劉玫秋,陳曦,姜宏

(青島大學國家生理學重點(培育)學科,山東 青島 266071)

帕金森病(PD)是一種常見的神經退行性疾病，臨床表現主要包括靜止性震顫、運動遲緩、肌強直和姿勢步態障礙等[1]。PD主要病理特征是黑質致密部多巴胺能神經元的進行性喪失以及路易小體的出現。路易小體由異常聚集的α-突觸核蛋白(α-syn)所形成。α-syn是一種小分子酸性蛋白質，主要表達于突觸前末端，在PD致病中的關鍵作用已被廣泛證實[2]。α-syn在細胞內聚集，可促進線粒體損傷，破壞溶酶體和高爾基體等，并增加細胞對氧化應激的易感性，進而促進細胞死亡[3-6]。

研究結果表明，PD病人非運動癥狀出現比運動癥狀提前10～20年，胃腸功能障礙是PD最常見的非運動癥狀，嚴重影響著病人的生活質量[7-9]。根據BRAAK等[10-11]的學說，α-syn的聚集可能始于外周(包括腸神經系統)，并由外周沿迷走神經向中樞神經系統傳播。在PD的不同階段，α-syn在腸中的表達量可能會不同程度地影響胃腸功能。A53T小鼠是攜帶人A53T突變型α-syn基因的PD模型小鼠。在體內，基因突變誘導的α-syn的高表達可導致路易小體的形成和黑質多巴胺能神經元的丟失[12-13]。純合子的A53T小鼠從6月齡開始表現出PD的運動癥狀，并表現出更早和更嚴重的胃腸運動功能下降。但是，在運動癥狀出現之前小鼠胃腸道中α-syn的表達是否已有改變尚不清楚。因此，本實驗觀察了α-syn在3月齡和6月齡的A53T小鼠小腸中的表達變化。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

野生型(WT)小鼠購于北京維通利華公司；A53T小鼠(B6；C3-Tg(PrnpSNCA*A53T)83Vle/J)購自南京大學模式動物研究所。兩種小鼠均按照SPF級別標準，飼養于溫度為(22±2)℃、濕度為(50±10)%、12 h晝夜循環光照的安靜環境中，可自由飲水、進食。選用3月齡和6月齡A53T純合子轉基因小鼠和WT小鼠，每組4只。

1.2 實驗試劑

α-syn抗體、Beta tubulin抗體購于美國Cell Signaling Technology公司；NFH抗體購于美國Santa公司；山羊抗兔和山羊抗鼠抗體購于英國Thermo Fisher Scientific公司；PVDF膜、ECL發光液均購于美國Millipore公司；山羊血清購于中國Solarbio公司；DAPI染液購于中國Roche公司；冷凍切片包埋劑購于日本TaKaRa公司；Triton X-100購于韓國Biosharp公司；Tween-20購于美國Sigma公司。

1.3 蛋白免疫印跡法檢測小鼠小腸組織中α-syn蛋白表達

將小鼠麻醉后，取其鄰近十二指腸的空腸1 cm。向裝有小腸組織的EP管內加入300 μL組織裂解液，用研磨器充分研磨，在冰上進行裂解，靜置30 min后，在4 ℃下以1 200 r/min離心20 min，吸取上清置于新的EP管中，采用BCA法檢測蛋白濃度。按照每孔20 μg蛋白計算上樣量，經SDS-PAGE凝膠電泳(80 V、30 min，120 V、60 min)后，電轉到0.22 μm的PVDF膜上，加100 g/L脫脂奶粉于室溫搖床孵育2 h；加入相應的一抗(α-syn滴度為1∶1 000，Beta tubulin滴度為1∶10 000)，4 ℃搖床孵育過夜(時間>16 h)，用TBST溶液洗3次，每次10 min；分別加入山羊抗兔和山羊抗鼠(滴度均為1∶10 000)的HRP-IgG二抗并室溫孵育1.5 h，然后使用TBST溶液洗3次，每次10 min。ECL發光液顯影后用Image J軟件讀取條帶灰度值，對α-syn表達水平進行分析。

1.4 免疫熒光實驗

取小鼠近十二指腸的空腸1 cm，放入40 g/L多聚甲醛內浸泡1周，之后將小腸分別置于200 g/L和300 g/L蔗糖溶液中梯度沉糖。將沉糖處理后的小腸于冷凍切片機上切成15 μm厚的冷凍切片，并貼到多聚賴氨酸處理過的病理級別載玻片上，在常溫下晾干(24 h)。用0.01 mol/L的PBS清洗包埋劑，然后用體積分數0.1的山羊血清封閉2 h；加入α-syn(滴度1∶250)和NFH(滴度1∶500)一抗4 ℃孵育過夜，用0.01 mol/L PBST溶液洗3次，每次10 min；分別加入山羊抗兔(滴度1∶500)和山羊抗鼠(滴度1∶500)的二抗并室溫孵育1.5 h，然后用0.01 mol/L PBST溶液洗3次，每次10 min。封片，加入體積分數0.7的甘油后蓋上蓋玻片，晾干后進行熒光觀察。

