基于多光譜成像技術(shù)快速無損檢測紫花苜蓿人工老化種子

王雪萌，何欣，張涵，宋瑞，毛培勝，賈善剛

（中國農(nóng)業(yè)大學草業(yè)科學與技術(shù)學院，草業(yè)科學北京市重點實驗室，北京 100193）

種子老化（seed aging）是指種子活力的自然衰退，即種子生活力逐漸減弱以至完全喪失的過程［1］。種子收獲后隨著貯藏時間的延長不可避免地發(fā)生老化，這是一個由量變到質(zhì)變不可逆的生物學過程，不僅影響種子發(fā)芽和幼苗生長，而且對種質(zhì)資源的保存、開發(fā)和利用都造成嚴重影響，甚至影響草地補播和建植水平［2-4］。種子老化一直是種子科學研究領(lǐng)域的熱點，區(qū)分老化種子對保證種子質(zhì)量及減少經(jīng)濟損失也具有重大意義。然而，不同老化程度的種子在外部形態(tài)上幾乎沒有差異。傳統(tǒng)的老化種子檢測方法是依據(jù)氣味、顏色和飽滿度等指標進行分選，具有一定主觀性；常規(guī)的檢測方法如發(fā)芽試驗、四唑染色等［5］，這些試驗非常耗時，而且種子經(jīng)過試驗檢測后無法保持原狀，進而無法實現(xiàn)高通量和快速無損檢測。

多光譜成像（multispectral imaging，MSI）技術(shù)是一種新型的分析檢測技術(shù)，該技術(shù)結(jié)合了光譜技術(shù)和成像技術(shù)，可同時獲取被測物的光譜信息和空間信息，具有簡便、實用、檢測成本低和無破壞性等優(yōu)點［6］。由于多光譜成像技術(shù)具有實用性和探索生物材料內(nèi)在特性的能力，目前已經(jīng)廣泛應用于不同種類的鑒定以及眾多品質(zhì)檢測中［7］。比如，在種子檢測和鑒定方面，多光譜成像技術(shù)已開始應用于種和品種測定［8-9］、種子活力和生活力檢測［10-11］、種子健康檢測［12-13］等領(lǐng)域。不同老化程度種子的內(nèi)部信息及光譜信息間存在差異，所以多光譜成像技術(shù)在老化種子檢測方面具有很大潛力。

紫花苜蓿（Medicago sativa）種子是我國最重要的牧草種子之一，其種子產(chǎn)量遠高于其他多年生牧草［14］。除此之外，每年還需從國外進口大量的紫花苜蓿種子。紫花苜蓿種子的生產(chǎn)和交易給種子安全貯藏帶來了壓力，由于各種環(huán)境因素的影響導致種子在貯藏過程中不可避免地發(fā)生老化［15］。因此，本研究通過對不同人工老化程度的紫花苜蓿種子進行多光譜信息采集，根據(jù)其形態(tài)特征及光譜特征進行分類，提出了快速、無損鑒定老化種子的新方法，為老化種子的高效分選奠定了基礎(chǔ)，提供了分析思路和方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和樣品制備

試驗材料“中苜2 號”紫花苜蓿種子由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部牧草與草坪草種子質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心（北京）提供，2017 年從內(nèi)蒙古鄂托克旗賽烏素紫花苜蓿種子田收獲。2019 年11 月，將種子含水量調(diào)至10%，分別置于鋁箔袋內(nèi)密封，于45 ℃、濕度100%條件的電熱恒溫水箱中進行3，6 和14 d 的人工加速老化處理后，放置于-20 ℃環(huán)境保存（圖1）。2020 年，對未老化種子（CK）、老化3 d（A3）、老化6 d（A6）及老化14 d（A14）的4 組種子，各取100 粒進行多光譜數(shù)據(jù)采集。在區(qū)分老化和未老化種子的同時，將4 個處理組中的種子，分為發(fā)芽種子（G）和不發(fā)芽種子（NG）兩個組別，進一步研究多光譜數(shù)據(jù)預測種子發(fā)芽的表現(xiàn)。

