光動力療法對人小細胞肺癌H446細胞殺傷效應

廖潔梅,肖寶紅,郭彩宏,鞏秀珍,程兆忠,林存智

(青島大學,山東 青島 266003 1 附屬醫院呼吸與危重癥醫學科； 2 醫學院松山醫院綜合內科)

肺癌是全球發病率及死亡率均居首位的惡性腫瘤，是癌癥病人死亡的主要原因[1]。肺癌按照其病理類型可以分為小細胞肺癌(SCLC)和非小細胞肺癌(NSCLC)兩大類，其中SCLC約占所有肺癌的15%[2]。SCLC惡性程度高、侵襲性強，早期即可出現血行轉移，未進行任何積極治療的病人，其5年生存率低于5%，平均總生存期僅為2～4個月[3-4]。多數SCLC病人在確診時已是晚期，失去了手術治療的最佳時機，放化療成為主要治療手段。盡管SCLC對放化療敏感，但經過一段時間的治療后部分病人會出現耐藥及腫瘤的擴散，伴隨著不可避免的嚴重副作用[5]。血卟啉衍生物(HPD)介導的光動力療法(PDT)是一種溫和、相對安全的局部治療方法，因具有可選擇性殺傷腫瘤細胞、創傷小等特點，PDT在癌癥精準治療方面展現了獨特的治療優勢，是目前惡性腫瘤輔助治療的新方法。研究表明，PDT對皮膚腫瘤、頭頸部腫瘤、基底細胞癌、乳癌、前列腺癌、結腸癌、膀胱癌等均有治療作用[6-9]。但目前關于PDT對SCLC作用的研究甚少，其效果及機制需要進一步的研究，且SCLC的總體生存率低，探索新的治療方法顯得尤為重要。本實驗旨在探討不同光敏劑濃度及不同功率密度的630 nm激光照射對人SCLC H446細胞的體外殺傷效應及其作用機制，以期為肺癌的臨床治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1細胞株與主要試劑 人SCLC H446細胞，購自武漢普諾賽生命科技有限公司。HPD購自重慶華鼎現代生物制藥公司，細胞培養液DMEM購自美國Hyclone公司，胎牛血清購自以色列Biolo-gical Industries公司，CCK8試劑盒購自美國MedChemExpress公司，逆轉錄試劑盒、SYBR Green熒光定量試劑盒均購自日本TaKaRa公司，Hoechst 33258染色液購自北京索萊寶科技有限公司，AnnexinV-FITC和PI凋亡檢測試劑盒購自上海愛必信生物有限公司。

1.1.2儀器 實驗所用的LED-IB光動力治療儀，由武漢亞格光電技術有限公司生產，輸出波長為紅光(633±10)nm、藍光(417±10)nm、黃光(590±10)nm，輸出功率密度為紅光20～100 mW/cm2、藍光25～120 mW/cm2、黃光10～40 mW/cm2，工作方式為連續或脈沖。

1.2 實驗方法

1.2.1細胞培養 H446細胞常規用含100 kU/L青霉素和0.1 g/L鏈霉素混合液、體積分數0.10滅活胎牛血清的DMEM培養液，在37 ℃、含體積分數0.05 CO2、飽和濕度培養箱中培養，每天更換1次培養液，待細胞密度增長至70%～80%時，常規傳代培養，取對數生長期的細胞用于實驗。

1.2.2CCK8法檢測細胞活力 將H446細胞接種于5塊96孔板中，每組設置3個復孔，培養至貼壁后進行實驗。分別加入HPD濃度為0、5、10、12、15、20 mg/L的培養液避光培養4 h后更換含體積分數0.10胎牛血清的培養液，分別給予0、25、50、75、100 mW/cm2功率密度的630 nm激光垂直照射2 min，垂直距離9 cm，光斑直徑9 cm。培養24 h后棄培養液，加入100 μL含體積分數0.10 CCK8的培養液繼續培養。用自動酶標儀于450 nm波長處檢測各組細胞吸光度(A)值，計算細胞活力：細胞活力=(A實驗組-A空白組)/(A對照組-A空白組)×100%。實驗重復3次。

1.2.3流式細胞術檢測細胞凋亡 選取CCK8實驗中篩選出來的最佳HPD-PDT參數進行后續實驗。實驗設空白對照組(無光敏劑，無激光照射)、單純光敏劑組(光敏劑濃度為15 mg/L，無激光照射)、單純光照組(無光敏劑，激光功率密度為50 mW/cm2)和HPD-PDT組(光敏劑濃度為15 mg/L，激光功率密度為50 mW/cm2)。經上述處理24 h后收集細胞，調整至密度為109/L，離心后以PBS洗2次，加入500 μL Binding buffer重懸細胞，按要求依次加入AnnexinV-FITC和PI染色劑各5 μL，室溫避光孵育5～15 min，應用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。實驗重復3次。

