種子引發對甜高粱角質層蠟質及其抗性的影響

姚露花，綦才，楊建峰，郭彥軍

（1. 西南大學農學與生物科技學院，重慶 400716；2. 青島農業大學草業學院，山東 青島 266109；3. 西南大學動物科學技術學院，重慶 400716）

全球氣候變化引發的自然災害，如干旱、水澇、高溫、冷害等，嚴重影響著農業生產，全球受影響農田面積高達25%~38%［1］。高溫干旱易導致禾谷類作物如玉米（Zea mays）、小麥（Triticum aestivum）、水稻（Oryza sativa）等減產達28%~49%［2］。因此，如何提高大田作物的抗逆性已成為農業生產亟待解決的問題。目前，抗逆品種選育被認為是解決這一問題的關鍵［3-4］。然而，品種選育周期長，加上品種更新換代較為頻繁，依然無法從根本上解決非生物脅迫引發的生產損失。在生產中，主要通過施肥、灌溉、栽培措施等提高作物對自然災害的抵抗能力［5-7］。其中，種子引發是一種低成本、可高效提高種子發芽活力及幼苗抗性的方法，可改善植物在非生物脅迫下的生長發育［8］，在農業生產中使用較為廣泛。

聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）引發對作物種子發芽、育苗和產量均有積極影響［9］。PEG 引發因其分子量大不易浸入種子，不會對種子胚胎產生破壞性影響［9］。PEG 引發的高粱（Sorghum bicolor）幼苗表現出較少的脂質過氧化，改善了細胞膜穩定性［10］。激素引發如水楊酸（salicylic acid，SA）可促進干旱條件下水稻種子的離子吸收，從而增加發芽及幼苗生長，同時減少植物的蒸騰水分流失［11］。鹽脅迫下，脫落酸（abscisic acid，ABA）引發通過調節離子傳輸，減少蒸騰水分損失來促進大麥（Hordeum vulgare）葉片的生長［12］。吲哚-3-乙酸（indole-3-acetic acid，IAA）引發可調節小麥中的離子穩態和誘導葉片中的SA 生物合成來響應鹽脅迫［13］?？傊?，滲透引發與激素引發通過不同的作用機制影響種子吸脹過程，因此篩選合適的引發劑，對精準提高作物抗逆性具有重要意義。

角質層蠟質是由初級醇、醛類、脂肪酸和烷烴等化合物組成的有機混合物，覆蓋于植物表面形成抗逆屏障，可有效限制植物非氣孔水分散失［14］。研究發現，植物表皮蠟質的含量和化學組分會因植物種類、發育階段和器官部位變化而變化。比如，番茄（Lycopersicon esculentum）葉蠟的主要成分是烷烴和三萜類化合物［15］，小麥葉蠟主要成分是伯醇和烷烴［16］，高粱葉蠟的主要成分是烷烴和醛類化合物［17］。而蠟質的功能受其組分含量及種類的影響［18-19］。如C29烷與C31烷含量的增加更有利于防止植物過度失水［18］。植被富含C27~C33烷烴其保水能力較富含酮醛類物質更強［20］。擬南芥（Arabidopsis thaliana）突變體試驗發現C29烷烴大量缺失，植株失水率顯著增加且對干旱更加敏感［21-22］。葉綠素浸提試驗顯示蠟質組分中烷類物質含量的下降導致植物角質層滲透率上升約4 倍，其失水率明顯加快。角質層蠟含量的變化會改變角質層的滲透性，調節角質層蒸騰，提高作物耐旱性［23］。種子引發可影響植物體內代謝活動以響應環境脅迫［24］，而蠟質是植物脂質代謝的重要產物，可有效防止外界環境脅迫對植物生長的傷害［14］。因此，本研究認為引發可能通過改變角質層蠟質合成代謝以響應環境脅迫。

