兩種免疫檢測法在HIV 抗體檢測中的效果對比分析

劉世豫，田居靈，梁 靜（通信作者）,宋晨輝

（1 新疆醫科大學第六附屬醫院輸血科 新疆 烏魯木齊 830002）

（2 烏魯木齊市第一人民醫院檢驗科 新疆 烏魯木齊 830011）

（3 新疆醫科大學第六臨床醫學院 新疆 烏魯木齊 830011）

獲得性免疫缺陷綜合征（acquired immune deficiency syndrome, AIDS）是由人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus, HIV）感染引起，可通過攻擊患者免疫系統，將淋巴細胞大量吞噬，并破壞其合成，最終導致免疫系統崩潰。目前，AIDS 在人群中的傳染性極強，病死率較高，暫無有效的預防與治療手段，對患者的生命帶來巨大威脅。因此，HIV 的早期診斷就顯得極為重要，盡早發現感染者、切斷傳播途徑對抑制AIDS 的傳播具有積極的意義。但HIV 的檢測具有一定的特殊性，任何漏檢或誤檢均可對被檢者與社會造成重大的影響，因此，臨床篩查HIV 的方法需具有較高的敏感性與特異性。酶聯免疫吸附試驗法（enzymelinked immunosorbent assay, ELISA）因其簡便、敏感、易于標準化等優點，被廣泛運用于HIV 篩查中。但ELISA 檢測方法存在著操作復雜、檢測周期長等缺點，可一定程度上影響檢測結果。電化學發光免疫分析法（electrochemiluminescence immunoassay, ECLIA）較ELISA 法較為快捷，且檢測的敏感性也較高，在HIV 篩查中具有一定的優勢。但臨床研究發現，ELISA 與ECLIA法檢測陰性也不能完全排除HIV 感染的風險。因此關于兩種檢測方式的具體價值目前尚無定論。基于此，本文旨在探討ELISA 法與ECLIA 法用于HIV 抗體檢測中的效果，現報道如下。

1.資料與方法

1.1 一般資料

選取2017 年7 月—2021 年7 月新疆醫科大學第六附屬醫院進行HIV 抗體檢測的10 316 份血液樣本。

納入標準：①受檢者存在艾滋病高危因素（如娛樂場所從業人員、男男同性戀、伴侶較多、與HIV 攜帶者性接觸等），疑似HIV 感染；②受檢者意識清晰，認知功能良好；③受檢者既往未接受過相關的治療。排除標準：①受檢者患有惡性腫瘤；②受檢者存在嚴重感染；③心、肝、腎等臟器功能不全者；④無效血液標本或存在血液性疾病。受檢者中男5 977 例，女4 339 例；年齡18 ～65 歲，平均年齡（31.56±4.42）歲。

1.2 方法

儀器與試劑：ELISA 采用EL10A 型酶標儀（濟南鑫貝西生物科技有限公司）及武漢伊艾博科技有限公司試劑；ECLIA 采用CIA 型全自動電化學發光免疫分析儀及配套試劑（濟南歐萊波技術有限公司）。ELISA：（1）取受檢者清晨空腹外周肘靜脈血液6 mL，分別裝于2 個不同的試管內，低溫保存待檢。（2）將1 支待檢血液，采用離心機（重慶三大偉業制藥有限公司），以3 000 r/min 速率離心10 min，取血清。（3）將酶標板取出，設置為1孔樣品、1 孔空白對照、2 孔陰性對照、3 孔陽性對照模式，并對其進行標記；將對應陽性、陰性對照品及樣品各100 μL 分別加入出空白孔外的其他每孔中。（4）置于37 ℃恒溫箱中經30 min 孵育，孵育結束后，用洗板機洗板6 次，洗板洗滌液用量為400 μL 每孔每次，加洗滌液后需靜置10 s，洗板結束后，拍干殘余洗液。（5）每孔加入酶標記抗原100 μL（空白孔除外），輕輕振蕩，蓋好封板膜，置于37 ℃恒溫箱中再次進行30 min 孵育、6 次洗板及拍干后，加入底物液，進行15 min 避光反應后加終止液使反應終止。（6）應用酶標儀讀取各孔吸光度（Absorbance, OD）值，cut-off 值=陰性對照OD均值+0.1，樣品OD 值＞cut-off 值為陽性。操作過程嚴格按照試劑盒操作說明書進行，將檢測結果為陽性樣本送HIV 確認中心確認。ECLIA：（1）取另1 支待檢測樣品，采用離心機（重慶三大偉業制藥有限公司），以800 r/min 速率離心處理5 min，將樣品與生物素抗HIV-1p24 單克隆抗體孵育成抗原-抗體復合物。（2）將磁微粒應用磁石收集好，將其中未反應物質除去，而后加抗HIV 抗原（經堿性磷酸酶標記）與磁微粒的HIV 抗體反應。（3）再次將磁微粒應用磁石收集好，將其中未反應物質除去，再加入發光底物后充分攪拌，使磁微粒分散，隨后添加清洗劑。檢測復合物發光強度，計算cut-off 值。結果確認：將檢測結果為陽性樣本送HIV 確認中心確認（主要采用方法為蛋白印跡法）。

1.3 觀察指標

（1）檢測陽性率：統計并比較兩種檢測方法檢測陽性標本數量。（2）初篩結果比較：觀察兩種方法檢測HIV 抗體濃度分布情況及與檢測結果符合率。

1.4 統計學方法

2.結果

2.1 兩種HIV 抗體檢測方法陽性率、假陽性率比較

10 316 份檢測樣本中，ELISA 檢測出陽性樣本30 份，陽性率為0.29%（30/10 316）；ECLIA 檢測出陽性樣本28 份，陽性率為0.27%（28/10 316），ELISA 與ECLIA檢測陽性率比較，差異無統計學意義（＞0.05）；最終經確認中心確認陽性樣本26 份。ELISA 法假陽性率15.38%（4/26）；ECLIA 法假陽性率7.69%（2/26）。兩種檢測方法假陽性率比較，無顯著差異（＞0.05）。見表1。