1.2.4Hoechst 33258染色檢測細胞凋亡 取潔凈細胞爬片，用體積分數0.75乙醇浸泡10 min、PBS洗3次、培養液洗1次后置于12孔板內，接種H446細胞后培養過夜。細胞貼壁后隨機分為空白對照組(無光敏劑，無激光照射)、單純光敏劑組(光敏劑濃度為15 mg/L，無激光照射)、單純光照組(無光敏劑，激光功率密度為50 mW/cm2)和HPD-PDT組(光敏劑濃度為0、5、10、12、15、20 mg/L，激光功率密度為50 mW/cm2)。進行相應處理避光培養24 h后棄培養液，每孔加入0.5 mL固定液，15 min后棄固定液并用PBS洗3次，每孔加入0.5 mL Hoechst 33258染色液染色5 min，棄染色液，以PBS洗3次，將一滴抗熒光猝滅劑滴在載玻片上，蓋上染色好的細胞爬片，室溫避光孵育15 min后于倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5實時熒光定量PCR(RT-PCR)檢測Bax、Bcl-2、Caspase-9mRNA的表達水平 分組及處理方法同1.2.4。處理24 h后每孔加入TRIzol 1 mL，靜置5 min 后轉移到1.5 mL EP管中，加入三氯甲烷0.2 mL，振蕩混勻后離心；吸取上清至新的EP管中，加入與其等量的異丙醇；離心后棄上清，加入無水乙醇0.5 mL；離心后棄乙醇，檢測所提取的RNA濃度。按照TaKaRa反轉錄試劑盒說明書操作獲得cDNA，根據SYBR Green熒光定量試劑盒說明以此cDNA為模板進行目的片段擴增，計算各組基因相對表達量。

1.3 統計學方法

2 結 果

2.1 HPD-PDT對H446細胞活力的影響

不同HPD濃度和光照強度下各組細胞存活率比較，光敏劑濃度(F=1 269.533,P<0.001)和激光功率密度(F=1 229.600,P<0.001)主效應均有統計學意義，且二者存在交互效應(F=78.430，P<0.001)。單獨給予光敏劑或者激光照射對H446細胞無明顯殺傷作用；HPD-PDT對H446細胞殺傷效應隨著光敏劑濃度的增加和激光功率密度的增大而增大，當激光功率密度為50、75、100 mW/cm2以及光敏劑濃度為15、20 mg/L時，細胞存活率明顯下降，差異具有統計學意義(F=663.385～807.743,P<0.001)。當激光功率密度為50 mW/cm2、HPD濃度為15 mg/L時，HPD-PDT對細胞的殺傷效應明顯，再增加激光功率密度或者光敏劑濃度細胞存活率無顯著變化(t=0.480～1.946，P>0.05)。因此，選取激光功率密度為50 mW/cm2和HPD濃度為15 mg/L進行后續實驗。見圖1。

2.2 HPD-PDT對H446細胞凋亡的影響

流式細胞術檢測顯示，空白對照組、單純光敏劑組、單純光照組和HPD-PDT組的細胞凋亡率分別為(8.60±1.22)%、(11.99±0.21)%、(10.17±0.58)%和(59.67±2.36)%，4組整體比較差異具有統計學意義(F=2 073.518，P<0.001)，HPD-PDT組與空白對照組、單純光敏劑組和單純光照組相比細胞凋亡率明顯增加，差異均具有統計學意義(t=62.612～65.612，P<0.001)。Hoechst 33258染色顯示，空白對照組、單純光敏劑組和單純光照組無明顯細胞凋亡，HPD-PDT組可見凋亡細胞染色質固縮，細胞核致密濃染，隨著光敏劑濃度的增加，凋亡細胞增多且細胞密度降低。見圖2、3。

2.3 HPD-PDT對H446細胞Caspase-9、Bax及Bcl-2 mRNA表達的影響

RT-PCR檢測結果顯示，與各對照組相比較，HPD-PDT組H446細胞的Bax、Caspase-9mRNA的表達水平明顯上調(F=445.426、1 765.177，P<0.05)，而Bcl-2mRNA表達水平則明顯下調(F=171.193，P<0.05)。見圖4。