為了驗證這一假設，本研究選擇甜高粱（S. bicolor‘Dochna’）為試驗對象，通過設置滲透引發（H2O，PEG）和激素引發處理［SA，ABA，赤霉素（gibberellin，GA）］，研究引發是否通過改變角質層蠟質沉積，從而影響表皮滲透性、利于高粱生長。甜高粱是普通高粱的變種，一年生C4草本植物，具有光合效率高、可發酵糖量高、抗逆性強等特征［25-26］。因其生物產量高，富含多種營養成分，已經作為一種優質的飼用作物被廣泛推廣種植。然而，甜高粱抗逆性受其品種及推廣種植環境的影響存在很大差異［3，27］。目前，針對改變高粱角質層蠟質沉積來降低水分散失的研究僅限于高粱苗期［28］，對于大田條件下不同生長期的研究未見報道。因此，本研究主要探討：1）引發對高粱不同生長期蠟質含量及組分含量的影響；2）引發對高粱不同生育期葉片含水量及葉片水分損失率的影響；3）引發對高粱不同生長期葉綠素含量及葉綠素浸提率的影響；4）引發對角質層蠟質的影響是否存在跨年度效果。

1 材料與方法

1.1 試驗地點與材料

試驗地位于重慶北碚西南大學實驗農場（29°48′N，106°24′E），屬亞熱帶季風性濕潤氣候。該地區的平均溫度為17.8 ℃，過去30 年平均降水量為1100 mm。高粱生長試驗期（2020 和2021 年）的氣溫與降水情況如圖1所示。試驗地土壤為紫色壤土，是中國南方最重要的農業土壤類型之一。土壤pH 值（土壤∶水=1∶5）為7.8，養分含量如全氮、全磷、全鉀和總有機碳的含量分別為0.51 g·kg-1、0.38 g·kg-1、43.67 g·kg-1、21.13 g·kg-1；堿解氮、速效磷和速效鉀的含量分別為41.94 mg·kg-1、6.81 mg·kg-1和56.67 mg·kg-1。土壤理化性質的測定參考鮑士旦［29］的方法。

圖1 高粱種植期間重慶氣溫與降水情況Fig.1 Temperature and precipitation in Chongqing during planting stage of sorghum

試驗材料選擇甜高粱品種為品05206，由山西省農業科學院高粱研究所提供。挑選飽滿健康的種子約600粒，用3% H2O2消毒5 min 后，用蒸餾水沖洗以去除消毒劑，然后進行種子引發處理。種子引發處理包括水（H2O）引發、聚乙二醇（PEG）引發、水楊酸（SA）引發、脫落酸（ABA）引發和赤霉素（GA）引發。其中，水引發為去離子水引發；PEG 引發液的質量百分數為15%、SA 引發液濃度為150 mg·L-1，ABA 引發液濃度為20 mg·L-1、GA 引發液濃度為5 mg·L-1。每次選擇約200 粒大小一致的種子浸泡于100 mL 的各引發溶液中，20 ℃，黑暗條件下處理24 h［30］，之后在室溫下干燥至種子原始水分重量。同時用未引發種子作為對照（CK）。所有種子均儲存于4 ℃冰箱進行下一步試驗。

1.2 試驗設計

將未引發與引發種子于2020 年5 月在室溫條件下催芽12 h，播種于土壤，覆土3 cm。小區面積2 m×4 m，3次重復。株距30 cm，行距40 cm。試驗地播前進行常規處理，深翻（深度約25~30 cm）并施加600 kg·hm-2復合肥（N-P2O5-K2O 比例為15-15-15）。播種方式為人工播種，每穴播3~4 粒，3 葉期按設計株距定苗。高粱苗期進行正常澆水管理，拔節期進行中耕除雜防止高粱后期倒伏及雜草對高粱生長產生影響。于2020 年8 月收種后，種子存儲于4 ℃低溫冰箱，然后于2021 年5 月直接播種。播種方式與田間管理方式同2020 年。不同生育期（苗期、拔節期、抽穗期、成熟期）所有指標均在同一時間取同一位置的葉片測定。