圖1 4 組種子材料的多光譜RGB 成像Fig.1 RGB image of seeds in four groups by MSI

1.2 老化程度測定

發(fā)芽率、發(fā)芽勢是常用且較為客觀的反映種子生活力的指標，一般來說種子發(fā)芽率越高，種子活力就越高，其下降程度一般用來表示種子生活力的高低［16-17］。將多光譜采集后的種子按照編號，50 粒為一組置于培養(yǎng)皿中，設置8 個重復，進行紙上發(fā)芽試驗，并每天監(jiān)測各培養(yǎng)皿中的發(fā)芽情況。

1.3 多光譜成像系統(tǒng)數(shù)據(jù)采集

多光譜成像系統(tǒng)的主要儀器為VideometerLab（Videometer A/S，Herlev，丹麥），該儀器內(nèi)部安裝有19 個非均勻分布波長的單色發(fā)光二極管（light-emitting diodes，LED），波長分別為365，405，430，450，470，490，515，540，570，590，630，645，660，690，780，850，880，940 和970 nm，采集圖像時經(jīng)過大約5 s 的連續(xù)頻閃，就可以得到一個立方體圖像，同時產(chǎn)生19 個不同波長下的單色圖像［7，18］。

采集光譜信息時，將4 個處理組的種子分別編號為1~100，25 粒為一組置于培養(yǎng)皿中放置在一個空心積分球下。在圖像采集過程中，球體在采樣臺上閉合，創(chuàng)造光學閉合條件，從而完成圖像信息的采集。在獲取光譜圖像時，主要的目標是種子，所以需要通過背景分割的方法去除背景。之后對圖像進行分析處理，提取種子的形態(tài)特征和光譜特征等屬性。形態(tài)信息主要包括面積、長度、寬度、長寬比、緊實度（compactness circle，compactness ellipse）、Beta shape a、Beta shape b、垂直偏度（vertical skewness）、顏色（CIELab）、飽和度、色調(diào)等指標。提取的光譜信息代表了從種子圖像像素中計算的每個波長反射光平均強度。

1.4 多光譜數(shù)據(jù)分析

本研究利用種子的形態(tài)信息進行了老化種子和未老化種子以及不同老化程度種子間的形態(tài)分析；利用種子的光譜特征進行了平均光譜反射率、像素直方圖等指標的區(qū)分；利用種子的形態(tài)和光譜的綜合信息進行了主成分分析（principal component analysis，PCA）、線性判別分析（linear discrimination analysis，LDA）、支持向量機（support vector machines，SVM）和歸一化標準判別分析（normalized canonical discriminant analysis，nCDA），并采用了Hold-Out Method 進行交叉驗證。

PCA 作為一種探索性的多元分析技術(shù)，常用于高維數(shù)據(jù)的降維分析［19］，是識別種子形態(tài)特征和光譜特征的模型，并具有將相似形態(tài)和光譜特征的種子進行區(qū)分的可能性，可用于提取數(shù)據(jù)的主要特征量。

SVM 主要用于解決模式識別領(lǐng)域中的數(shù)據(jù)分類問題，屬于有監(jiān)督學習算法的一種。SVM 的學習策略就是最小化類內(nèi)觀測距離，最大化類間觀測距離［20］。種子隨機抽樣作為校準集和驗證集，分別占總樣本的70%和30%。模型的分類性能通過準確度、敏感性及特異性進行評估。一般來說，模型的性能主要是依靠準確度來判斷的，使用準確度作為評價標準是因為很多時候敏感性和特異性并不能清晰地說明哪個分類器的效果更好［18］。

式中：TN 表示樣本為未老化，預測為未老化；TO 表示樣本為老化，預測為老化；FN 表示樣本為老化，預測為未老化；FO表示樣本為未老化，預測為老化。

LDA 算法是模型識別中的經(jīng)典算法，LDA 的原理與SVM 是相同的。將數(shù)據(jù)在低維度上進行投影，投影后使每一種類別數(shù)據(jù)的投影點盡可能地接近，而不同類別數(shù)據(jù)的類別中心間距盡可能地大，即降維后保證最小化類內(nèi)觀測距離，最大化類間觀測距離，使得樣本在空間內(nèi)具有最佳的可分離性。LDA 的分類性能也是通過上述的準確度、敏感性和特異性來評價的。

