一測多評法測定姜汁紅糖中的6種姜辣素類成分含量

陳其釗，陳紅香*，陳嘉敏，王桂華，李家威，余構彬

(1.廣東省科學院生物工程研究所，廣州 510316；2.國家糖業質量監督檢驗中心，廣州 510316)

姜汁紅糖是以紅糖為原料，添加姜汁、姜粉加工而成的食糖[1]。中醫營養學認為，性溫的紅糖通過“溫而補之，溫而通之，溫而散之”[2-3]來發揮補血作用，生姜則具有解表散寒、溫中止嘔、溫肺止咳、解毒的功效，常用于風寒感冒、脾胃寒癥、胃寒嘔吐、肺寒咳嗽、解魚蟹毒[4]。民間素有“男子不可百日無姜，女子不可百日無糖”[5-6]之說。用生姜、紅糖熬制的姜湯可活血驅寒，防治感冒，自古就是風寒感冒時的食療良藥。

目前市面上有關姜汁紅糖的產品非常多，但是并沒有相關產品的國家標準。輕工業標準QB/T 5006-2016雖然規定了姜汁紅糖的各項指標，但并不具有強制性，市面上幾乎所有的產品都是執行GB/T 29602-2013[7]《固體飲料》或者自己的企標。以至于我們在前期調查中發現，各家產品在生姜的添加量上參差不齊。

姜汁紅糖中的主要成分為蔗糖和姜辣素。常見的姜辣素成分有6種，目前2020版《中國藥典》只規定6-姜辣素、8-姜酚、10-姜酚作為生姜質量評價的指標成分，并不夠全面。GB/T 22293—2008[8]中利用校正因子法測定了6種成分，但是其中的峰定位十分模糊，分離不理想，干擾大，耐用性等也不明確。

然而目前尚未見將姜醇和姜酚主要活性成分共同作為姜汁紅糖質量評價指標的文獻報道。故本研究建立一測多評法同時分析了不同產品的姜醇和姜酚含量，擬將生姜主要特征性活性成分6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、6-姜烯酚、8-姜烯酚和10-姜烯酚共同作為其質量控制指標成分，更加全面地評價姜汁紅糖的質量，便于企業、機構執行利用。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與設備

Aglient 1260、1260II高效液相色譜儀 美國安捷倫公司；LC-20AT高效液相色譜儀 日本島津公司；VORTEX 3渦旋混合器 艾卡(廣州)儀器設備有限公司；CL5R醫用離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；pH計 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；Milli-Q超純水系統 默克密理博公司；色譜柱 Ecosil C18-Eco100A C18柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm) 廣州綠百草生物科技有限公司；Mycotox C18柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm) Pickering公司；ZORBAX Eclipse Plus C18柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm) 安捷倫公司；中譜紅RD-C18柱(4.6 mm×150 mm, 5 μm) 中譜科技公司。

1.2 試劑

甲醇、乙腈(色譜純)：西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司；冰乙酸、甲酸、磷酸(分析純)：廣州化學試劑有限公司。

標準物質：6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、6-姜烯酚、8-姜烯酚和10-姜烯酚(純度≥98%)：成都普菲德生物技術有限公司；合成辣椒素(純度99.5%)：上海安譜實驗科技股份有限公司。

9批次姜汁紅糖樣品均購于大型超市,見表1。在分析之前，所有食糖樣品都儲存在塑料罐中陰涼避光保存。

表1 姜汁紅糖樣品來源Table 1 The source of brown sugar ginger juice samples

2 實驗方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Ecosil C18-Eco100A C18柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)；檢測波長：280 nm；柱溫：35 ℃；流速：1.0 mL/min；進樣量：20 μL；流動相：(A)1%冰乙酸、(B)乙腈，梯度洗脫：0～15.0 min，52.0% A；15.0～17.0 min，52.0% A→40.0% A；17.0～43.0 min，40.0% A→20.0% A；43.0～43.01 min，20.0% A→52.0% A；43.01～50.0 min，52.0% A。

2.2 供試品溶液的制備

準確稱量1.00 g姜糖用適量甲醇溶解，渦旋1 min后超聲30 min，用甲醇定容到10 mL。搖勻，以0.22 μm微孔濾膜過濾，得到供試品溶液。

2.3 標準溶液的制備

標準儲備液：分別精密稱取6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、6-姜烯酚、8-姜烯酚、10-姜烯酚及合成辣椒素標準品各10 mg，用甲醇溶解后分別定容至100 mL，即得各標準品濃度為100 μg/mL的標準儲備液，于-20 ℃冰箱中保存。