1.5 統計學處理

2 結 果

2.1 不同月齡WT和A53T小鼠小腸組織α-syn表達比較

蛋白免疫印跡法檢測結果顯示，與同月齡WT組小鼠相比，3月齡、6月齡A53T組小鼠小腸組織α-syn表達量顯著增高，差異均有統計學意義(F=3.107、2.955，P<0.05)；6月齡A53T組小鼠小腸的α-syn表達量比3月齡A53T組小鼠增加21.71%，兩組相比差異具有統計學意義(F=2.836，P<0.05)。說明A53T小鼠小腸組織α-syn的表達遠高于WT小鼠，6月齡A53T小鼠小腸組織α-syn的表達高于3月齡A53T小鼠。見表1。

表1 不同月齡WT和A53T小鼠小腸組織α-syn表達的比較

2.2 免疫熒光檢測不同月齡WT和A53T小鼠小腸組織α-syn表達

免疫熒光實驗結果顯示，與同月齡WT組小鼠相比，3月齡、6月齡A53T組小鼠小腸組織α-syn表達量顯著增高；6月齡A53T組小鼠小腸組織α-syn表達量明顯高于3月齡A53T組小鼠。見圖1。

3月齡WT小鼠(A、C)和A53T小鼠(B、D)小腸α-syn染色，6月齡WT小鼠(E、G)和A53T小鼠(F、H)小腸α-syn染色。標尺=100 μm。

3 討 論

本實驗通過蛋白免疫印跡和免疫熒光方法證實，與同月齡的WT小鼠相比較，3月齡和6月齡A53T小鼠小腸組織α-syn表達顯著增加，且隨年齡的增長，A53T小鼠小腸組織α-syn的表達增加。

PD是一種多系統受累的神經退行性疾病，其臨床癥狀不僅包括運動癥狀，還包括便秘、胃排空延遲、唾液分泌過多、吞咽困難、惡心以及嗅覺障礙、抑郁和睡眠障礙等非運動癥狀[8]。其中，胃腸道功能障礙是PD發展過程中一種常見非運動癥狀[14]。2003年，BRAAK等的學說認為，腸道中的α-syn可向中樞神經系統傳播，最初傳播到舌咽和迷走神經背側運動核以及嗅球，隨后逐漸傳播到中腦黑質區，最終達到皮質層[15]。由于在PD病人的疾病早期已經發現了腸道中α-syn的異常沉積，故推測腸神經系統可能是α-syn的一個起始病理位點。α-syn主要位于Meissner和Auerbach’s神經叢的腸神經元中[16-18]。最近的研究結果還表明，多種危險因素可能單獨或共同導致α-syn在腸道表達的增加，例如腸道菌群、腸道炎癥和腸神經膠質細胞功能障礙等[19-21]。了解腸道中的α-syn是如何開始聚集的，將有助于治療胃腸功能障礙，并可能有助于預防或延緩PD的發生和發展。

與PD相關的特異性遺傳突變首先發現于1997年，其中A53T點突變屬于常染色體顯性遺傳，該突變引起的PD通常具備早發性以及病情進展迅速等特點[22-23]。α-syn第53位的丙氨酸被蘇氨酸替代后，能促進可溶性的α-syn寡聚體或原纖維的形成，并可以作為種子促進α-syn在神經元之間的傳播。在轉基因小鼠模型中，表達人突變型α-syn的A53T轉基因小鼠應用最為廣泛。過度表達人A53T突變型α-syn的小鼠隨年齡增長會表現出嚴重的運動障礙以及α-syn病[14,24]。研究發現，在A53T小鼠腦皮質神經元和脊髓運動神經元的細胞質中存在包裹體，包裹體中包含人α-syn和硝基化的α-syn，并且運動神經元在A53T小鼠中耗竭可達75%[13,25]。有研究通過檢測A53T純合子小鼠的食物攝入量、結腸動力以及結腸和回腸環形肌的收縮活動發現，3月齡純合子A53T小鼠的進食量與非轉基因小鼠相比雖然無明顯變化，但腸道運輸時間比非轉基因小鼠延遲2 h左右，同時結腸和回腸環形肌運動反應幅度也明顯下降；6月齡純合子A53T小鼠的胃腸道運輸功能逐漸降低，腸道運輸時間延遲超過3 h，與此同時，結腸和回腸環形肌運動反應幅度進一步降低[26-27]。本實驗結果顯示，3月齡A53T小鼠小腸組織α-syn的表達已經較同月齡WT小鼠出現明顯增加，6月齡A53T小鼠小腸組織α-syn表達亦比3月齡A53T小鼠增加。這說明小腸組織α-syn和PD的胃腸功能障礙可能存在聯系。A53T小鼠在3月齡出現結腸動力障礙時，并未出現PD的運動癥狀，中樞神經系統中也未出現α-syn的病理性聚集，甚至到6月齡時，中樞神經系統也未有α-syn的病理性聚集[26]，但事實上此時腸道中的α-syn已經增加。因此，腸內α-syn的表達量可能作為PD的一項早期診斷指標，本實驗結果為此提供了數據支持。

綜上所述，在未出現運動癥狀的3月齡A53T小鼠小腸中組織有α-syn的表達增加，并且隨年齡增長，A53T小鼠小腸組織α-syn表達也增加。