基于網絡藥理學與分子對接探討丹參-川芎藥對改善肝癌癌前病變的作用機制

雷雅婷 唐 浪 吳廣陽　

基于網絡藥理學與分子對接探討丹參-川芎藥對改善肝癌癌前病變的作用機制

雷雅婷 唐 浪 吳廣陽

（湖北民族大學醫學部，湖北恩施 445000）

目的：應用網絡藥理學、分子對接技術預測丹參-川芎藥對改善氣滯血瘀型肝癌癌前病變的機制。方法：利用TCMSP提取丹參、川芎的化合物組成與靶點關系。利用OMIM和GeneCards網站獲得肝癌的疾病靶點，依據交集靶點，通過STRING網站獲得蛋白互作網絡，R語言V4.0.3進行GO、KEGG富集分析。結果：關鍵靶蛋白為ESR1、HSP90AA1、CCND1等，排名靠前的化合物是木犀草素、3β-羥基丹參酮IIA等；KEGG富集通路發現丹參-川芎藥對影響肝癌癌前病變主要通過乙型肝炎、PI3K-AKT等信號通路；分子對接結果顯示木犀草素等有效化合物都能與ESR1、HSP90AA1、CCND1等核心靶蛋白良好的結合。結論：丹參-川芎藥對改善肝癌癌前病變具有多靶點，多通路的特點。其治療機制可能與調控ESR1、HSP90AA1、CCND1等關鍵蛋白的活性有關。

丹參-川芎藥對；肝癌癌前病變；網絡藥理學與分子對接

引言

肝癌的發病率位居全球惡性腫瘤第六位，死亡率位居第三位，其中肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）占肝癌的75%～85%，每年全球新增肝癌病例約84萬，新增死亡病例約78萬[1]。

目前肝癌的首選治療方法是化療與免疫治療，但仍存在經濟負擔大，預后差等不可忽視的問題。因此，尋求安全有效的抗肝癌藥物極為迫切。跟據肝癌的臨床表現、體征，可歸屬于中醫的“肝積”“癖積”“脅痛”等病癥的類別[2]。傳統中藥復方、提取物和有效成分被廣泛用于肝癌的預防和治療，具有一定的療效和良好的安全性，包括欖香烯、華蟾素、康萊特注射液等[3]。原發性肝癌可分為氣滯血瘀型、肝膽濕熱證、（胃腸）陰虛證、（腎）陽虛水停證等四個基本分型[4]，氣滯血瘀既是肝癌發生的病因，也是其病理因素?！皻鉃檠畮?，血為氣之母”，氣能生血行血，故氣滯可致血瘀，血能載氣養氣，故血瘀又導致氣滯。

中醫對于氣滯血瘀與肝癌的關系尤為重視，常用行氣活血法治療肝癌，丹參-川芎藥對是行氣活血之經典藥對，常被用來防治肝癌，但其防治肝癌的具體機制尚不明確，因此本文擬通過網絡藥理學與分子對接對丹參-川芎藥對防治肝癌癌前病變的機制進行探討，并用體內實驗驗證，以挖掘潛在的治療靶點，為中醫藥預防肝癌癌前病變提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 數據來源

從TCMSP數據庫（http: //tcmspw.com/index.php）提取丹參-川芎藥對的化合物組成及靶點信息，從OMIM網站（https://omim.org/）、GeneCard網站（https: //www.genecards. org/）得到疾病的靶點信息，在STRING網站（https: //string-db.org/）上得到蛋白互作網絡（PPI），從KEGG網站（https: //www.kegg.jp/）獲取KEGG信息。

1.2 藥物-化合物-靶點-疾病網絡圖

從TCMSP數據庫提取丹參-川芎藥對的化合物組成、化合物靶點關系（限定參數OB＞30%、DL＞0.18），OMIM、GeneCards網站檢索疾病“cancer of the liver”的靶點，獲得疾病的靶點關系；R語言V4.0.3軟件安裝”VennDiagram”包，得到藥物-化合物-靶點-疾病信息，然后相關信息導入cytoscape V3.8.2以獲取藥物-化合物-靶點-疾病網絡圖。

1.3 PPI網絡

將丹參-川芎藥對的交集靶點導入STRING網站，得到PPI網絡圖，將TSV文件導入R語言V4.0.3軟件，得到PPI統計圖。

1.4 GO、KEGG富集分析

在R語言V4.0.3軟件中安裝“RSQLite”“org.Hs.eg.db”程序包，將丹參-川芎藥對的交集靶點名轉換為對應的基因ID；安裝“colorspace”“stringi”“DOSE”“clusterProfiler”“pathview”程序包，基于基因ID分別進行GO、KEGG富集分析得到柱狀圖與氣泡圖。