1.3 指標測定

1.3.1蠟質提取 采集高粱同一部位展開葉片，室溫條件下加入含1 μg·μL-1內標（十六烷）的氯仿約3 mL，振蕩提取30 s，重復3 次。總提取液于40 ℃下氮氣吹干，加入吡啶與BSTFA［N，O-Bis（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺］衍生劑各20 μL，70 ℃反應45 min，之后用氮吹儀再次吹干。將提取物用0.5 mL 氯仿溶解進行氣相色譜和質譜分析［31］。葉片提蠟前，利用WinFOLIA 專業葉片圖像分析系統（regent instrument inc，加拿大）和數字化掃描儀（EPSON V750，日本）測定葉片面積［32］。

1.3.2氣相色譜、質譜分析（GC-MS） 蠟質含量分析采用福立9790Ⅱ系列氣相色譜儀（中國）。氣相色譜儀程序：GC 毛細管柱長30 m，直徑0.32 mm，液膜厚度0.25 μm；氮氣作為載氣；進樣量為2 μL。柱膜和FID 檢測器的溫度分別為300 和320 ℃。分流比為3∶1。程序升溫方式：初始溫度為80 ℃，以每分鐘15 ℃的速度升溫至260 ℃，并保持10 min，之后以每分鐘2 ℃升溫至290 ℃，保持1 min，再以每分鐘5 ℃的速度升溫至320 ℃，并保持10 min。用內標計算植物單位面積的蠟質含量，單位為μg·cm-2。利用氣相色譜—質譜聯用儀（GCMS-QP2010 Ultra，日本）鑒定蠟質組分，程序升溫方式同色譜分析。

1.3.3葉片相對含水量與角質層水分損失率測定 高粱葉片相對含水量（relative water content，RWC）根據Weatherley［33］的方法測定。即采集高粱不同生長期同一部位完全展開的葉片，并立即稱量鮮重（fresh weight，FW）。之后將葉片在蒸餾水中浸泡3 h，測定葉片飽和重量（saturated weight，SW），在70 ℃烘箱中干燥24 h 后，并稱干重（dry weight，DW）。相對含水量（RWC）計算公式為：RWC=(FW-DW)/(SW-DW)×100%。

角質層水分損失率根據Burkhardt 等［34］的方法測定。將植株放于黑暗條件下適應12 h 以確保氣孔關閉。采集葉片樣品浸入蒸餾水中1 h 并稱重。之后將葉片放入暗室進行連續脫水，每隔15 min 測定其重量，持續150 min，以記錄水分損失。最后，將葉片樣品在70 ℃下干燥24 h 并稱重。失水率計算公式如下：

1.3.4葉綠素含量與葉綠素浸提率測定 葉綠素含量使用SPAD 儀（SPAD 502 Plus，日本）測定，選擇不同高粱植株同一葉片同一位置重復測定4 次。葉綠素浸提參考陳紅妙等［35］方法測定。取高粱同一部位展開葉片，剪碎，片段長約3 cm，浸泡在30 mL 80%的乙醇中，黑暗條件下輕輕搖晃，分別于20、60、120、180 和240 min 取3 mL浸提液用于測定其在λ664和λ647波長下的吸收值（A664和A647），測定后浸提液均倒回至相應的樣品瓶中，每種處理均做3 個重復。

1.4 數據分析

所有數據均以指標平均值±標準誤表示。單因素方差分析用于比較處理間的蠟質含量、相對含水量、葉片失水率以及葉綠素浸提率指標（SPSS 17.0）。根據最小顯著性差異法（LSD）檢驗顯著性（P<0.05）。

2 結果與分析

2.1 種子引發對高粱葉角質層蠟質總量的影響

高粱從苗期到成熟期，引發處理植株葉片蠟質含量均呈增加趨勢（圖2）。2020 年，苗期H2O、PEG、SA、ABA與GA 引發處理的蠟質總量較對照分別增加了24.7%，57.6%，50.8%、80.3%和36.7%（圖2A）。除水引發外，其他處理均達到顯著水平。拔節期，PEG 引發處理的蠟質總量較對照增加了12.0%，而SA 與ABA 引發處理的蠟質總量較對照分別顯著下降了32.2%和25.8%（圖2B）。抽穗期，ABA 引發處理的蠟質總量較對照顯著增加了38.6%（圖2C）。成熟期，PEG、SA 與ABA 引發處理的蠟質總量較對照分別顯著增加了33.5%，26.3%和37.0%（圖2D）。2021 年，苗期PEG、SA、ABA 引發的蠟質總量仍顯著高于對照，與2020 年的各引發處理蠟質總量變化情況一致（圖2E）；拔節期H2O、PEG、SA 引發的蠟質總量顯著高于對照（圖2F）；抽穗期與成熟期各引發處理蠟質總量無顯著變化（圖2G，H）。因此，不同年份間，僅PEG 與ABA 引發對角質層蠟質含量的影響效果一致，影響效果最長且存在跨代效應。