nCDA 法作為一種監(jiān)督變換構(gòu)建方法，可以將圖像劃分為具有不同光譜特征的感興趣區(qū)域［7］。當不同老化種子具有不同的光譜特征時，將其采用不同的視覺標志來標記感興趣的區(qū)域，用不同的層（老化和未老化種子相比時，老化種子為綠色層，未老化種子為紅色層）來識別nCDA 變換的組，它們將作為兩個不同的感興趣區(qū)域出現(xiàn)在nCDA 變換的圖像中，將數(shù)據(jù)結(jié)果轉(zhuǎn)化為可視化分析圖像［13］。

PCA、SVM 和LDA 分 別使用R 語 言中的FactoMineR、e1071和MASS包進 行分析 預測，nCDA 分析使用VideometerLab 4 軟件中 的MSI-Transformation Builder。

2 結(jié)果與分析

2.1 老化種子發(fā)芽結(jié)果

紙上發(fā)芽試驗結(jié)果表明，3 個不同老化程度（A3、A6 和A14）的種子發(fā)芽率均低于未老化種子，而且隨著人工老化時間的增加，種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢均呈現(xiàn)下降趨勢（圖2）。CK 的發(fā)芽率可以達到98%；A14的發(fā)芽率僅為45%。

圖2 人工處理老化種子的發(fā)芽指標統(tǒng)計Fig.2 Germination index in artificially aged seeds

2.2 老化種子的多光譜形態(tài)特征分析

從不同老化程度種子的多光譜數(shù)據(jù)中，提取了14個與形態(tài)特征相關(guān)的指標信息。對3 個老化種子處理組（A3、A6 和A14）與未老化種子（CK）進行比較后，發(fā)現(xiàn)有10 個形態(tài)特征指標在組間呈現(xiàn)出顯著或極顯著差異（表1）。比如，面積、長度、寬度、緊實度橢圓、顏色指標（CIELab L*，CIELab A*，CIELab B*）和色調(diào)等均與CK 組差異顯著。其中，有7 個指標是3 個老化處理組中共同的差異指標。

表1 老化種子和未老化種子的形態(tài)特征比較分析Table 1 Morphological features of aged seeds and non-aged seeds

利用多光譜技術(shù)采集的形態(tài)信息可以對老化種子和未老化種子進行簡單的區(qū)分，但是不同老化程度種子間的形態(tài)指標差異并不大。對3 個老化處理組進行兩兩比較，發(fā)現(xiàn)A3 和A6 的種子只在CIELab A*指標上存在顯著差異；而從A3 和A14 的種子對比來看，差異比較明顯，在顏色參數(shù)L*、A*，飽和度和色調(diào)指標上均可看出差異（表2）。

表2 不同老化程度種子的形態(tài)特征比較分析Table 2 Morphological features of aged seeds for different days

2.3 老化種子光譜特征分析

本研究分析了不同老化程度紫花苜蓿種子在19 個波段下的光譜信息，發(fā)現(xiàn)各處理組間種子的平均光譜反射率具有相似的變化趨勢（圖3），在470~660 nm 處出現(xiàn)了明顯的區(qū)別，此時CK 的平均光譜反射率最高，其次是A6、A14 和A3；在660 nm 之后的波段，可以觀察到平均光譜反射率發(fā)生了變化，反射率最高的是A14，其次是A6、A3 和CK。

圖3 19 個波長下不同老化程度種子的平均光譜反射率Fig. 3 Reflectance of 19 wavelengths in aged seeds for different days

根據(jù)種子的平均光譜反射率分布情況，選取了兩個中間區(qū)段的波長（515 和590 nm），以及兩個兩端的波長（365 和970 nm），進行像素直方圖分析（圖4）。515 和590 nm 這兩個波長剛好位于可見光波段（400~760 nm），結(jié)果表明不同老化程度種子在這兩個波長條件下Y 軸像素值差異較大（圖4A，B）。365 和970 nm 的像素直方圖中，老化種子與未老化種子之間存在差異；而且不同老化程度種子（A3、A6 和A14）間仍然存在差異，但是信號峰的順序正好相反，比如在圖4C 的A3 vs A6 中，藍色A3 峰出現(xiàn)在黃色A6 峰的右邊，但是在圖4D 中順序相反（圖4C，D）。

