紫花苜蓿與垂穗披堿草混播比例對(duì)其抗寒生長(zhǎng)生理特征的影響

劉彩婷，毛麗萍，阿依謝木，3，于應(yīng)文，3，沈禹穎，3*

（1. 蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州 730020；2. 蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730020；3. 蘭州大學(xué)草業(yè)科學(xué)國家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，甘肅 蘭州 730020）

紫花苜蓿（Medicago sativa）含豐富的蛋白質(zhì)，是世界上最重要的牧草，素有“飼草之王”的美稱［1-2］。自2012年農(nóng)業(yè)農(nóng)村部啟動(dòng)“振興奶業(yè)苜蓿發(fā)展行動(dòng)”以來，我國紫花苜蓿需求量不斷增加，每年政策性支持苜蓿種植面積為3.33×104~6.67×104hm2，據(jù)中國草業(yè)統(tǒng)計(jì)，截至2019 年全國苜蓿種植面積達(dá)231.8×104hm2，有力促進(jìn)了草畜產(chǎn)業(yè)發(fā)展［3-4］。然而，在我國青藏高原地區(qū)，紫花苜蓿往往面臨越冬率低的問題，制約著紫花苜蓿草地的建植與發(fā)展［5-7］，加之該地區(qū)牧草多以抗寒性強(qiáng)的禾草為主，家畜所需養(yǎng)分以能量類粗纖維為主，粗蛋白供應(yīng)嚴(yán)重不足，難以滿足草食家畜健康生長(zhǎng)需求［8］。聚焦紫花苜蓿抗寒機(jī)理，可為高寒區(qū)引入蛋白含量高的優(yōu)質(zhì)紫花苜蓿，為該地區(qū)草地質(zhì)量的提升提供技術(shù)保障，目前其已成為寒區(qū)苜蓿種植研究熱點(diǎn)之一。

近年來，對(duì)紫花苜蓿抗寒性研究集中于其抗寒品種的篩選，有學(xué)者采用多點(diǎn)試驗(yàn)評(píng)估本地紫花苜蓿與引進(jìn)品種的抗寒性，表明本地品種環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)，其抗寒性優(yōu)于引進(jìn)品種［9］；耐寒性強(qiáng)的紫花苜蓿其根頸可溶性糖含量高，能防止細(xì)胞液凝結(jié)形成小冰晶對(duì)植物根系產(chǎn)生傷害而起到保護(hù)作用，與秋眠級(jí)無直接相關(guān)性［10］；紫花苜蓿對(duì)低溫的響應(yīng)，表現(xiàn)在其葉片的丙二醛、可溶性糖和脯氨酸含量均較對(duì)照有所提升［11］。研究表明，在松嫩平原，紫花苜蓿與無芒雀麥（Bromus inermis）、草地羊茅（Festuca pratensis）分別以30%比例混播時(shí)，越冬期其根系的可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量分別較單播提高14.9%、3.1%和18.0%，表現(xiàn)出混播可提高苜蓿抗寒能力［12-14］。但在青藏高原高海拔地區(qū)，紫花苜蓿與當(dāng)家草種垂穗披堿草（Elymus nutans）的混播能否提高其抗寒性，不同混播比例對(duì)紫花苜蓿苗期的抗寒生長(zhǎng)表型及生理特征的綜合影響尚不明確。因此，本研究在控制低溫下，設(shè)置紫花苜蓿與垂穗披堿草4 個(gè)混播比例，研究不同混播比例下紫花苜蓿的地上、地下形態(tài)和植株生理特征對(duì)低溫的響應(yīng)，并采用隸屬函數(shù)法對(duì)其低溫適應(yīng)性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，為高海拔寒區(qū)紫花苜蓿草地的成功建植提供一定理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