圖2 種子引發對高粱葉片角質層蠟質總量的影響Fig.2 Effects of different seed priming on total contents of leaf wax

2.2 種子引發對高粱葉角質層蠟質組分的影響

2.2.1烷烴 除ABA 引發成熟期烷烴含量低于抽穗期外，其他引發處理烷烴含量均隨著生育期的推進一直增加（圖3）。種子引發對高粱葉片烷烴含量有顯著影響，但其效果在引發處理間存在差異（圖3）。具體為ABA引發可顯著增加苗期、抽穗期的烷烴總量，PEG 引發則顯著增加拔節期烷烴總量，SA 引發僅增加2020 年成熟期烷烴總量。此外，與對照相比，引發顯著影響C27~C35烷的相對豐度。苗期，除H2O 引發外，各引發處理均可增加C29與C33烷烴的相對豐度（圖4A）。抽穗期，ABA 引發顯著增加C27烷相對豐度（圖4C）；成熟期，PEG 引發顯著增加了C35烷相對豐度，ABA 引發顯著增加了C27烷相對豐度（圖4D）。進一步分析發現，PEG 引發較激素引發顯著增加了C31、C33與C35烷相對豐度（圖4D）。2021 年，PEG 引發顯著增加拔節期烷烴總量及C27烷相對豐度（圖3F 和圖4F），ABA 引發顯著增加抽穗期烷烴總量（圖3G）。因此，僅PEG 與ABA 引發對烷烴含量及碳鏈組分的影響存在跨代效應（圖3 和圖4）。

圖3 種子引發對高粱烷烴含量的影響Fig.3 Effects of different seed priming on total contents of alkanes

圖4 種子引發對高粱不同碳鏈烷烴相對豐度的影響Fig.4 Effects of different seed priming on the relative abundance of alkanes with different carbon chain of alkanes

2.2.2醇 2020 年從高粱苗期到成熟期，各引發處理醇含量呈增加趨勢，而2021 年成熟期醇含量則低于抽穗期含量（圖5）。同一生長期，種子引發對高粱葉片醇含量及C28醇相對豐度有顯著影響（圖5）。2020 年，PEG、SA與ABA 引發均可顯著增加成熟期醇含量，而對其他生長期醇含量的影響因引發處理不同而不同（圖5A~D）。此外從苗期到拔節期，除H2O 引發外，其他引發均可增加C28醇的相對豐度且拔節期達顯著水平（圖5I，J）。成熟期，PEG 引發顯著增加C32醇相對豐度，SA、ABA 與GA 較PEG 引發增加了C28醇相對豐度，其中SA 與GA 引發達顯著水平（圖5L）。2021 年，PEG 與ABA 引發仍顯著增加了苗期醇含量（圖5E），但對不同碳鏈醇相對豐度無顯著影響（圖5M~P）。

圖5 種子引發對高粱蠟質醇組分含量及其碳鏈分布的影響Fig.5 Effects of different seed priming on total contents of alcohols and carbon chain distribution