圖4 老化種子的像素直方圖Fig.4 Pixel histogram of aged seeds

2.4 老化種子的多元分析

基于上述多光譜數(shù)據(jù)表現(xiàn)出來的差異，對4 個處理組開展了多元分析，進一步對樣品的多光譜數(shù)據(jù)進行分類和預測。首先，將CK 與其他3 個老化組進行比較，之后在3 個老化組間進行了相互比較，共得到6 組對比數(shù)據(jù)。基于形態(tài)和光譜綜合數(shù)據(jù)，開展PCA 分析提取出前兩個主成分（圖5），它們分別解釋了6 個對比組原始方差的59.1%（CK vs A3），60.7%（CK vs A6），60.4%（CK vs A14），58.3%（A3 vs A6），58.0%（A3 vs A14）和59.1%（A6 vs A14）。然而，PC1/PC2 二維圖均未能很好地區(qū)分開不同老化程度種子，所以PCA 無法準確區(qū)分老化和未老化種子。SVM 在區(qū)分老化和未老化種子時，平均準確度分別為94.9%（CK vs A3）、92.4%（CK vs A6）和92.4%（CK vs A14），同時能夠得到較高的敏感性（95.2%~97.0%）和特異性（88.7%~92.8%）；然而，對于不同老化程度種子的區(qū)分效果相對較差，準確率在68.7%~78.8%（表3）。LDA 模型區(qū)分老化種子和未老化種子的準確度高達97.7%（CK vs A3）、93.0%（CK vs A6）和97.3%（CK vs A14）；而且具有很高的敏感性（95.6%~99.3%）和特異性（90.5%~96.8%）（表3）。

圖5 不同老化程度種子基于形態(tài)和光譜數(shù)據(jù)的PCA 分析結(jié)果Fig.5 PCA plot based on morphological and multispectral data in aged seeds for different days

相對SVM 來說，LDA 在區(qū)分不同老化程度種子時，得到了更好的分類效果（表3），準確度分別為91.7%（A3 vs A6）、82.8%（A3 vs A14）和75.3%（A6 vs A14），同時也能夠獲得較高的敏感性（73.0%~94.4%）和特異性（78.2%~88.3%）。nCDA 以CK 為基準，區(qū)分A3、A6 和A14 的準確度分別為94%、88%和90%（表4）。

表3 種子老化及發(fā)芽情況的多元分析Table 3 Discrimination of aged and germinated seeds based on multivariate analysis（%）

表4 老化種子nCDA 預測結(jié)果對應實際發(fā)芽情況統(tǒng)計Table 4 The prediction of aged and germinated seeds in aged seeds based on nCDA

綜合比對PCA、SVM、LDA 和nCDA 模型，發(fā)現(xiàn)LDA 模型在老化種子區(qū)分中的效果最佳。

2.5 種子發(fā)芽情況的多元分析

在進行區(qū)分老化和未老化種子分析之后，進一步研究了多光譜數(shù)據(jù)預測種子發(fā)芽的表現(xiàn)。將4 個處理組中的種子，分成發(fā)芽種子（G）和不發(fā)芽種子（NG）兩個組別，利用多光譜儀器得到的形態(tài)數(shù)據(jù)和光譜數(shù)據(jù)重新建立判別模型。經(jīng)PCA 提取前兩個主成分后，解釋了原始方差的62.7%（圖6），但是PCA整體區(qū)分效果仍不適合應用于種子發(fā)芽鑒定。SVM在區(qū)分G 和NG 中的平均準確度為92.1%；相比之下，LDA 是區(qū)分種子發(fā)芽的最佳模型，準確度達到了98.7%，敏感性（98.0%）和特異性（99.3%）也非常高（表3）。利用部分已知的發(fā)芽種子和不發(fā)芽種子分別作為紅色和藍色標準樣品進行分層，種子的多光譜經(jīng)nCDA 算法轉(zhuǎn)換后，可以利用種子轉(zhuǎn)換后的顏色，來甄別種子是否可以發(fā)芽（圖7）。隨老化時間的增加，nCDA 圖像中紅色種子的數(shù)量越來越少，藍色種子的數(shù)量增加，即隨老化處理時間的增加，能夠發(fā)芽的種子數(shù)量越來越少，比如，A14 中藍色種子的數(shù)量明顯多于A6（圖7）。將nCDA 轉(zhuǎn)換圖像和實際發(fā)芽情況進行比對，發(fā)現(xiàn)nCDA 對種子發(fā)芽預測準確度達到了90%~99%（表4）。