盆栽培養(yǎng)于2021 年3 月至5 月在蘭州大學(xué)榆中校區(qū)智能溫室（35°56′N，104°10′E，海拔1720~1900 m）開展。試驗(yàn)材料為紫花苜蓿“龍牧806”（M. sativacv. Longmu 806，MS）（休眠級(jí)為1［15］）及垂穗披堿草，分別來源于黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)院和甘肅猛犸農(nóng)業(yè)有限公司，純凈度分別≥90%和≥95%，發(fā)芽率分別為80%和85%。盆栽試驗(yàn)采用草炭∶蛭石∶河沙=1∶1∶1 混合基質(zhì)培養(yǎng)，相對(duì)含水量為19.7%，pH 值為6.2，速效氮含量為128.6 mg·kg-1、速效磷含量為58.2 mg·kg-1、速效鉀含量為130.5 mg·kg-1。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

混播設(shè)計(jì)：設(shè)置紫花苜蓿與垂穗披堿草4 個(gè)混播處理：紫花苜蓿占比分別為100%、70%、50%、30%，即MS100%、MS70%、MS50%和MS30%，各處理具相同播種密度（每盆10 株，花盆大小為直徑21 cm×高12 cm），播深2.5~3.0 cm，株距2.0 cm。每個(gè)播種比例16 盆，4 次重復(fù)，共64 盆，完全隨機(jī)排列放置。

溫度處理：在25 ℃下育苗后，先轉(zhuǎn)入15 ℃下低溫培養(yǎng)10 d 后，再轉(zhuǎn)入5 ℃下低溫培養(yǎng)10 d（圖1）。各低溫階段培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)箱內(nèi)光照設(shè)置為3 個(gè)階段：6：00 am-9：00 am 和18：00 pm-20：00 pm 段為弱光照，光強(qiáng)為11000 lx；9：00 am-18：00 pm 為強(qiáng)光照，光強(qiáng)17600 lx；20：00 pm-次日6：00 am 為完全暗光。培養(yǎng)箱相對(duì)濕度為75%。

圖1 溫度處理過程Fig.1 The process of temperature treatment

1.3 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.3.1形態(tài)生長(zhǎng)指標(biāo) 分別在15 ℃下培養(yǎng)10 d 和5 ℃下培養(yǎng)10 d 后，測(cè)定如下指標(biāo)：

株高、分枝數(shù)：用卷尺測(cè)定每盆每株紫花苜蓿絕對(duì)株高，并統(tǒng)計(jì)主莖基部著生的分枝數(shù)。

葉片形態(tài)：測(cè)定每盆中每株紫花苜蓿頂端復(fù)葉中間葉的葉長(zhǎng)、葉寬。

生物量：每個(gè)混播比例下取4 盆，將每盆中苜蓿的地上與地下分開，地上部分直接在105 ℃殺青30 min 后，于65 ℃烘干至恒重；地下部分清洗干凈后在105 ℃殺青30 min 后，于65 ℃烘干至恒重；最后稱地上、地下干重，計(jì)算生物量，換算成g·m-2，并計(jì)算根冠比。

根系形態(tài)：采用根系分析系統(tǒng)（WinRHIZO，REGENT，加拿大）進(jìn)行各處理單株苜蓿根系形態(tài)掃描，獲得單株總根長(zhǎng)、根頸直徑。

1.3.2生理指標(biāo) 紫花苜蓿形態(tài)生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定同期，每個(gè)混播處理下取4 盆，將每盆中紫花苜蓿新鮮葉片和全部根頸部位分別剪下，清洗干凈，用濾紙吸干表面水分，用錫箔紙包裹投入液氮中，帶回實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)入-80 ℃低溫冰箱冷凍保存。可溶性糖含量采用蒽酮比色法測(cè)定［16］；可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)G-250 法測(cè)定［16］；游離脯氨酸含量采用茚三酮比色法測(cè)定［16］。

1.4 紫花苜蓿生長(zhǎng)生理特性綜合評(píng)價(jià)