1.5 分子對接

從PubChem下載化合物、PDB網站下載蛋白質三維結構，在pymol中進行去水去配體的處理，在Autodock4 進行加氫、加電荷操作，找到蛋白質中心點位置、大?。ㄈ鏓SR1蛋白：center_x = -1.3，center_y =- 23.832，center_z =0.324；size_x = 93.75，size_y = 98.25，size_z = 105.0），然后進行分子對接導出pdbqt文件，得到的結果采用pymol軟件進行可視化分析。

2 結果

2.1 化合物-靶點-疾病網絡

利用TCMSP數據庫提取丹參－川芎的化合物組成、化合物靶點關系（限定參數OB＞30%、DL＞0.18），得出丹參，川芎含有72種有效化合物。其中丹參有效成分65個，川芎有效成分7個，有效成分OB值排名前十的化合物列舉在表1中。丹參有效成分靶點數64個，川芎有效成分靶點數17個，肝癌評分＞10的靶點數1900個，丹參-川芎與肝癌交集后，得到交集靶點44個（見圖2），將疾病靶點與中藥化合物靶點導入至Venny2.1.0在線工具繪制交集靶點的韋恩圖（見圖2），然后相關信息導入cytoscape V3.8.2以獲取藥物-化合物-靶點-疾病網絡圖（見圖1）。

表1 丹參－川芎藥對中OB值居前10位的化合物基本信息

注：Mol ID：分子編號；Molecule name；分子名稱；OB：生物利用； DL：類藥性

圖1 “藥物-活性成分-關鍵靶點-疾病”可視化網絡圖

圖2 丹參、川芎有效成分與肝癌的交集靶點

2.2 PPI網絡

將交集靶點導入STRING網站，發現交集靶點中的雌激素受體1（estrogen receptor 1，ESR1），熱休克蛋白90α家族A類成員1（heat shock protein 90 alpha family class A member 1，HSP90AA1），細胞周期蛋白D1（cyclin D1，CCND1）可與多種蛋白發揮作用。如ESR1蛋白能HSP90AA1，CCND1等33種蛋白質發揮作用，HSP90AA1蛋白能與ESR1，CCND1等31種蛋白發揮作用，CCND1能與ESR1，HSP90AA1等30種蛋白相互作用（見圖3、圖4）。

2.3 GO、KEGG富集分析

GO富集分析可觀察到：DNA結合轉錄、核受體活動、配體激活的轉錄因子活性等通路可能為丹參-川芎藥對治療肝癌的機制。KEGG富集分析可觀察到，化學致癌-受體激活（chemical carcinogenesis-receptor activation）、前列腺癌（prostate cancer）、脂質和動脈粥樣硬化（lipid and atherosclerosis）、乙型肝炎（hepatitis B）信號通路可能為丹參－川芎藥對改善肝癌癌前病變的機制（見圖5、圖6）。

圖3 丹參-川芎藥對治療PLC的靶蛋白相互作用網絡圖

圖4 丹參-川芎藥對治療PLC的靶蛋白相互作用統計圖

圖5 丹參-川芎藥對治療PLC的GO富集分析圖

圖6 丹參-川芎藥對治療PLC的KEGG富集分析圖

2.4 分子對接

分子對接是一種常見的預測分子間結合模式與親合力的方法，當結合能＜0 kcal/mol時，表明配體分子能和受體自發結合；當結合能＜-4.0 kcal/mol時，表明配體分子能和受體結合良好[5]。將交集靶點數最多的10種化合物與PPI數最高的蛋白質（ESR1、HSP90AA1、CCND1）進行對接，結果表明犀草素、3β-羥基丹參酮IIA、脫氧新隱丹參酮等結合能均小于-4 kcal/mol，說明這些活性成分能有效結合上述蛋白，可能對靶蛋白活性具有調節作用。以木犀草素為例，分子對接結果顯示其可與ESR1蛋白的LYS-360、殘基位點結合，與HSP90AA1蛋白的THR-184、ASN-51等殘基結合，與CCND1蛋白的ARG-26、LYS-33、ASP-126等殘基結合（見圖7至圖9）。