圖6 種子發(fā)芽情況基于形態(tài)和光譜數(shù)據(jù)的PCA 分析結(jié)果Fig. 6 PCA plot based on morphological and multispectral data in germinated and non-germinated seeds

圖7 老化種子的nCDA 圖像與實際發(fā)芽情況比對圖Fig.7 nCDA image of aged seeds vs actual germination

綜合比對PCA、SVM、LDA 和nCDA 模型，發(fā)現(xiàn)LDA 模型在種子發(fā)芽情況的區(qū)分中效果最佳。

3 討論

通過目測的方法區(qū)分紫花苜蓿老化和未老化種子是非常困難的，所以可以采用一種快速、直觀的方法對老化種子進行區(qū)分。一個物種存在固有的形態(tài)和光譜特征，可以利用這些特征數(shù)據(jù)來區(qū)別物種內(nèi)或物種間的類別。這是多光譜成像技術(shù)可以作為種子分類工具的基礎(chǔ)［9，18］。大多數(shù)研究表明，種皮在老化過程中顏色變深［21-22］，所以傳統(tǒng)方法常依據(jù)色澤等指標對老化種子進行評判［23］，但是這種方法的主觀性較強。多光譜顏色指標（CIELab L*，CIELab A*和CIELab B*）能夠區(qū)分人眼不可察覺的顏色變化，消除視覺區(qū)分的主觀性［5］。通過多光譜對形態(tài)數(shù)據(jù)的采集，可以發(fā)現(xiàn)老化種子和未老化種子間CIELab 指標存在顯著差異。李振華等［24］發(fā)現(xiàn)CIELab 顏色指標可以實時定量監(jiān)測蒴果（capsule）的發(fā)育過程，輔助預測種子活力變化。但是CIELab 僅僅反映種子的顏色屬性，因此在下結(jié)論時需要多指標綜合考量。除此之外，在本研究中還發(fā)現(xiàn)了老化種子的面積、長度和寬度這3 個形態(tài)指標顯著高于未老化種子［25］。

老化過程會改變種子的形態(tài)特征和化學成分［26］。研究表明，種子老化過程表現(xiàn)出丙二醛（MDA）、脂肪酸和可溶性糖含量增加以及有毒有害物質(zhì)積累等特點［27］，Shrestha 等［28］指出，這些變化都可以在可見光和近紅外光譜中追蹤，可見光范圍內(nèi)的差異可歸因于種子樣品顏色的變化；近紅外范圍內(nèi)的差異可歸因于種子樣品化學成分的變化。對豇豆（Vigna unguiculata）種子的研究發(fā)現(xiàn)，與未老化種子相比，老化種子在部分可見光波段的反射率低，在近紅外波段反射率高［29］，本研究結(jié)果與此一致。結(jié)果表明，老化種子的種皮質(zhì)地及化學成分的改變，導致了種子反射率的變化。總的來說，從多光譜圖像中提取的光譜數(shù)據(jù)包含了快速鑒別未老化種子和老化種子所需的化學信息。Salimi 等［30］研究機械加工過程對甜菜（Beta vulgaris）種子造成損傷的程度，發(fā)現(xiàn)平均光譜反射率在可見光區(qū)域（低于709 nm）顯示出非常小的差異，而在近紅外區(qū)域的差異程度較大；本研究中紫花苜蓿種子在近紅外區(qū)域是可區(qū)分的，但是在可見光區(qū)域（470~660 nm）表現(xiàn)為更好的可區(qū)分性。這種差異可能是由于種子樣品和檢測目標不同產(chǎn)生的［12，31-33］。