應(yīng)用Fuzzy 數(shù)學(xué)隸屬函數(shù)法對(duì)不同混播比例下紫花苜蓿生長(zhǎng)生理特性進(jìn)行抗寒性綜合評(píng)價(jià)，其公式如下：

式中：X為紫花苜蓿某一指標(biāo)的測(cè)定值，Xmin，Xmax分別為各處理下此指標(biāo)的最小值和最大值，X1為各處理下此指標(biāo)的隸屬值；若指標(biāo)與抗寒性呈負(fù)相關(guān)，則隸屬函數(shù)值為1-X1；最后將各處理紫花苜蓿各指標(biāo)的隸屬值相加，求出平均值后進(jìn)行比較，平均值越大表明植物抗寒適應(yīng)性越強(qiáng)［11］。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0 對(duì)不同紫花苜蓿占比下各生長(zhǎng)和生理指標(biāo)進(jìn)行單因素方差分析，并用Duncan 法進(jìn)行多重比較（α=0.05）；采用Excel 2016 和Origin 2018 對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫花苜蓿生長(zhǎng)特征

15 ℃階段，相比MS100%，MS70%、MS50%和MS30%紫花苜蓿株高分別降低20.1%、34.0%和21.0%（P<0.05），而分枝數(shù)分別提高18.4%、34.0%和28.2%（P<0.05）；5 ℃階段，紫花苜蓿株高隨其占比減少呈增加趨勢(shì)，且MS30%分別較MS100%和MS70%高25.8%和28.4%（P<0.05）；MS50%的紫花苜蓿分枝數(shù)最高，較MS100%提高28.1%（P<0.05）（圖2）。

圖2 2 個(gè)溫度階段紫花苜蓿在不同混播占比下的株高和分枝數(shù)Fig.2 Plant height and branch number of alfalfa at two temperature stages under different mixed proportion

15 ℃階段，紫花苜蓿葉長(zhǎng)和葉寬在各處理下差異均不顯著（P>0.05）；5 ℃階段，MS70%、MS50%和MS30%紫花苜蓿葉長(zhǎng)分別較MS100%高28.2%、35.5%和25.5%（P<0.05），而葉寬分別比MS100%低18.2%、24.7%和14.5%（P<0.05）。15 ℃階段，MS70%的紫花苜蓿葉寬長(zhǎng)比明顯低于MS30%（P<0.05）；5 ℃階段，MS70%、MS50%和MS30%紫花苜蓿葉寬長(zhǎng)比分別較MS100%降低35.7%、44.3%和30.0%（P<0.05）（圖3）。

圖3 2 個(gè)溫度階段紫花苜蓿在不同混播占比下葉長(zhǎng)、葉寬和葉寬長(zhǎng)比Fig.3 Leaf length，width and width/length of alfalfa at two temperature stages under different mixed proportion

15 和5 ℃階段，各組分地上生物量均隨各自占比的增加而增加，總生物量變化為：MS50%>MS30%>MS70%>MS100%，表現(xiàn)出明顯的混播優(yōu)勢(shì)。15 ℃階段，MS50%的地上總生物量分別較MS100%、MS70%和MS30%提高173.4%、62.5%和8.6%（P<0.05）；5 ℃階段，MS50%地上總生物量最高，分別較MS100%、MS70%和MS30%提高169.8%、36.7%和6.9%（P<0.05）（圖4）。

圖4 2 個(gè)溫度階段及不同混播占比下牧草地上生物量Fig.4 Aboveground biomass of forage at two temperature stages under different mixed proportion

15 ℃階段，MS50%紫花苜蓿根頸直徑為2.1 mm，較MS100%和MS70%分別增大46.8%和21.4%（P<0.05）；5 ℃階段，紫花苜蓿根頸直徑隨其占比降低依次增加，MS50%和MS30%顯著高于MS70%和MS100%（P<0.05）。15 ℃階段，隨紫花苜蓿占比減少其主根長(zhǎng)度增加，MS30%紫花苜蓿主根長(zhǎng)度分別較MS100%和MS70%長(zhǎng)22.1%和12.1%（P<0.05）；5 ℃階段，MS50%分別較MS100%和MS70%長(zhǎng)29.2%和28.4%（P<0.05）（圖5）。