2.2.3醛 高粱從苗期到成熟期，葉片醛含量呈增加趨勢，PEG 引發與激素引發均顯著影響C28醛與C30醛的相對豐度（圖6）。同一生長期，種子引發對高粱葉片醛含量同樣存在顯著影響（圖6）。2020 年苗期，除水引發外，其余引發處理均顯著增加了醛含量（圖6A）。與對照相比，PEG 引發顯著增加了C30醛相對豐度（圖6I）。拔節期，激素引發顯著降低醛含量卻顯著增加了C28與C30醛相對豐度（圖6J）。抽穗期，引發對不同醛含量及其鏈長分布無顯著影響，除ABA 引發醛優勢鏈長從C28轉變為C30（圖6K）。成熟期，與對照相比，PEG 與ABA 引發顯著增加了醛總量（圖6D），PEG 引發還顯著增加了C28醛相對豐度（圖6L）。2021 年，引發對高粱葉片醛含量及醛鏈長分布無顯著影響。因此，引發對醛含量影響不存在跨代效應。

圖6 種子引發對高粱蠟質醛組分及其碳鏈分布的影響Fig.6 Effects of different seed priming on total contents of aldehydes and carbon chain distribution

2.2.4三萜類組分 高粱葉片三萜類組分主要包括香樹脂醇與羊毛甾醇（圖7）。2020 年，苗期僅ABA 引發顯著降低香樹脂醇含量（圖7A）；拔節期，僅PEG 引發顯著增加香樹脂醇含量（圖7B）；抽穗期，ABA 引發顯著增加香樹脂醇含量（圖7C）；成熟期，激素引發顯著降低香樹脂醇含量（圖7D）。2021 年，引發處理對香樹脂醇含量無顯著影響。2020 年，H2O 引發顯著增加了拔節期與抽穗期的羊毛甾醇含量（圖7J，K），SA 與ABA 引發顯著增加了成熟期羊毛甾醇含量（圖7L）。2021 年，引發處理對羊毛甾醇含量無顯著影響。綜上所述，與烷、醇、醛含量一致，從苗期到成熟期三萜類組分含量呈增加趨勢。

圖7 種子引發對高粱蠟質三萜類組分的影響Fig.7 Effects of different seed priming on total contents of triterpenoids

2.3 種子引發對葉片水分與葉綠素的影響

種子引發可增加高粱不同生長期的葉片含水量（圖8A）。不同生長期各引發處理失水率從高到低分別為：苗期，H2O>CK>PEG、SA、ABA、GA（圖8B）；拔節期，H2O>GA>CK>SA>PEG>ABA（圖8C）；抽穗期，SA>GA>CK、H2O、ABA>PEG（圖8D）；成熟期，GA>CK>H2O>SA、ABA>PEG（圖8E）?？傊吡好缙凇喂澠谂c成熟期除H2O 與GA 引發外，PEG、SA 與ABA 引發處理的失水率一直低于對照。

圖8 引發處理對葉片相對含水量及失水率的影響Fig.8 Effects on relative water content and water loss rate of seed priming

種子引發可顯著影響高粱不同生長期葉片的葉綠素含量（圖9A）。苗期到拔節期，PEG 與SA 可顯著增加葉綠素含量，ABA 僅顯著增加苗期葉綠素含量，而抽穗期與成熟期則顯著降低葉綠素含量（圖9A）。對葉綠素浸提率的分析發現，不同生長階段各引發處理浸提率從高到低分別為，苗期，CK>H2O>SA、GA>PEG、ABA（圖9B）；拔節期，CK>H2O>SA、GA、PEG、ABA（圖9C）；抽穗期，CK、PEG>GA、SA>H2O>ABA（圖9D）；成熟期，CK>H2O、GA>PEG>SA、ABA（圖9E）?？傊?，各引發處理均可降低葉綠素浸提率，特別是ABA 引發，說明引發處理可增加葉片細胞膜穩定性。

圖9 引發處理對高粱葉片葉綠素含量及葉綠素浸提率的影響Fig.9 Effects on chlorophyll content and extraction rate of seed priming

3 討論

3.1 種子引發改變高粱葉片蠟質及其組分含量

角質層蠟質是植物脂質代謝產物，覆蓋于植物表面抵御外界脅迫［14］。本研究中，種子引發顯著增加不同生長期高粱葉片蠟質總量，表明引發可在高粱角質層響應其生長期環境變化時發揮作用［17］。據報道，種子引發也可產生長期或跨代記憶以響應生長期間遭遇的環境脅迫，如鹽脅迫等［36-37］。因此，引發同樣可增加角質層蠟質含量以響應長時間干旱［36，38］。值得注意的是，種子引發對蠟質總量及組分含量存在年際效應，證明引發效應也可產生跨代“記憶”。但具體存在跨代效應的分子機理有待進一步研究。