圖7 木犀草素與ESR1分子對接可視化

圖8 木犀草素與HSP90AA1分子對接可視化

圖9 木犀草素與CCND1分子對接可視化

3 討論

肝癌是全球第六大最常診斷的癌癥和第四大癌癥相關死亡原因，每年約有841000例新病例和782000例死亡[6]。在全球范圍內，超過一半的新診斷癌癥病例和死亡病例發生在中國[7]。在過去的十年中，肝癌的病因已被廣泛研究。肝炎病毒感染，包括乙型肝炎病毒（HBV）和丙型肝炎病毒（HCV），已被確定為肝癌的主要誘因[8]。因此，中國政府已采取措施抗擊肝炎流行。例如自2005年以來，為所有新生兒提供免費的HBV疫苗接種，并于2009年開始為8～15歲的兒童開展HBV疫苗接種“追趕”計劃[9]。這些努力顯著降低了普通人群中的HBV表面抗原（HBsAg）攜帶率。為防止HCV傳播，中國于1998年頒布了獻血法，實施了自愿獻血制度，進一步提高了獻血質量[10]。然而由于對現實世界感染庫的訪問有限，獲得對HBV和HCV流行率的準確估計具有挑戰性。根據之前基于中國國家網絡監測系統的研究，2004年至2019年報告的HBV發病率保持穩定，而HCV的發病率在此期間迅速上升。這反映出HBV和HCV仍然是中國主要的公共衛生問題。除了HBV和HCV，其他幾個因素，如飲酒、非酒精性脂肪肝?。∟AFLD）和非酒精性脂肪性肝炎（NASH）已被確定為肝癌的主要危險因素[11]。

已確定的原發性肝癌的主要危險因素：因素一，包括感染HBV或HCV、飲酒、飲食中的黃曲霉毒素、NAFLD、NASH和吸煙[12]；因素二，包括糖尿病、遺傳性代謝紊亂、血色病、遲發性皮膚卟啉病和任何病因的肝硬化[13]；因素三，例如蔬菜攝入量低、口服避孕藥的使用和輻射暴露[14]。研究表明，乙型肝炎引起的肝癌比例約為60%，明顯低于以往報道[15]。為抗擊乙肝病毒，中國政府啟動了一項全國性的免疫接種計劃，以應對乙肝病毒的流行。1999年，國家免疫擴大規劃審查報告稱，三劑乙肝疫苗的免疫覆蓋率為70.7%[16]。此外，針對所有新生兒和8～15歲兒童的“免費”和補種HBV疫苗接種計劃分別于2005年和2009年開始。所有這些努力都顯著降低了中國的HBsAg攜帶率。隨著HBV感染率的下降，我們發現乙型肝炎導致的肝癌發病率下降，尤其是在中年人中。然而，在年齡≥70歲的人群中，乙型肝炎導致的肝癌發病率沒有顯著降低，這可能是由于該人群的HBV感染控制不佳所致。從2004年到2014年，報告的HBV發病率增加最明顯的是老年人（年齡≥65歲），無論男女。該人群迫切需要一種更有效、更有針對性的預防策略來控制HBV感染。

丙肝病毒感染是中國新出現的公共衛生問題。1990年至2017年丙型肝炎引起的肝癌總體發病率有所下降[17]。但在男性和70歲以上的人群中發現顯著增加，這表明丙型肝炎引起的肝癌的預防應在不久的將來成為更高的優先事項。HCV通過誘導纖維化并最終導致肝硬化增加患肝癌的風險[18]。隨著肥胖和糖尿病增加HCV相關肝硬化的風險，丙型肝炎導致的肝癌發病率增加可能是由新的HCV感染以及肥胖和糖尿病的增加共同推動的[19]。目前全球尚無有效的HCV疫苗，這極大地阻礙了丙型肝炎引起的HCV感染和肝癌的預防。盡管由于實施無干擾素，HCV感染的治療取得了長足的進步?；谥苯幼饔每共《荆―AA）的聯合療法，HCV對DAA的耐藥性在無干擾素治療方案的失敗中發揮了重要作用[20]。此外那些有幸通過DAA治愈慢性丙型肝炎的人可能會無限期地面臨患肝癌的風險[21]。

飲酒和NASH是眾所周知的肝癌發展的危險因素。根據之前的一項全球調查，中國成年人人均酒精消費量與歐洲國家相比適中[22]。在這項研究中，由于飲酒導致的肝癌發病率在過去30年中略有下降。然而在男性和15～49歲的人群中，下降趨勢已經消失。自1970年代以來，在中歐幾個國家觀察到的飲酒量減少可能是該地區因飲酒發病率而導致肝癌減少的原因[23]。因此，旨在在人口層面減少酒精消費的政策有可能顯著改善人口的健康結果，尤其是年輕人。NASH是NAFLD的一種嚴重形式，可發展為晚期纖維化、肝硬化，并最終發展為肝細胞癌[24]。

