漢麻葉黃酮提取工藝及抗氧化活性研究

劉子瑄，孔馨逸，陳璐，江大海

(1.西京學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，西安 710123；2.陜西省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中心，西安 710016；3.陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，陜西 咸陽 712000)

漢麻屬中的火麻仁成熟的果實(shí)是著名的藥食同源的保健食品,主要分布于我國廣西西部、云南南部、新疆等地[1-2]。漢麻籽油是能夠溶解于水中的油料，在所有的植物中，其不飽和脂肪酸的含量較高，是目前發(fā)現(xiàn)的較為有效的抗衰老和抗輻射的油脂[3]；漢麻籽中含有豐富的蛋白質(zhì)和人體必需的氨基酸，可以用于食品和保健[4]。

漢麻主要用于紡織業(yè)、藥物和食物3個(gè)方面，漢麻的皮含有豐富的纖維，是制作衣服或者其他布料加工的材料，漢麻籽含有人體所需的各種氨基酸，常被加工成為漢麻相關(guān)的產(chǎn)品[5]。

漢麻葉中也含有豐富的黃酮類化合物，黃酮類成分具有抗炎、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、保護(hù)內(nèi)臟等多種生物功效，是食品和功能性調(diào)味品的重要生產(chǎn)材料[6-7]。從漢麻葉中提取黃酮成分不僅可以拓展黃酮的來源，同時(shí)也能提升漢麻產(chǎn)品的附加值，有利于漢麻產(chǎn)業(yè)鏈的資源綜合利用[8]。目前，黃酮類化合物提取工藝主要有溶劑提取法、微波輔助提取法、超聲波輔助提取法、酶解法、雙水相萃取法和超臨界流體萃取法[9-10]。本試驗(yàn)主要利用溶劑提取法對(duì)漢麻葉中的黃酮提取工藝進(jìn)行研究，同時(shí)對(duì)漢麻葉中黃酮的抗氧化活性進(jìn)行研究，旨在為漢麻葉中黃酮提取工藝獲取最適提取條件[11]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和試劑

漢麻葉、氫氧化鈉、無水乙醇、硫酸、葡萄糖、氯化鈉、水楊酸、碳酸鈉、鹽酸、維生素C和磷酸氫二鉀。

1.2 試驗(yàn)設(shè)備

恒溫水浴鍋、冷凍干燥機(jī)、電子天平、分析天平、紫外分光光度計(jì)、pH計(jì)和粉碎機(jī)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 黃酮得率的計(jì)算

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：稱取干燥的蘆丁10 mg，使用濃度為60%的乙醇定容至50 mL。取0，1，2，3，4，5 mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液于10 mL的比色管中，依次加入5%的亞硝酸鈉0.3 mL，混勻，放置5 min，之后加入濃度為10%的硝酸鋁，混勻，靜置10 min，以不含蘆丁的比色管的溶液為參數(shù)，在吸光度為510 nm的條件下測定吸光度[12-13]，計(jì)算并得到吸光度的回歸方程：Y(吸光度)=10.345X+0.0156(R2=0.9906；X為蘆丁濃度)。

漢麻葉中黃酮得率(%)=[(Y+0.0124)×V×10]/[10.235×M×1000]×100%。

式中：Y為樣品的吸光值，V為反應(yīng)的體積，M為漢麻葉粉末的質(zhì)量。

1.3.2 漢麻葉黃酮提取單因素試驗(yàn)

樣品的預(yù)處理：將藥物經(jīng)粉碎機(jī)粉碎過80目篩，獲得漢麻葉粉末，稱取漢麻葉粉末100 g，加入200 mL 95%的乙醇進(jìn)行脫脂，在70 ℃的水浴中攪拌2 h，4000 r/min離心15 min后進(jìn)行脫脂，過濾并烘干備用。

將精密處理后的漢麻葉粉1 g，乙醇濃度60%、提取時(shí)間80 min、提取溫度60 ℃、漢麻葉與溶劑的比例1∶30 (g/mL)作為單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)條件。當(dāng)某一個(gè)因素改變時(shí)，其他因素保持不變。在乙醇濃度分別為40%、50%、60%、70%、80%和90%；提取時(shí)間分別為20，40，60，80，100，120，140 min；提取溫度分別為30，40，50，60，70，80，90 ℃；料液比分別為1∶20、1∶25、1∶30、1∶5、1∶40；提取次數(shù)分別為1，2，3，4，5的條件下，按照上述方法進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

