒等消毒。犢牛隔離后分別在1、3、6 月齡進行檢測，如果一直為陰性則1 歲以后同健康牛一起混群飼養，如果為陽性，則直接淘汰[27]。

5.3 加強飼養管理

牛場飼養管理水平的好壞直接關乎牛群的生長狀況、抵抗力高低和牛場的經濟效益，因此養殖場平時應加強飼養管理。

（1）應盡量采取“全進全出”的飼養原則，不同日齡的牛不進行混養。注意牛的保暖和防寒，增強牛體質和抗病力。

（2）飼料營養一定要均衡，要注意飼料的配比，滿足不同時期生長的需要，特別是犢牛、懷孕母牛、高產奶牛，不要突然改變飼料，對犢牛要給予充足的營養，提高其免疫抗病能力。不飼喂發霉、污染的飼料，避免飲用被污染的飲水，可以在飼料中添加磷等礦物質，緩解腹瀉癥狀[28]。

（3）創建良好的活動場所，讓牛到運動場上自由活動。運動可以增加牛的抵抗力，強健犢牛骨骼。運動場要定期清理糞尿，保持干凈。犢牛出生1 周以后，最好每日有 l h 的戶外運動時間，夏季避開中午以防犢牛中暑。陰冷等惡劣天氣不要運動。

（4）飼養員平時要做好牛群的日常巡查，經常巡視觀察牛群身體和精神健康狀況，對牛的飲食、排泄等情況要有所了解，發現異常要及時處理。大群飼養時，對有問題的牛，如食欲不振、精神狀態差、消瘦、腹瀉等牛要做好標記，進行重點飼養管理，必要時做好診斷排除工作。

5.4 加強引種檢疫

引種不慎往往是發病的主要原因，所以要認真對待引種工作，不從疫源地引種，加強引種檢疫，這是預防該病的有效措施。

禁止從疫區引進牛種，從場外引進牛時，要做好調查，保證引進的牛來自清潔的牛場。引種應進行嚴格的檢疫、隔離，禁止受感染牛進場，隔離一個月后無異常再混群飼養。

5.5 加強生物安全防控

平時加強生物安全，做好牛場環境的衛生消毒工作，做好感染牛及被污染環境的處理工作，能有效防止該病的傳播。

（1）牛場要執行嚴格的消毒制度，定期進行全場消毒，在牛場入口和牛舍的入口設消毒池，對進出車輛和人員嚴格消毒。對環境、用具等要用消毒藥科學有效消毒。

（2）飼養員禁止在舍內飲水、吃東西，注意個人衛生，與牛接觸后要洗手，不吃未消毒的原料奶和未煮熟的肉類和內臟，不得隨意串舍，不得交叉使用舍內用具及設備等。

（3）對腹瀉且久治不愈的病牛必須認真檢查，需要進行剖檢時應在專門的實驗室進行，必要時采取細菌學檢查或變態反應等診斷方法判斷病牛是否患有副結核病；若確定患病，應及時淘汰所有陽性牛。病、死牛不得出售，應按照國家有關規定處理，嚴禁拋于道路兩旁壕溝地溝、池塘。及時清理牛舍內的糞便，運動場的積糞也應定期清理，尤其在雨季。

（4）被病牛污染過的牛舍、欄桿、飼槽、用具、繩索和運動場等，要用生石灰、來蘇兒、苛性鈉、漂白粉、石炭酸等消毒液進行噴霧、浸泡或沖洗。牛舍在消毒后1 年內不能再飼養動物。糞便應堆積高溫發酵后作肥料用。

（5）牛場要設立隔離區，減少牛群間的接觸。若發現疑似病牛，立即將其隔離飼養觀察，加強監控，不與健康牛混群飼養。疑似牛須定期檢測，連續三次以上陰性可判定為假定健康牛，如果檢測為陽性或仍然可疑則按照陽性牛處理。

（6）對曾檢出過病牛的牛群，要在8 月齡后進行全面、定期檢測，每年至少檢測3～4 次，通過淘汰陽性牛等全場凈化措施防控該病擴散流行，逐步凈化牛群[29]。

5.6 加強宣傳培訓指導

加強培訓宣傳指導工作，讓養殖戶充分了解該病的流行特點、傳播途徑，加強防護，做好防范工作，一旦牛場發病可以做到早發現、早診斷、早處理。

5.7 加大政策支持力度

疫病的凈化需要政府部門的大力支持，把消毒滅源、監測流調、撲殺凈化、流通監管、宣傳培訓等經費列入各級政府預算。盡早淘汰陽性牛并給予適當的經濟補貼，對有效控制該病的擴散傳播有重要的實踐意義。

5.8 加大監督執法力度

各級農業農村主管部門應強化產地檢疫的執法力度，健全執法、監督和追責的制度體系，用法律手段堵住活畜無序流通帶來的防控漏洞，從源頭減少病畜的流動從而控制疫病的傳播。

5.9 其他防控措施

通過基因檢測選育MAP 抗性牛也是以后防控該病的研究方向之一[9]。另外，近幾年有研究[9]發現，鎵可以在體外抑制多種MAP 菌株的生長，是目前世界上公認的效果最全面的抗菌劑，含鎵制劑有望被開發成有潛力的非傳統抗菌藥物用于防控MAP。

6 結語

綜上所述，該病的防控應以預防為主，盡可能消滅傳染源，切斷傳播途徑，阻斷易感動物接觸病原，從而減少新感染的發生。加強檢疫、隔離、淘汰凈化是控制該病的有效方法，檢疫淘汰措施對于控制該病的流行擴散有積極意義。一旦牛場發病一定要做到早發現早診斷，盡快控制已發病牛群，采取相應防控措施防止該病擴散。一定要重視該病，平時牛場要從犢牛繁育、飼養管理、牛群的抵抗力、引種檢疫、生物安全等方面入手；政府部門要加強宣傳培訓，加大政策支持力度和監督執法力度，多方面采取綜合性防控措施防控該病。在該病未來的防控實踐中，一定要加強政府層面的防控規劃，只有從上到下都切實做好相關的防控工作，形成科學有效的綜合性防控體系，才能減少該病的發生并嚴格控制該病的傳播，從而將該病對畜牧業及公共衛生的危害降至最低。