除上述病因外，黃曲霉毒素B1、吸煙和NAFLD等因素也是肝癌導致的原因。黃曲霉毒素是主食的常見污染物，已被發現對包括人類在內的許多動物物種具有致癌性。黃曲霉毒素暴露集中在高風險地區，潮濕的天氣和不當的食物儲存條件使當地大多數人口接觸到黃曲霉毒素，顯著增加了肝癌的發病率[25]。識別和消除這一風險因素已大大降低了年輕人肝癌的發病率，這表明控制黃曲霉毒素作為預防措施的重要性。盡管自2003年《世界衛生組織煙草控制框架公約》簽署以來實施了煙草控制政策，但吸煙在中國仍然是一個嚴重的公共衛生問題。因此，需要采取行動防止與吸煙相關的慢性病進一步增加包括肝癌。這一結果可能歸因于醫療保健的可用性增加，這使得更多的患者能夠被識別出來。綜上可知，肝癌的致病原因很多，是是一個嚴重的公共衛生問題。

肝癌是指發生在肝細胞或肝內膽管細胞的惡性腫瘤，多有結節、腫塊等病理產物，屬于中醫“癌腫”“癥瘕”的范疇[26]。氣滯血瘀既是肝癌產生的病因，又是其病理產物。氣滯血瘀貫穿肝癌始終，氣滯則瘀血生，又可逆阻痰氣，致使痰瘀互結，聚于脅下，久則呈積。瘀血可因氣滯而成，又可加重氣滯，瘀血內阻，化熱傷陰，熱毒熏灼膽汁可致發黃；瘀血內阻，津液代謝失運，瘀血水濕互結可致鼓脹[27,28]。因此在治療肝癌的過程中，行氣活血的原則應貫穿始終。

利用TCMSP數據庫提取丹參、川芎的化合物組成、得到化合物的靶點關系，利用OMIM和GeneCards網站獲得肝癌的疾病靶點，R語言V4.0.3繪制Venn圖以獲得交集靶點，相關信息導入Cytoscape V3.8.2以獲得藥物-化合物-靶點-疾病網絡圖，依據交集靶點，通過STRING網站獲得蛋白互作網絡，R語言V4.0.3進行GO、KEGG富集分析。在TCMSP庫中共獲得丹參-川芎藥對有效化合物72個，其中丹參有效化合物65個，川芎有效化合物7個，丹參有效化合物的靶點數為64個，川芎有效化合物靶點數為17個，藥物與疾病共同靶蛋白44個；導入PPI發現連線較多的靶蛋白為ESR1、HSP90AA1、CCND1等，藥物-有效化合物-靶點-疾病網絡圖表明，度值較高的化合物是木犀草素、3β-羥基丹參酮IIA、脫氧新隱丹參酮、丹毒、楊梅酮等；GO生物學過程富集分析發現丹參-川芎藥對關鍵靶蛋白主要通過DNA 結合轉錄因子結合、泛素樣蛋白連接酶結合、DNA結合轉錄激活活性RNA聚合酶II特異性等方式起到防治肝癌的作用；KEGG富集通路發現丹參-川芎藥對影響肝癌癌前病變主要通過化學致癌-受體激活、脂質和動脈粥樣硬化、內分泌抵抗、乙型肝炎、PI3K-AKT 等信號通路；分子對接結果顯示木犀草素、3β-羥基丹參酮IIA、脫氧新隱丹參酮等有效化合物都能與ESR1、HSP90AA1、CCND1等核心靶蛋白良好的結合。丹參-川芎藥對改善肝癌癌前病變具有多靶點，多通路的特點，其治療機制可能與調控ESR1、HSP90AA1、CCND1等關鍵蛋白的活性有關。

丹參－川芎共同活性成分主要有木犀草素、3β-羥基丹參酮IIA、脫氧新隱丹參酮等。有研究表明木犀草素可通過激活p53凋亡信號通路，增加肝癌Hep G2細胞內p-JNK蛋白的表達，促進肝癌Hep G2細胞凋亡，抑制細胞增殖[29]。沉默促癌基因Yap1聯合丹參酮ⅡA能夠增加細胞凋亡相關標志物Bax表達，降低Bcl-2蛋白表達，促進肝癌細胞Huh-7凋亡[30]。隱丹參酮可通過降低HepG2細胞中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt和p-mTOR/mTOR的蛋白表達，從而誘導HepG2細胞發生自噬[31]。