研究表明，植物會改變蠟質組分以響應外界環境［39-40］。本研究中，種子引發可改變烷烴、醇及醛成分的總量及各組分不同碳鏈組分的相對豐度。這說明種子引發影響了蠟質基因的表達，從而影響蠟質沉積。如CER1是合成烷烴的關鍵基因［41］，脂肪酰輔酶A 還原酶（fatty acyl CoA reductase，FAR）是脂肪醇還原所需的重要酶［42］，種子引發后幼苗蠟質組分及相對豐度變化可能與這些基因的表達存在差異有關。同時發現，PEG、SA、ABA 對蠟質組分影響程度不一致，說明不同引發處理作用于不同蠟質合成過程，參與的調控途徑各不相同。如顯著提高烷烴或醛含量，表明引發主要作用于脫羰基途徑，醇含量的增加表明引發主要影響?；€原途徑［43］。本研究中，PEG 引發顯著增加C27烷烴與C28醛相對豐度，顯著降低C29烷與C28醇相對豐度，說明PEG 引發將更多長鏈脂肪酸前體從酰基還原途徑轉化為脫羰基途徑，相對促進了烷烴的生物合成［44］。另外，PEG 引發與激素引發作用機理也不同，PEG 引發主要影響細胞膜滲透水平，激素引發則對細胞的離子運輸發揮作用，這同樣可導致PEG 引發與ABA 引發對蠟質組分影響的不一致。總之，引發可能通過影響參與不同蠟質合成途徑的基因表達進而改變高粱蠟質及其組分含量。

3.2 種子引發改變蠟質含量及組分，提高角質層抗性

角質層蠟質組分的改變與其功能變化相關。蠟質及其組分含量增加的同時高粱葉片失水率下降，葉片含水量增加，說明蠟質可有效防止水分散失。研究表明，蠟質組分隨環境變化而變化［39，45］，其中烷烴是蠟質組分中保水最有效的部分［46］。這表明水分散失不僅受蠟質含量影響，也與其組分顯著相關。本研究中，種子引發特別是PEG、SA 與ABA 引發顯著增加了低極性組分如烷烴、醛的含量。同時，C27~C33烷與C28醛相對豐度的增加表明引發主要促進長鏈脂肪酸的伸長，以減少葉片水分損失。此外，角質層蠟質組分烷烴及醛含量的下降可顯著增加葉片葉綠素浸提率，使植物抗旱性降低［47］。本研究中，PEG、SA 與ABA 引發同樣增加了烷烴及醛含量，從而降低了高粱葉綠素浸提率。這表明引發顯著降低高粱葉片質膜透性，使角質層抗性增加及細胞膜受環境脅迫傷害程度降低［48］。進一步分析發現，引發處理后葉片相對含水量也顯著增加。而葉片水分含量與植物光合作用密切相關［46-47］，說明引發有利于高粱生物量的積累。與光合作用密切相關的葉綠素也受引發影響。引發處理可增加苗期與拔節期葉綠素含量，卻降低抽穗期與成熟期的葉綠素含量。綜上所述，PEG、SA 與ABA 引發可通過影響蠟質合成從而提高角質層的抗性。

激素引發顯著增加高粱葉片蠟質積累，這與施加外源激素對植物蠟質的影響作用一致［49］。PEG 引發與激素引發對蠟質總量與高粱抗性具有同樣的效果，可增加約50%的蠟質總量。這可能是由于PEG 引發對高粱產生滲透脅迫，打破植物體內激素平衡，進而誘導蠟質基因表達［45］。但其具體影響機制異同仍需進一步研究。

總之，種子引發可增加高粱不同生育期角質層蠟質及其優勢組分含量，增加葉片含水量，降低角質層失水率及葉綠素浸提率，從而增加各生長期抗性。更重要的是，種子引發具有跨代“記憶”，但其機制需進一步研究。