圖5 2 個(gè)溫度階段紫花苜蓿在不同混播占比下根頸直徑和主根長(zhǎng)度Fig.5 Root collar diameter and tap root length of alfalfa at two temperature stages under different mixed proportion

15 和5 ℃階段，MS70%、MS50%和MS30%下紫花苜蓿地下生物量均顯著高于MS100%處理（P<0.05）；垂穗披堿草地下生物量隨紫花苜蓿占比的減少而增加；總地下生物量表現(xiàn)為：MS50%>MS30%>MS70%>MS100%。其中，15 和5 ℃階段，MS50%下地下總生物量均最高，分別為67.64 和92.31 g·m-2，顯著高于MS100%和MS70%處理（圖6）。混播群落中紫花苜蓿根冠比隨其占比的減少而增加。其中，15 ℃階段，MS30%根冠比最高，為0.60，顯著高于其他處理（P<0.05）；5 ℃階段，MS30%紫花苜蓿根冠比為0.65，較MS100%增加58.5%（P<0.05）（圖7）。

圖6 2 個(gè)溫度階段及不同混播占比下牧草地下生物量Fig.6 Underground biomass of forage at two temperature stages under different mixed proportion

圖7 2 個(gè)溫度階段紫花苜蓿在不同混播占比下根冠比Fig.7 Root/shoot of alfalfa at two temperature stages under different mixed proportion

2.2 紫花苜蓿可溶性糖含量

15 和5 ℃階段，葉片和根系可溶性糖含量均在MS50%最高。其中，15 ℃階段，MS50%葉片可溶性糖含量為3.63%，顯著高于其他3 個(gè)播種比例，根系可溶性糖含量于MS70%、MS50%和MS30%分別較MS100%提高13.1%、25.2%和14.0%（P<0.05）。5 ℃階段，葉片和根系可溶性糖含量在MS50%分別為9.58%和12.0%，均顯著高于其他3 個(gè)播種比例（P<0.05）（圖8）。

圖8 2 個(gè)溫度階段紫花苜蓿在不同混播占比下可溶性糖含量Fig.8 Soluble sugar content of alfalfa at two temperature stages under different mixed proportion

2.3 紫花苜蓿可溶性蛋白含量

15 ℃階段，隨紫花苜蓿占比減少，葉片中可溶性蛋白含量增加，MS30%和MS50%分別為9.88 和9.51 mg·g-1，較MS100%分別高26.5%和21.6%（P<0.05），根系可溶性蛋白含量在各紫花苜蓿占比下無差異（P>0.05）；5 ℃階段，葉片可溶性蛋白含量以MS50%最高，為24.35 mg·g-1，較MS100%高23.3%（P<0.05），根系可溶性蛋白含量在MS50%和MS30%較高，分別較MS100%顯著高69.1%、56.7%（P<0.05）（圖9）。

圖9 2 個(gè)溫度階段紫花苜蓿在不同混播占比下可溶性蛋白含量Fig.9 Soluble protein content of alfalfa at two temperature stages under different mixed proportion

2.4 紫花苜蓿脯氨酸含量

15 ℃階段，葉片脯氨酸含量在MS50%最高，為4.22 mg·g-1，較MS100%高28.7%（P<0.05），根系脯氨酸含量隨紫花苜蓿占比降低而增加，以MS30%下最高，為5.05 mg·g-1，較MS100%顯著高32.9%（P<0.05）；5 ℃階段，隨紫花苜蓿占比降低，葉片脯氨酸含量上升，MS30%最高，為7.91 mg·g-1，分別較MS100%和MS70%高33.2%和29.9%（P<0.05），根系脯氨酸含量以MS50%最高，分別較MS100%和MS70%高38.0%和27.4%（P<0.05）（圖10）。