標準工作溶液：從各標準儲備液中分別取適量混合，渦旋混勻，用甲醇稀釋成濃度為2～50 mg/L的混合標準品溶液，以作線性范圍考察及含量測定使用。

2.4 陰性對照溶液

使用不含生姜的紅糖作為陰性對照樣品，再按照2.2的方法制成對應的陰性對照溶液。

2.5 色譜條件優化

2.5.1 提取方法選擇

6種姜辣素成分可溶于無水乙醇和甲醇，同時避免樣品中蔗糖含量太高的干擾。但是無水乙醇的截止波長較高，作為溶劑時，基線漂移較大，而甲醇作為提取溶劑基線相對平滑。由于姜辣素是熱不穩定的酚類化合物，在較高溫度下容易受到破壞而損失，若考慮姜辣素的品質和提取率，則超聲波輔助法為最佳提取方法[9-10]。姜汁紅糖中除了蔗糖、姜辣素外，還有色素[11-12]、甾醇[13-14]、黃酮多酚類[15-17]、有機酸[18]等。本研究中考慮到回收率并未選擇凈化方法，因此需要較長的梯度洗脫來實現分離、排除干擾。

2.5.2 流動相選擇

以2020版《中國藥典》以及國家標準(見表2)為參考，本實驗分別嘗試了1%乙酸-乙腈、0.1%磷酸-乙腈、0.1%甲酸-乙腈、0.1%磷酸-甲醇+乙腈(1+1)、甲醇-水、乙腈-水作為流動相，發現在乙腈+酸水條件下，能實現7種成分的分離。在甲醇-水和乙腈-水作為流動相時，7種成分會出現峰形拖尾或重疊的情況。而在甲醇-酸水系統下，完全出峰時間則超過60 min，顯得過長。所以，選擇1%乙酸-乙腈作為流動相。

表2 藥典及標準中姜辣素的研究情況Table 2 Study on gingerols in pharmacopoeia and standard

2.5.3 檢測波長選擇

在190～400 nm波長下分別對7種成分標準溶液進行紫外掃描，發現在230 nm和280 nm處均有較強吸收，但是經過測試，在230 nm處各成分響應一般，280 nm處響應高，雜質也相對較少。所以，選擇280 nm作為檢測波長。

2.6 方法學考察

2.6.1 專屬性考察

混合標準品溶液與姜汁紅糖提取液的色譜圖見圖2。通過比對，鑒別出姜汁紅糖中6種姜辣素成分，峰位見圖2標注，各定量峰分離良好，無明顯干擾。

2.6.2 線性與范圍

精密吸取混合對照品儲備液一定體積，按倍數關系稀釋成不同質量濃度的標準溶液進行測定，采用優化后的前處理方法以及色譜條件，以7種成分色譜峰的峰面積平均值(Y)為縱坐標，對應的標準溶液濃度(X)為橫坐標，繪制標準曲線；以信噪比S/N=3確定儀器檢出限(LOD)，結果見表3。

表3 7種成分的標準曲線、線性范圍及檢出限Table 3 Standard curves, linear ranges and detection limitsof 7 components

7種成分在各自濃度范圍內線性關系良好，相關系數均大于0.999；6-姜酚檢出限為5.56 mg/kg，8-姜酚為8.77 mg/kg，10-姜酚為7.81 mg/kg，6-姜烯酚為7.11 mg/kg，8-姜烯酚為9.43 mg/kg，10-姜烯酚為8.57 mg/kg，合成辣椒素為8.33 mg/kg。該方法靈敏度較高，可滿足糖品中姜辣素檢測的需要。

2.6.3 儀器精密度實驗

取混合對照品溶液按照2.1的方法，在色譜條件下連續進樣8次，結果見表4。6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、6-姜烯酚、8-姜烯酚、10-姜烯酚、合成辣椒素峰面積的RSD分別為1.40%、0.71%、0.92%、2.30%、1.80%、0.71%、0.72%，表明儀器的精密度良好。

表4 儀器精密度試驗結果Table 4 Precision test results of instruments

2.6.4 穩定性試驗

按照2.2的樣品處理方法制備空白加標(5 mg/L)1份，冷藏條件(2～4 ℃)下放置，分別于0，1，3，6，9，12，24 h取出，按照2.1的方法考察其穩定性。結果表明，在冷藏條件下放置24 h更穩定，見表5。

表5 24 h穩定性試驗結果(2～4 ℃下避光放置)Table 5 24 h stability test results (place away from light at 2～4 ℃)

2.6.5 回收率試驗

精確稱取紅糖樣品1.00 g，分別加入3個水平的對照品，在最佳提取條件及色譜條件下，每一濃度平行3次測定紅糖中姜辣素的回收率，結果見表6。紅糖中6-姜酚的平均回收率為95.8%～104.4%，8-姜酚的平均回收率為89.8%～103.0%，6-姜烯酚的平均回收率為88.2%～102.2%，10-姜酚的平均回收率為94.6%～105.3%，8-姜烯酚的平均回收率為130.0%～134.3%，10-姜烯酚的平均回收率為80.9%～90.8%。