1.3.3 響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)，以提取時(shí)間、料液比、提取次數(shù)和提取溫度作為變量因素，以漢麻葉黃酮的得率作為目標(biāo)，采用四因素三水平的響應(yīng)面分析，優(yōu)化漢麻葉黃酮的提取工藝，獲得最佳提取工藝參數(shù)。

響應(yīng)面因素和水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素和水平設(shè)計(jì)Table 1 Design of response surface test factors and levels

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃酮提取得率的影響

由圖1可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，漢麻葉中的黃酮得率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到60%時(shí)，漢麻葉中的黃酮得率達(dá)到最高，為2.0%。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)小于60%時(shí)，漢麻葉中的黃酮得率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高而升高；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)大于60%時(shí)，漢麻葉中的黃酮得率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高而降低。乙醇的極性低于水的極性，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)低于60%時(shí)，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的不斷升高，提取液的極性開始與黃酮的極性相接近，所以，黃酮的提取率越來越高；當(dāng)乙醇的體積分?jǐn)?shù)高于60%時(shí)，提取液的極性與黃酮的極性相差越來越大，導(dǎo)致溶液中黃酮提取率開始降低。所以，確定乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%作為最佳的提取條件。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃酮提取得率的影響Fig.1 The effect of ethanol volume fraction on the extraction yield of flavonoids

2.2 提取時(shí)間對(duì)黃酮提取得率的影響

由圖2可知，隨著提取時(shí)間的增長，漢麻葉中黃酮提取得率先升高后降低，在80 min時(shí)黃酮的得率達(dá)到最高，為2.0%。當(dāng)提取時(shí)間小于80 min時(shí)，漢麻葉中黃酮的得率隨著提取時(shí)間的延長而升高；提取時(shí)間大于80 min時(shí)，漢麻葉中黃酮的得率隨著時(shí)間的延長而降低。這是由于當(dāng)時(shí)間小于80 min時(shí)，漢麻葉中的黃酮濃度很低，所以隨著時(shí)間的延長，提取液中黃酮的得率隨著時(shí)間的增長而升高，當(dāng)提取時(shí)間超過80 min時(shí)，提取液中的黃酮濃度已經(jīng)達(dá)到飽和，隨著提取時(shí)間的增長，漢麻葉中的其他物質(zhì)溶入提取液中，導(dǎo)致黃酮提取量降低。所以，本試驗(yàn)選取提取時(shí)間80 min作為最佳的提取條件。

圖2 提取時(shí)間對(duì)黃酮提取得率的影響Fig.2 The effect of extraction time on the extraction yield of flavonoids

2.3 提取溫度對(duì)黃酮提取得率的影響

由圖3可知，當(dāng)提取溫度為30～60 ℃時(shí)，漢麻葉中黃酮的得率隨著提取溫度的升高而升高，當(dāng)提取溫度達(dá)到60 ℃時(shí)，黃酮的得率最高，為2.0%。當(dāng)溫度超過60 ℃時(shí)，漢麻葉中黃酮的得率隨著提取溫度的升高而降低。隨著漢麻葉黃酮提取溫度的升高，漢麻葉中黃酮的溶解度、擴(kuò)散度和傳質(zhì)速度都有所增加。當(dāng)溫度超過60 ℃時(shí)，黃酮中含有大量的羥基，極易被氧化，從而導(dǎo)致漢麻葉中黃酮提取量降低。因此，該試驗(yàn)選擇60 ℃作為最佳提取溫度。

圖3 提取溫度對(duì)黃酮提取得率的影響Fig.3 The effect of extraction temperature on the extraction yield of flavonoids

2.4 料液比對(duì)黃酮提取得率的影響

由圖4可知，隨著料液比的增加，漢麻葉中黃酮得率先升高后降低。當(dāng)料液比為1∶30時(shí)，黃酮得率最高，為2.0%。當(dāng)料液比小于1∶30時(shí)，黃酮得率隨著料液比的增加而升高；當(dāng)料液比大于1∶30時(shí)，漢麻葉中的黃酮得率隨著料液比的增加而降低。這是由于當(dāng)料液比小于1∶30時(shí)，料液比逐漸增大，動(dòng)態(tài)反應(yīng)逐漸向產(chǎn)生黃酮的方向移動(dòng)，造成黃酮的量逐漸增多，隨著料液比的增大，漢麻葉中的其他物質(zhì)也逐漸溶解出來，從而影響漢麻葉中黃酮的獲得。所以，本研究選取料液比1∶30作為最佳的料液比。