圖1 不同濃度HPD結合不同功率密度激光照射對H446細胞活力的影響

3 討 論

PDT是近年來腫瘤治療領域的一種新型微創技術，該技術利用腫瘤組織對光敏劑選擇性攝入和濃集的特性，給予特定波長激光照射，激發腫瘤組織中的光敏劑產生活性氧，從而導致腫瘤細胞發生凋亡、壞死及自噬等一系列過程，最終達到治療的目的[6,10]。光敏劑在正常組織中能迅速代謝，因此在殺死腫瘤細胞的同時對正常細胞的損傷較小，不會產生嚴重副作用，PDT因為靶向性強、微創、可重復進行多次治療等優點逐漸成為癌癥治療的新手段。其抗腫瘤機制主要有如下幾點。①光敏劑吸收特定波長的光后發生Ⅰ型和Ⅱ型光化學反應，Ⅰ型光化學反應即三重態光敏劑與底物分子間直接發生電子轉移或抽氫作用，產生自由基離子，并進一步與周圍的氧反應生成活性氧；Ⅱ型光化學反應即三重態光敏劑轉移能量至基態氧，產生單態性氧。這些物質與腫瘤細胞中的分子發生氧化反應，最終導致細胞凋亡或壞死[11]。②PDT通過改變新生血管內皮細胞的功能結構，導致新生血管血供減少，從而使之缺血、低氧而變性壞死，抗新生血管生成。③增強腫瘤免疫原性，激發機體免疫反應[10]。本研究結果顯示，HPD-PDT處理后人SCLC H446細胞的存活率明顯降低，其殺傷效應與HPD濃度和激光照射劑量密切相關，在一定范圍內，隨著光敏劑濃度和激光功率密度的增加而增大。

A：空白對照組；B：單純光敏劑組；C：單純光照組；D：HPD-PDT 組。

A：空白對照組；B：單純光敏劑組；C：單純光照組；D：HPD-PDT組(HPD為5 mg/L)；E：HPD-PDT組(HPD為10 mg/L)；F：HPD-PDT組(HPD為12 mg/L)；G：HPD-PDT組(HPD為15 mg/L)；H：HPD-PDT組(HPD為20 mg/L)。200倍。

A：空白對照組；B：單純光敏劑組；C：單純光照組；D：HPD-PDT組(HPD為5 mg/L)；E：HPD-PDT組(HPD為10 mg/L)；F：HPD-PDT組(HPD為12 mg/L)；G：HPD-PDT組(HPD為15 mg/L)；H：HPD-PDT組(HPD為20 mg/L)。

Bcl-2家族蛋白是細胞凋亡途徑的關鍵調控因子，可分為凋亡促進因子和凋亡抑制因子，兩者的比值決定細胞是否能接受凋亡信號[12]。Bcl-2屬于抗凋亡因子，Bax屬于促凋亡因子，Bax通過與自身組成同源二聚體或者與Bcl-2組成異源二聚體，抑制Bcl-2的活性，從而發揮促進細胞凋亡的作用[13-14]。本研究結果顯示，HPD-PDT處理后的H446細胞Bcl-2mRNA表達水平明顯降低，而BaxmRNA表達水平明顯升高，提示HPD-PDT可能通過改變Bax和Bcl-2異源二聚體平衡而誘導細胞凋亡，與GUO等[15]的研究結果(PDT導致Bcl-2表達水平下調、Bax表達水平上調)一致。Caspase家族是執行細胞凋亡的關鍵酶家族，其成員為存在于胞質溶膠中的半胱氨酸蛋白酶，可以選擇性地對多種信號轉導途徑中的蛋白質進行高效切割[16]。Caspase-9是內源性凋亡途徑中的關鍵蛋白酶，Bcl-2家族成員Bax和Bak的激活導致細胞色素C(Cyt C)等促凋亡蛋白的釋放[17-18]，Cyt C結合Apaf-1形成凋亡小體并激活Caspase-9，活化的Caspase-9可以直接裂解并激活Caspase-3和Caspase-7，從而加速細胞凋亡[19-21]。本研究中H446細胞經HPD-PDT處理后BaxmRNA表達增加，Bcl-2mRNA表達降低，啟動Caspase級聯反應，Caspase-9活化并激活下游Caspase-3和Caspase-7，完成對底物的切割，誘導細胞凋亡。

綜上所述，PDT能明顯抑制人SCLC H446細胞增殖，并誘導其發生凋亡，呈光敏劑濃度與激光功率密度依賴性，其機制可能與上調Bax和Caspase-9mRNA的表達以及下調Bcl-2mRNA的表達有關。本研究結果為PDT在肺癌中的臨床應用提供了一定的理論支持。