通過構建丹參－川芎與肝癌交集靶基因PPI網絡，獲得PPI網絡核心靶基因，ESR1、HSP90AA1、CCND1、IL6等。ESR1激活的hsa_circ_0004018RNA通過與FUS結合并穩定TIMP2的蛋白表達來抑制HCC中的血管生成，從而達到抑制HCC的作用[32]。HSP90AA1可以通過激活VEGF/VEGFR2通路，引起肝癌的復發[33]。CCND1沉默通過抑制DNA修復蛋白RAD51來增強HCC細胞對5-Fu的敏感性，達到治療HCC的作用[34,35]。關于KEGG通路富集主要集中在PI3K-AKT信號通路，咪康唑通過血管細胞粘附分子和細胞因子信號傳導通路致癌，丙烯醛通過DNA修復抑制、PERK磷酸化等通路，通過調控人體代謝致癌，[36,37]二氧化硫通過調控MMP-9的表達達到致癌的作用，馬尼布通過PI3K/Akt信號、趨化因子信號、TGF-β等通路引發癌癥[38]。丹參、川芎二者合用，符合行氣活血的治則，達到防治氣滯血瘀型肝癌作用。

4 結論

丹參－川芎藥對在許多經方中，驗方被當成行氣活血之經典藥對應用，而且許多臨床試驗數據也說明兩藥配伍的較好效果，但是其內在機理、分子機制的研究卻較少，對于其中起關鍵作用的有效化合物的定位還不夠清楚，對關鍵靶蛋白的尋找還不夠精確，對關鍵通路的闡述還不夠清楚。所以本研究找出其作用于氣滯血瘀型肝癌的關鍵有效化合物，關鍵靶蛋白，主要的信號通路，希望可以為臨床提供一定的指導。本研究基于分子網絡技術、分子對接技術驗證了丹參－川芎藥對能較好的改善氣滯血瘀型肝癌癌前病變，期待丹參－川芎作為善行氣活血之常用配伍應用于肝癌治療?；诰W絡藥理學與分子對接分析得到的活性成分與靶基因存在相關性，兩者之間有許多代謝通路，有一個關鍵分子調控多個通路，也有多個分子同時調控一個通路，反映了中藥可以通過多通路、多靶點干預疾病的發生發展。中藥的活性成分與靶基因相互作用是通過網絡數據庫模擬獲得，仍需要后期進一步實驗驗證。

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Investigation on the Mechanism of Salvia Miltiorrhiza-Ligusticum Wallichi Couplet Medicines in Improving Precancerous Lesions of Liver Cancer Based on Network Pharmacology and Molecular Docking

Objective: To predict the mechanism of salvia miltiorrhiza-ligusticum wallichii couplet medicines in improving precancerous lesions of liver cancer of Qi stagnation and blood stasis type by using network pharmacology and molecular docking technology. Methods: TCMSP was used to extract the relationship between compound composition and target of salvia miltiorrhiza and ligusticum wallichi. OMIM and GeneCards websites were used to obtain liver cancer disease targets. According to the intersection targets, protein interaction network was obtained through STRING website. GO and KEGG enrichment analysis was performed in R language V4.0.3. Results: The key target proteins were ESR1, HSP90AA1, CCND1, etc., and the top compounds were Luteolin, 3β-hydroxytanshinone IIA, etc.; KEGG enrichment pathway found that the effect of salvia miltiorrhiza-ligusticum wallichii couplet medicines on liver precancerous lesions of liver cancer was mainly through hepatitis B, PI3K-AKT and other signal pathways; molecular docking results showed that luteolin and other effective compounds could well bind to ESR1, HSP90AA1, CCND1 and other core target proteins. Conclusion: Salvia miltiorrhiza-ligusticum wallichii couplet medicines have the characteristics of multi-target and multi-channel in improving precancerous lesions of liver cancer. Its therapeutic mechanism may be related to the regulation of the activities of key proteins such as ESR1, HSP90AA1 and CCND1.

salvia miltiorrhiza-ligusticum wallichii couplet medicines; precancerous lesions of liver cancer; network pharmacology and molecular docking

R96; R735

A

1008-1151(2022)07-0096-06

2022-04-28

雷雅婷（1997－），女，湖北民族大學醫學部學生，碩士，研究方向為中醫內科學。

吳廣陽（1994－），男，湖北民族大學醫學部學生，碩士，從事民族醫藥研究。