PCA 作為一種無監(jiān)督的判別方法，常用于顯示樣本分布模式。本試驗在紫花苜蓿上利用PCA 的方法并不能準確區(qū)分老化和未老化種子，與Hu 等［18］和叢曉翔［25］的研究一致，PCA 區(qū)分性能的好壞可能是由于種類不同導致的［34-35］。其次，可能是由于PCA 中所用的信息是使用方差來定義的，方差越大其所含的信息量越大，所以在降維時，PCA 的首要目的是使變量的方差最大化，而不是使種子間的可分辨性最大化。同時，進行主成分分析之后，前兩個主成分僅占總方差的58.0%~60.7%，這表明可能發(fā)生了信息甚至是重要信息的丟失，進一步導致了PCA 區(qū)分能力差而無法分組。相比之下，利用SVM 和LDA 區(qū)分老化和未老化種子均可以達到很高的準確度；SVM 和LDA 的原理相同且都屬于有監(jiān)督的模型，具有良好的組間區(qū)分能力。但是，LDA 的區(qū)分效果優(yōu)于SVM，產(chǎn)生這種差異的原因可能是因為兩個模型的工作方式不同。已知的研究表明，SVM 側(cè)重于近紅外區(qū)域（780~970 nm）的數(shù)據(jù)，LDA 更善于應用綜合數(shù)據(jù)［9，18，26，36］。為了充分發(fā)揮多光譜成像技術(shù)的應用，將多光譜圖像經(jīng)nCDA 算法轉(zhuǎn)化后形成可視化圖像，進而對老化種子進行判別可以獲得很好的效果。nCDA 算法集成于VideometerLab 4 多光譜成像系統(tǒng)［10，13，37］，可以快速的呈現(xiàn)分類圖進而直觀的對老化種子和未老化種子進行區(qū)分，對于高通量種子檢測具有重要意義。

同一批次的種子質(zhì)量應該是一致的，但是在不同的貯藏條件的影響下，種子批次內(nèi)的單個種子狀態(tài)會產(chǎn)生一定的差異。對種子行業(yè)和市場而言，檢測種子批次間以及種子批次內(nèi)單個種子的特殊狀態(tài)并從整個種子批中分離出來是非常重要的［38］。但是，人工區(qū)分種子是非常繁瑣且耗時的過程，并且采用肉眼區(qū)分種子的方法更是難以令人滿意［39］。因此發(fā)展一種高通量、快速、無損、準確率高的多光譜檢測技術(shù)對種子行業(yè)來說是非常必要的。已知的研究顯示，包括多光譜在內(nèi)的多個無損檢測技術(shù)都具有很好的應用前景。近紅外光譜技術(shù)具有速度快、效率高的特點，且已經(jīng)應用在老化種子研究中［40-41］；但是這種方法沒有應用種子圖像分析技術(shù)，也未考慮空間信息，且靈敏度低，只能對種子的光譜特征進行單獨測量，遠沒有多光譜提供的信息多。此外，X-射線成像能夠探測種子內(nèi)部結(jié)構(gòu)，但設備成本高且具有輻射［42］；高光譜成像技術(shù)也可以實現(xiàn)形態(tài)信息和光譜信息的分析，但是存在一定的數(shù)據(jù)冗余和數(shù)據(jù)處理負擔［43-44］。因此，多光譜技術(shù)應用于種子行業(yè)是非常有前景的，特別是與其他的無損檢測技術(shù)結(jié)合起來，檢測的準確度和速率會大大提高。

4 結(jié)論

本研究通過多光譜成像分析，發(fā)現(xiàn)不同老化程度的苜蓿種子在形態(tài)特征和光譜特征中均存在人眼難以識別的差異，進而成功預測了不同老化程度的種子，也成功預測出種子是否發(fā)芽。特別是，SVM 和LDA 具有較高的老化種子分類和發(fā)芽預測準確度。此外，nCDA 可以將光譜圖像進行轉(zhuǎn)化，呈現(xiàn)種子轉(zhuǎn)化后的顏色，根據(jù)種子顏色和空間信息，可以識別老化和未老化的苜蓿種子。總而言之，本試驗結(jié)果證明，多光譜成像結(jié)合多元分析是一種高效的紫花苜蓿種子分選和無損檢測技術(shù)。