表6 回收率試驗結果(0 ℃下避光放置)Table 6 Recovery rate test results (place away from light at 0 ℃)

2.7 校正因子的計算

精密吸取2.3項下制備的系列標準溶液適量，依法進樣測定各成分的峰面積，以合成辣椒素為參照物，計算其他6種成分的相對校正因子k/s，公式為k/s=k/s=(CkAs)/(CsAk)，其中Ck為其他成分含量，Ak為其他成分峰面積，Cs為參照物含量，As為參照物峰面積，結果見表7。

表 7 姜汁紅糖中7種成分相對校正因子Table 7 Relative correction factors of 7 components in brown sugar ginger juice

2.8 不同儀器、不同色譜柱對校正因子的影響

對比考察3臺高效液相色譜儀及4種色譜柱對6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、6-姜烯酚、8-姜烯酚、10-姜烯酚校正因子的影響，結果顯示6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、6-姜烯酚、8-姜烯酚、10-姜烯酚校正因子的RSD分別為1.64%、3.53%、3.83%、3.89%、6.05%、4.51%，表明不同儀器、不同色譜柱對校正因子影響較小，結果見表8。

表8 不同儀器、 不同色譜柱對校正因子的影響Table 8 Effect of different instruments and chromatographic columns on correction factors

2.9 不同流速的耐用性驗證

取混合對照品溶液進樣，按照2.1的方法，分別考察流速為0.7，1.0，1.5 mL/min下，以合成辣椒素作為參照成分時其他6種成分的相對校正因子，考察流速波動對相對校正因子的影響。結果表明各相對校正因子RSD在0.66%～4.58%，說明相對校正因子在流速波動變化0.7～1.5 mL/min范圍內耐用性良好，結果見表9。

表9 不同流速對相對校正因子的影響Table 9 Effect of different flow rates on relative correction factors

2.10 不同柱溫的耐用性驗證

取混合對照品溶液進樣，按照2.1的方法，分別考察柱溫為30，35，40 ℃下，以合成辣椒素作為參照成分時其他6種成分的相對校正因子，考察柱溫對相對校正因子的影響。結果表明各相對校正因子RSD在0.09%～8.85%，說明相對校正因子在柱溫波動變化5 ℃范圍內耐用性良好，結果見表10。

表10 不同柱溫對相對校正因子的影響Table 10 Effect of different column temperatures on relative correction factors

2.11 不同pH值的耐用性驗證

取混合對照品溶液進樣，按照2.1的方法，分別考察流動相pH值分別為1.5，2.6，3.5，以合成辣椒素作為參照成分時其他6種成分的相對校正因子，考察流動相pH值對相對校正因子的影響。結果表明各相對校正因子RSD在0.25%～5.13%，說明相對校正因子在不同pH值溶液中適應性良好，結果見表11。

表11 流動相pH值對相對校正因子的影響Table 11 Effect of mobile phase pH values on relative correction factors

2.12 待測成分色譜峰的定位

本文以合成辣椒素為內標色譜峰，考察3臺高效液相色譜儀及4種色譜柱條件下，待測成分6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、6-姜烯酚、8-姜烯酚、10-姜烯酚色譜峰的相對保留時間值， 結果顯示6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、6-姜烯酚、8-姜烯酚、10-姜烯酚相對保留時間值的RSD分別為0.97%、3.46%、4.30%、2.25%、4.83%和3.78%，表明不同儀器、不同色譜柱對相對保留時間值無顯著影響，結果見表12。

表12 不同儀器、不同色譜柱對相對保留時間值的影響Table 12 Effect of different instruments and chromatographic columns on relative retention time value

續 表

2.13 QAMS法與外標法測定結果的比較

取表1中的姜汁紅糖樣品，按照2.2的方法，每個樣品平行制備3份供試品溶液，分別采用一測多評法和外標法測定姜汁紅糖中6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、6-姜烯酚、8-姜烯酚和10-姜烯酚的含量，結果見表13。采用SPSS 25軟件，對外標法與QAMS法測得的結果進行配對t檢驗，結果顯示P>0.05，表明兩種方法測定值之間無顯著差異。

表13 含量測定結果(n=3，g/100 g)Table 13 Results of content determination (n=3,g/100 g)

3 結論

本研究以合成辣椒素為參照物，建立了姜汁紅糖中6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、6-姜烯酚、8-姜烯酚和10-姜烯酚的QAMS定量方法。該方法精密度、穩定性、重復性及耐用性較好，均符合分析要求。采用該方法檢測了9批姜汁紅糖中6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、6-姜烯酚、8-姜烯酚和10-姜烯酚的含量，t檢驗分析結果顯示：該方法與外標法得到的含量值基本一致，說明以合成辣椒素為參照物的QAMS法可準確對6種姜辣素成分進行定量測定。本研究結果可為姜汁紅糖的質量控制與質量評價提供新思路和參考。