圖4 料液比對(duì)黃酮提取得率的影響Fig.4 The effect of solid-liquid ratio on the extraction yield of flavonoids

2.5 提取次數(shù)對(duì)黃酮提取得率的影響

由圖5可知，隨著提取次數(shù)的增加，漢麻葉中黃酮得率也隨之增加。但是經(jīng)過2次提取之后，繼續(xù)增加黃酮的提取次數(shù)，黃酮的得率增加卻不明顯，故選擇提取2次作為最佳的提取次數(shù)，這樣不僅能夠保證黃酮相對(duì)較高的得率，同時(shí)也能避免重復(fù)試驗(yàn)造成人力、物力資源的浪費(fèi)。

圖5 提取次數(shù)對(duì)黃酮提取得率的影響Fig.5 The effect of extraction times on the extraction yield of flavonoids

2.6 響應(yīng)面法優(yōu)化漢麻葉黃酮提取工藝

2.6.1 響應(yīng)面法分析的方案和結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過BBD原理的設(shè)計(jì)，該試驗(yàn)以A提取時(shí)間、B料液比、C提取次數(shù)、D提取溫度為影響因素，將漢麻葉的黃酮得率作為響應(yīng)值，進(jìn)行三水平試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Response surface test design and results

2.6.2 響應(yīng)模型的建立及顯著性檢驗(yàn)

使用軟件Design-Expert 8.0對(duì)表3中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元線性分析和二項(xiàng)式的擬合分析，得到漢麻葉黃酮得率對(duì)自變量二項(xiàng)式中的回歸方程：Y=2.88+0.32A+0.22B+0.32C+0.24D+0.054AB-0.12AC+0.086AD-0.16BC+0.054BD+0.21CD-0.12A2-0.16B2-0.22C2-0.14D2。

由表3可知，一次項(xiàng)結(jié)果A、B、C和D與二次項(xiàng)結(jié)果A2、B2、C2和D2對(duì)漢麻中黃酮提取的影響極顯著(P<0.01)，交叉項(xiàng)AC和BC對(duì)漢麻葉中的黃酮影響顯著(P<0.05)，由方差分析結(jié)果可知，二次回歸方程的模型小于0.01，失擬項(xiàng)不顯著(P=0.3802)，模型相關(guān)系數(shù)R2=0.9828，這些數(shù)據(jù)表明回歸方程擬合性好，數(shù)學(xué)模型穩(wěn)定，試驗(yàn)結(jié)果能夠被很好地描述。

表3 響應(yīng)面二次方程的方差及分析結(jié)果Table 3 The variance and analysis results of the quadratic equation of response surface

通過分析，響應(yīng)面優(yōu)化工藝的最佳提取工藝為料液比1∶28，提取時(shí)間95 min、提取溫度62 ℃、提取次數(shù)2次。

2.7 漢麻葉黃酮抗氧化活性研究

由圖6可知，漢麻葉黃酮對(duì)羥基自由基的清除率較強(qiáng)，且隨著漢麻葉黃酮濃度的增加，其羥基自由基的清除能力也逐漸增強(qiáng)。當(dāng)濃度達(dá)到1 mg/mL時(shí)，漢麻葉黃酮對(duì)羥基自由基的清除率最高，為89%。

圖6 黃酮和Vc對(duì)羥基自由基的清除率Fig.6 The scavenging rates of flavonoids and Vc on hydroxyl radicals

3 結(jié)論

隨著社會(huì)的發(fā)展，漢麻相關(guān)的產(chǎn)品逐漸受到全世界人民的重視，漢麻不僅可以作為工業(yè)原料開發(fā)工業(yè)纖維，而且可以用于提取漢麻葉黃酮，應(yīng)用于臨床治療癌癥、神經(jīng)類疾病，最大限度完善漢麻產(chǎn)業(yè)鏈。

本試驗(yàn)通過中心組合設(shè)計(jì)響應(yīng)面法，以料液比、提取時(shí)間、提取溫度和提取次數(shù)為影響因素，以提取黃酮的總量為響應(yīng)值，得到漢麻葉提取的最佳工藝：料液比為1∶28，提取時(shí)間為95 min，提取溫度為62 ℃和提取次數(shù)為2次。在此條件下，研究漢麻葉黃酮與維生素C的抗氧化活性，研究結(jié)果表明，漢麻葉黃酮具有明顯的抗氧化活性。