圖10 2 個(gè)溫度階段紫花苜蓿在不同混播占比下脯氨酸含量Fig.10 Proline content of alfalfa at two temperature stages under different mixed proportion

2.5 紫花苜蓿綜合抗寒評(píng)價(jià)

從生理指標(biāo)的變化看紫花苜蓿根系較葉片敏感，因而此處選擇各紫花苜蓿占比下紫花苜蓿的生長(zhǎng)表型和3 個(gè)根系生理指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)其抗寒性。結(jié)果表明，各紫花苜蓿占比下苜蓿的抗寒性有所不同。MS50%處理下隸屬值最高，為0.62，綜合抗寒性最強(qiáng)；其次為MS30%，隸屬值為0.53；MS100%處理的隸屬值最小，為0.26，抗寒性最差，即隨紫花苜蓿占比降低，紫花苜蓿的抗寒性能提高，本研究中紫花苜蓿在混播群落占比30%~50%時(shí)，對(duì)低溫的適應(yīng)性提高，抗寒性能提升（表1）。

表1 不同紫花苜蓿占比下各指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)隸屬值Table 1 Comprehensive evaluation membership value of each index under different proportion of alfalfa

3 討論

3.1 混播比例對(duì)低溫下紫花苜蓿生長(zhǎng)及產(chǎn)量的影響

豆-禾混播作為理想栽培模式，在形態(tài)、生長(zhǎng)發(fā)育方面的互補(bǔ)優(yōu)勢(shì)下，牧草生長(zhǎng)形態(tài)及產(chǎn)量在不同生態(tài)區(qū)域表現(xiàn)出對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性［17-19］。本研究中，隨生長(zhǎng)溫度從15 ℃降低到5 ℃，混播群落中紫花苜蓿的株高、分枝數(shù)、葉長(zhǎng)及主根長(zhǎng)未受明顯抑制，其葉寬、葉寬長(zhǎng)比和根頸直徑等減小，這與前人在紫花苜蓿單播時(shí)的研究結(jié)果相吻合［20-22］；但本研究紫花苜蓿在占比30%~50%下表現(xiàn)較優(yōu)，這與前人在部分低海拔、高緯度寒冷地區(qū)的研究結(jié)果相似。以往寒冷地區(qū)的研究表明，在加拿大紫花苜蓿以11%~33%占比與山丹雀麥（Bromus riparius）混播時(shí)的群落產(chǎn)量較單播顯著提高16%~32%［23］，在吉林省紫花苜蓿以50%占比與羊草（Leymus chinensis）混播時(shí)群落產(chǎn)量較單播提高33%［24］，松嫩腹地紫花苜蓿與羊草混播占比各為50%時(shí)，其葉面積和生物量分別較單播提高46%和96%［25］；在部分溫帶地區(qū)，紫花苜蓿占比≥50%時(shí)，群落生長(zhǎng)表現(xiàn)出較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)性，如內(nèi)蒙古西遼平原紫花苜蓿與3 種禾草混播和美國西部地區(qū)紫花苜蓿與4 種禾草混播時(shí)，紫花苜蓿占比為67%~75%的群落產(chǎn)量最高［26-27］。說明紫花苜蓿與禾草的混播比例在寒冷和溫帶地區(qū)具較大差異性，其可能原因是溫度可通過調(diào)控合理混播比例來實(shí)現(xiàn)組分對(duì)資源的充分利用，進(jìn)而提高混播牧草生長(zhǎng)對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力。

3.2 混播比例下紫花苜蓿生理特性對(duì)低溫的響應(yīng)