表1 兩種HIV 抗體檢測方法陽性率比較[n（%）]

2.2 兩種檢測方法初篩結果與確認結果比較

ELISA 法檢測出陽性樣本的吸光度值/臨界值（OD/CO）多分布于1.35 ～1.80 范圍內，確診符合率均值為83.61%；ECLIA 檢測出陽性樣本的臨界值（cutoff）多在150.00 ～220.00 范圍內，確診符合率均值為89.58%。但兩種方法確診符合率均值比較，差異無統計學意義（= 1.535，= 0.215），見表2、表3。

表2 ELISA 測定結果與確認結果比較

表3 ECLIA 測定結果與確認結果比較

3.討論

HIV 病毒屬于RNA 病毒逆轉錄病毒克慢性毒屬，HIV感染者到疾病進展至“全面暴發”的AIDS 前有一個較長的潛伏期，因此無癥狀HIV 感染不易被發現，臨床干預較為困難，患者的病死率較高。因此，檢測HIV 感染、監測病毒在患者體內的復制情況、了解感染后病情的發展等對于病毒傳播的控制及用藥的指導等具有十分重大的意義。

目前，檢測HIV 抗體的常用方法包括ELISA 法及ECLIA 法。（1）ELISA 法是在不改變抗體的免疫學特性的情況下，酶分子與抗體或抗原的蛋白分子共價結合（該種結合不會改變抗體的免疫學特性，也不影響酶的生物學活性），通過底物溶液的滴加，在酶的作用下使底物所含的供氫體發生還原反應，呈現出顏色的變化，以此來判斷是否發生免疫反應，具有一定檢測價值。（2）ECLIA 法將高靈敏度的化學發光測定技術與高特異性的免疫反應相結合，具有較高的靈敏度、特異度，被廣泛用于各種抗體、抗原、激素、酶等的監測與分析中。且ECLIA 法具有線性范圍寬、線性擬合度好、操作快速簡便、不存在環境污染等優點，能夠提高HIV 抗體檢測的準確性，已逐步成為檢測的主流技術。但具體何種檢測方法價值更高還需探究。

本文結果顯示，通過ELISA 法與ECLIA 法檢測HIV抗體，樣本呈現陽性率的差異無統計學意義。提示兩種檢測方式用于HIV 抗體檢測均可達到一定的符合率。分析原因可能為，（1）ELISA 法檢測的敏感性雖然較高，但該種方法需要游離抗原、抗體及結合狀態的抗原、抗體，因此需要反復加樣及洗板，操作相對復雜，且用于檢測的包被孔之間有時會因為交叉污染而出現假陽性，導致檢測結果可能存在一定誤差。（2）ECLIA 將抗體（抗原）用法學發光劑直接標記，與待檢測樣本中相應的抗原（抗體）和磁顆粒性抗體（抗原）發生免疫反應后，以磁場的方式分離出不同狀態下的化學發光標記物，此時加入氧化劑和氫氧化鈉呈現堿性環境，吖啶酯即可在無催化劑的情況下分級、發光。但是，從HIV 感染到血清轉陽前的一段時期內，通常會遇到檢測不出HIV 特異性抗體的窗口期，其時間長短因病毒的致病性和宿主的免疫應答不同而異。因此，檢測HIV 的方法仍需繼續探討。

OD/CO 值cut-off 值越高，確認符合率越高。本文結果還顯示，ELISA 法檢測出陽性樣本的吸光度值/臨界值（OD/CO）多分布于1.35 ～1.80 范圍內，確診符合率均值為83.61%；ECLIA 檢測出陽性樣本的臨界值（cut-off）多在150.00 ～220.00 范圍內，確診符合率均值為89.58%。但兩種方法確診符合率均值比較，差異無統計學意義（= 1.535，= 0.215）。提示兩種檢測方式均對高濃度下HIV 抗體準確率更高。這可能是因為高濃度下，檢測試劑的反應性更為強烈，因此檢測準確度也相較提升。楊若男等收集鄭州大學第一附屬醫院646 例患者篩查HIV 情況發現，ECLIA 診斷HIV 抗體的ROC 曲線下面積為0.990，cutoff 值32.17,靈敏度97.10%，特異度96.20%，CLIA 檢測值COI 越大，蛋白印跡法的陽性率越高。該結果可為采用酶聯免疫試驗檢測HIV 抗體的檢測策略提供重要的參考依據。本文結果與其一致，但在每次檢測中并不能排除無低濃度樣本的存在，因此兩種檢測方式呈現的陽性樣本需要送確認中心進行再次確認。林琳等研究建議，實驗室應該用兩種方法同時進行HIV 抗體檢測，以此排除不同試劑靈敏性差異的缺陷。因而，臨床HIV 抗體檢測時可考慮ELISA法與ECLIA 法聯合檢測，對提高檢測陽性率可能具有一定的意義。

綜上所述，ELISA 法與ECLIA 法用于HIV 抗體檢測中效果顯著，符合率較高，但兩種方法各有優劣勢。無論是ELISA 法還是ECLIA 法檢測HIV 抗體，在結果報告時仍需參照患者的臨床進行相應的綜合分析，對檢測是否為陽性做出客觀的判斷，為明確是否隨訪、進一步確定實驗結果等提供重要的參考依據。因時間限制，未對試驗的條件進行優化和全面的評價，下一步擬優化反應條件，減少外界因素對檢測結果的影響。