豆-禾混播合理搭配不僅在形態(tài)、生長(zhǎng)發(fā)育方面存在互補(bǔ)，而且在營養(yǎng)資源利用方面也具有較好的互補(bǔ)性，可以通過優(yōu)化養(yǎng)分利用來提高牧草對(duì)生境的適應(yīng)性［28-29］。如寒冷脅迫下，植物積累更多滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來抵御寒冷環(huán)境［16］。本研究中，隨溫度降低混播較單播紫花苜蓿根系和葉片可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量明顯上升，根系上升幅度更大，對(duì)紫花苜蓿安全越冬貢獻(xiàn)更大。不同混播比例紫花苜蓿根系對(duì)低溫脅迫的貢獻(xiàn)不一，其中以紫花苜蓿占比50%時(shí)貢獻(xiàn)最大，且5 ℃階段均比15 ℃階段約高出1 倍；黃麗琴等［30］報(bào)道，紫花苜蓿占比33%與禾草混播時(shí)，紫花苜蓿根系可溶性糖含量最高；申曉慧等［31］以不同品種紫花苜蓿占比30%與草地羊茅混播，紫花苜蓿根系可溶性糖、可溶性蛋白及游離脯氨酸含量均隨溫度降低而增加，均于最冷月（11 月中旬）達(dá)最大值，且與單播處理差異顯著。說明低溫環(huán)境下，紫花苜蓿與禾草混播對(duì)紫花苜蓿根系抗寒物質(zhì)積累有重要影響，通過提高紫花苜蓿根系抗寒滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的大量積累，降低其根系細(xì)胞質(zhì)溶液的凝固點(diǎn)，以有效防止細(xì)胞液凝結(jié)形成小冰晶對(duì)其產(chǎn)生傷害作用，進(jìn)而提高其抗寒性能［11］。因此，紫花苜蓿與禾草混播具明顯抗寒優(yōu)勢(shì)。

3.3 紫花苜蓿抗寒性綜合評(píng)價(jià)

抗寒性是植物在寒冷環(huán)境長(zhǎng)期適應(yīng)中通過本身遺傳變異和自然選擇獲得的一種抗寒能力，有許多其他重要的因素控制植物抗寒性［32］，僅憑單一生理指標(biāo)無法全方位反映植物抗寒性［33-34］。因此，評(píng)價(jià)植物抗寒性不僅需選擇適宜指標(biāo)，更需科學(xué)準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)方法。當(dāng)前評(píng)價(jià)植物抗寒性常用方法主要有隸屬函數(shù)法、主成分分析、聚類分析法等，其中，隸屬函數(shù)法能全方位篩選出與抗寒性顯著相關(guān)的關(guān)鍵指標(biāo)，揭示不同植物間抗寒性差別，已廣泛運(yùn)用于老芒麥（Elymus sibiricus）［35］、垂穗披堿草［36］、燕麥（Avena sativa）［37］、紅三葉（Trifolium pratense）［38］等的抗寒抗旱性研究中。本研究運(yùn)用隸屬函數(shù)法，從紫花苜蓿形態(tài)及根系生理角度，綜合分析不同紫花苜蓿占比下紫花苜蓿的抗寒性，得出混播群落中紫花苜蓿占比30%~50%下其對(duì)低溫具較好適應(yīng)性。

4 結(jié)論

紫花苜蓿與垂穗披堿草混播較單播更能提升紫花苜蓿的抗寒性，且不同紫花苜蓿占比下紫花苜蓿形態(tài)生長(zhǎng)和生理特征對(duì)低溫的適應(yīng)性不同。隨生長(zhǎng)過程中溫度的持續(xù)降低，紫花苜蓿較低占比下其株高、分枝數(shù)、根頸直徑、主根長(zhǎng)度、生物量等具較好低溫適應(yīng)性，同時(shí)可積累更多可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來抵御嚴(yán)寒，保證生長(zhǎng)。綜合評(píng)價(jià)得出，紫花苜蓿占比50%下其抗寒性最強(qiáng)，其次是30%處理。因此，30%~50%的紫花苜蓿與垂穗披堿草混播，是研究區(qū)紫花苜蓿-禾草混播草地建植較適宜比例。